Name: Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per luso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Impara a isolare i leucociti dal latte materno umano per studiare la fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi contro HIV. Questo metodo consente di analizzare la capacità fagocitaria delle cellule immunitarie.

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Ringraziamo la Dott.ssa Susan e il Dipartimento di Microbiologia della Icahn School of Medicine del Monte Sinai per la revisione del manoscritto. Il NIH/NICHD ha fornito finanziamenti per questo progetto con il numero di sovvenzione R21 HD095772-01A1. Inoltre, R. Powell è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Medicina, Divisione delle Malattie Infettive, Icahn School of Medicine del Monte Sinai.

Ogni partecipante a questo studio è stato assunto e intervistato in accordo con l'approvazione dell'ente di revisione etico e istituzionale (IRB) con la guida e l'autorizzazione del Programma del Monte Sinai per la protezione dei soggetti umani (PPHS) utilizzando un per ottenere campioni di latte materno.
1. Preparazione della microsfera target
<ol><li>Selezionare un antigene bersaglio pertinente. NOTA: In questo esempio è stata utilizzata la proteina ricombinante V1V2-2F5K, progettata per imitare l'apice trimerico della busta HIV nativa30.</li>
	<li>Eseguire la biotinylation utilizzando un kit commerciale (Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore.<ol>
<li>Calcolare il mmol del reagente di biotina da aggiungere alla reazione per un eccesso molare di 5 volte utilizzando la formula: biotina mmol x proteina mL x (proteina mg/mL) x (proteina biotina mmol/mg) x (5 proteina biotina/mmolmmo)30,31. Quindi calcolare l'unità di reagente di biotina da aggiungere utilizzando la formula: biotina e biotina mmol x (1.000.000 x L/L) x (L/10 mmol).</li>
		<li>Biotina equilibrate a temperatura ambiente prima dell'apertura. Sciogliere le proteine in 0,5 mL di salina con buffer fosfato (PBS) secondo il calcolo sopra fatto.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 10 mM di reagente di biotina in dimetilfossido di dimetilzolaro (DMSO) e aggiungere il volume appropriato di 10 mM reagente di biotina alla soluzione proteica, e incubare la reazione sul ghiaccio per 2 h o a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la biotina in eccesso utilizzando concentratori proteici (poliethersulfone [PES] membrane, 3 kDa taglio del peso molecolare [MWCO], 0,5 mL; Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Depositare il campione nella camera superiore della colonna di spin e aggiungere PBS fino a 400 . Centrifuga a 12.000 x g a temperatura ambiente per 30 min.</li>
		<li>Scartare il flow-through e aggiungere PBS a 400 .L. Ripeti centrizione. Scartare il flow-through e aggiungere PBS a 100 .L. Misurare la concentrazione di proteine da uno spettrometro. NOTA: Le proteine possono essere congelate e congelate a -80 gradi centigradi fino all'uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione della piastra di analisi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP)
<ol><li>Proteine biohoonilate coniugate a 1 semisfera ('perle'; Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Per piastra di perline coniugate, incubare 6 g di proteine con 12 litri di perline di stock in 200 -L di 0,1% di albumina di siero bovino (BSA)-PBS a temperatura ambiente per 1 h, vortice dolcemente ogni 20 min.</li>
		<li>Centrifuga a 13.000 x g per 5 min. Scartare supernatante, vorticare delicatamente e risospendere in 1200 - L di 0,1% BSA-PBS. Ripetere la rotazione e lavare il passaggio 2x. Risospendere in 1200 - L dello 0,1% BSA-PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquota 10 l di soluzione di perline per bene in una piastra rotonda inferiore 96-bene. Preparare le diluizioni di anticorpi o di infiammazione immunitaria in una diminuzione del 2% del 2% di HSA HBSS, in genere a partire da 50 g/mL di anticorpo o una diluizione di 1/100 di siero. NOTA: nei dati di esempio è stato utilizzato l'anticorpo monoclonale (mAb) 830A.</li>
	<li>Aggiungere 10 l di anticorpi/sera titolati alla piastra di perline e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi. Aggiungere 200 L del 2% HSA HBSS ad ogni pozzo e centrifugare piastra a 2.000 x g per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il supernatante con un rapido ribaltamento e decantazione del liquido dai pozzetti della piastra in un lavandino per evitare di disturbare il pellet di perline invisibile.</li>
</ol>3. Isolamento delle cellule del latte materno
<ol><li>Ottenere latte materno umano da donne in lattazione sane, espresso utilizzando doppie pompe elettroniche o manuali. Isolare le cellule entro 4 h di espressione, mantenendo il latte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzando tubi da 50 mL, centrificare 50 mL di latte a 800 x g per 15 min. versare con attenzione il latte scremato e il grasso lasciando il pellet cellulare indisturbato. Pulire l'interno del tubo con una salvietta senza laminetta per rimuovere tutto il grasso dalla parete del tubo.</li>
	<li>Aggiungi 10 mL di albume di siero umano del 2% nella soluzione di sale equilibrato di Hank (2% HSA HBSS [senza Ca2 o Mg]). Risospendere il pellet con un leggero pipettaggio per evitare l'attivazione delle cellule e l'apoptosi. Trasferire in un tubo da 15 mL e centrifugare a 450 x g per 10 min.</li>
	<li>Versare il supernatante e ripetere il passaggio 1.3. Quindi, risospendere delicatamente le celle in 1-2 mL del 2% HSA HBSS a seconda del numero di cellulare previsto e contare le celle con un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato, notando anche la fattibilità cellulare.</li>
</ol>4. Assay ADCP
NOTA: i metodi descritti di seguito sono adattati da Ackerman et al.32.
<ol><li>Aggiungere 50.000 celle BM appena isolate a ciascun aumento di aspetto ADCP ben in 200 -L di 2% HSA-HBSS. Incubare per 2 h a 37 .<ol>
<li>Per gli esperimenti di controllo, le cellule pre-incubate a 37 s con 10 g/mL di actinio (cytochalasin-D), 50 agenti di blocco FCR (FcBlock) o una combinazione di entrambi prima della loro aggiunta alle piastre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Piastra di centrifuga a 930 x g per 10 min. Rimuovere con cautela il supernatante come nel passaggio 2.7 e ripetere il lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione le celle sovrnatali e macchiate per la redditività utilizzando 0,5 g/mL (concentrazione finale) macchia di vitalità fissabile 450 per pozzo in 50 : L del 2% HSA HBSS. Incubare 20 min a temperatura ambiente al buio. Centrifuga a 930 x g per 10 min e rimuovere supernatante come nel passo 2.7. Aggiungere di nuovo 200 L del 2% HSA HBSS e centrifugare, seguita dalla rimozione del super-natante come nel punto 2.7.</li>
	<li>Dopo la colorazione della vitalità, le celle di colorazione per i marcatori di leucocito di interesse, minimamente includendo una macchia specifica del CD45 come il CD45 anti-umano del topo PE (clone HI30) ad una concentrazione ottimizzata (1g/LL in 50 - L di 1% BSA HBSS nei dati di esempio). NOTA: è possibile includere eventuali indicatori di interesse specifici del lignaggio.</li>
	<li>Incubare 20 min a temperatura ambiente al buio. Centrifuga a 930 x g per 10 min e rimuovere supernatante come nel passo 2.7. Aggiungere 200 -L dell'1% di BSA HBSS e ripetere la centrifugazione. Rimuovere supernatante. Fissare le cellule in 200 - L di 0,5% formaldeide al buio a temperatura ambiente per 30 min o durante la notte a 4 gradi centigradi. Conservare in frigorifero al buio fino all'analisi.</li>
</ol>5. Analisi per citometria di flusso
<ol><li>Eseguire il gating iniziale per eliminare i doppietti su un grafico a dispersione in avanti (FSC) e in un grafico a dispersione laterale (SSC) e detriti (materiale più piccolo di FSC - 5000) (vedere la figura 1). Utilizzare un grafico SSC vs viability (V450 in questo caso) per eliminare le cellule morte (quelle positive per la colorazione di vitalità).</li>
	<li>Utilizzare un grafico SSC vs CD45 per differenziare le principali classi di leucociti (granulociti, monociti, linfociti) come ampiamente descritto33,34. NOTA: questa classificazione è solo suggestiva e sono necessari marcatori specifici per il lignaggio per confermare il tipo di cella.</li>
	<li>Per tutte le cellule CD45, o per ogni sottoinsieme di interesse leucocito, misurare l'attività ADCP gating con un marcatore sulle cellule di perline-positive in un istogramma del canale isotoniocianato (FITC) fluorescenano, dove vengono rilevate le perline fluorescenti. NOTA: I pozzi di controllo negativo in cui non sono state aggiunte perline indiche indiche indiche indicheranno dove le cellule sono evidenti nel tallone e quindi dove posizionare il marcatore di gating.</li>
	<li>Calcolare i punteggi ADCP come (intensità di fluorescenza mediana [MFI] di cellule perline positive) x (% del CD45 totale - cellule nella popolazione positiva). Utilizzare il software grafico per tracciare i punteggi ad ogni concentrazione ab/siero ed eseguire un'analisi dell'area sotto la curva (AUC). NOTA: ADCP è considerato positivo se l'AUC è maggiore di 3 volte deviazione standard del punteggio ADCP AUC di un mAb di controllo negativo non specifico (in questo caso, 3865).</li>
</ol>

<ol><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+human+milk%3A+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Lactation%22%5BJournal%5D)">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li>
<li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li>
<li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li>
<li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+%287-20+months%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li>
<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li>
<li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica%22%5BJournal%5D)">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li>
<li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li>
<li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring%3A+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li>
<li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li>
<li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding%3A+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer%27s+Patches+of+the+Nursed+Infant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762(2016).</li>
<li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29(2011).</li>
<li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li>
<li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries%3A+a+pooled+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding%3A+The+Duration+of+Breastfeeding%2C+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).</li>
<li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li>
<li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission%3A+past+successes%2C+current+progress+and+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li>
<li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150(2015).</li>
<li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li>
<li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143(2012).</li>
<li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+%28ADCC%29+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li>
<li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li>
<li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAckerman%2C+M+%22Antibody+Fc%22">Antibody Fc</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).</li>
<li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li>
<li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li>
<li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li>
<li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li>
<li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li>
<li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+next-generation+cleaved%2C+soluble+HIV-1+Env+trimer%2C+BG505+SOSIP.664+gp140%2C+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618(2013).</li>
<li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li>
<li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).</li>
<li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum%3A+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li>
<li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La tecnica a flusso di citometria per misurare l'attività ADCP descritta qui è stata descritta per la prima volta nel 201130 e da allora è stata dimostrata robusta e citata in più di 80 studi. Il protocollo qui descritto adatta questa tecnica per l'uso con le cellule BM primarie per la prima volta. Precedenti studi sulla funzionalità mediata da Fc da cellule BM sono stati in gran parte limitati alla misurazione di esplosioni ossidative o analisi di fagocitosi a base di estasi utilizzando cellule i...

Il latte materno umano (BM) è costituito da cellule materne che sono >90% vitali1. La composizione cellulare è fortemente influenzata dallo stadio di allattamento, dallo stato di salute della madre e del bambino e dalla variazione individuale, che rimane poco compresa1,2,3,4. Dato che la BM contiene 103x 105 leucociti/mL, si può stimare che i neonati allattati al seno ingeriscano 105x 108 leucociti materni al giorno5. Vari studi in vivo hanno dimostrato che i leucociti materni forniscono immunità critica al bambino e sono funzionali ben oltre questi siti di ingestione iniziale5,6,7,8 ,9,10,11. Tutte le cellule di derivazione materna ingerite dal neonato hanno il potenziale per svolgere funzioni immunitarie a fianco o per compensare i leucociti del bambino12.
La trasmissione madre-bambino (MTCT) del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) rimane una crisi nei paesi con risorse limitate. Poiché le malattie diarrea e respiratorie sono responsabili di notevoli tassi di mortalità tra i neonati nei paesi con risorse limitate, e queste malattie sono significativamente ridotte dall'allattamento esclusivo al seno, i benefici per le madri infette da HIV l'allattamento al seno superano di gran lunga i rischi13,14,15. A meno che l'accesso all'acqua pulita e la formula per neonati appropriata non siano affidabili, l'OMS non raccomanda la cessazione dell'allattamento al seno per le madri infette da HIV16. Circa 100.000 MTCT tramite BM si verificano ogni anno; tuttavia, solo il 15% dei neonati allattati al seno dalle loro madri infette da HIV si infettano, suggerendo un forte effetto protettivo di BM17,18,19,20,21. Numerosi fattori probabilmente funzionano in tandem per impedire la trasmissione. È importante sottolineare che gli anticorpi specifici per l'HIV (Abs) in BM sono stati correlati alla riduzione dell'MTCT e/o alla riduzione della morte infantile per infezione da HIV22,23. Ciò che rimane in gran parte poco chiaro è il contributo della frazione cellulare di BM alle sue qualità antivirali.
Molti Abs facilitano una varietà di attività anti-virali mediate dalla regione "costante" della molecola di immunoglobulina, il frammento cristallizzabile (Fc), attraverso l'interazione con i recettori Fc (FcR) che si trovano praticamente su tutte le cellule immunitarie innate, praticamente tutte si trovano nell'uomo BM24. La fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP) è stata dimostrata come necessaria per lo sgombero delle infezioni virali ed è stata poco studiata nel caso della prevenzione dell'MTCT dell'HIV25,26,27, 28 mi la più del 24 , 29.Data la scarsità di conoscenze sul potenziale contributo dell'attività ADCP da parte dei fagociti BM alla prevenzione della MTCT dell'HIV, abbiamo mirato a sviluppare un metodo rigoroso per isolare le cellule dalla BM umana al fine di intraprendere uno studio di ADCP mediato da cellule da BM ottenuto in varie fasi di allattamento.

<table><tbody><tr><td>1 &micro; m FluoSpheres Microsfere marcate con NeutrAvidin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8776</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE Topo Anti-Umano CD45</td><td>BD</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>MP Biomedicals</td><td>8810025</td><td></td></tr><tr><td>Corning V-bottom polistirene piastra a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Kit EZ-Link NHS-LC-LC-Biotina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Provette da centrifuga coniche</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352196</tr><tr><td>Falcon 50 mL Provette da centrifuga coniche</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Macchia di vitalità fissabile 450&nbsp;</td><td>BD</td><td>562247</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma</td><td>252549&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HBSS senza calcio, magnesio o fenolo rosso</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Blocco BD Fc umano</td><td>BD</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana</td><td>MP Biomedicals</td><td>2191349</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes Tergicristalli per compiti delicati</td><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene 10 mL Pipette sierologiche&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Concentratori di proteine PES, 3K MWCO, 0,5 mL</td><td>Pierce</td><td>88512</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli hiv

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Anche in assenza di farmaci antiretrovirali, solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta, suggerendo un forte effetto protettivo del latte materno (BM). A meno che l'accesso all'acqua pulita e la formula per neonati appropriata non siano affidabili, l'OMS non raccomanda la cessazione dell'allattamento al seno per le madri infette dall'HIV. Numerosi fattori probabilmente funzionano in tandem per ridurre la trasmissione di BM. I neonati allattati al seno ingeriscono al giorno 105x 108 leucociti materni, anche se ciò che rimane ampiamente poco chiaro è il contributo di queste cellule alle qualità antivirali della BM. la fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP), una delle risposte immunitarie innatee più essenziali e pervasive, da parte dei fagociti BM contro i bersagli HIV. Le cellule sono state isolate da 5 campioni di BM umani ottenuti in varie fasi dell'allattamento. L'isolamento è stato effettuato attraverso una delicata centrifugazione seguita da un'attenta rimozione del grasso di latte e il lavaggio ripetuto del pellet cellulare. Le perle fluorescenti rivestite con inviluppo HIV (Env) epitopo sono state utilizzate come obiettivi per l'analisi di ADCP. Le cellule sono state macchiate con il marcatore di superficie CD45 per identificare i leucociti. È stato scoperto che l'attività ADCP era significativa sopra gli esperimenti di controllo e riproducibilmente misurabile utilizzando un anticorpo specifico dell'HIV 830A.

Il latte può essere mantenuto a temperatura ambiente o più fresco (anche se non congelato); tuttavia, dato che abbiamo osservato una minore vitalità quando il latte è stato mantenuto molto freddo (dati non mostrati), e che è più semplice raccogliere, conservare brevemente e trasportare a temperature ambiente, si raccomanda che i campioni non siano refrigerati al fine di ridurre variabilità da campione a campione. Nel latte ottenuto 7-183 giorni dopo il parto, la concentrazione cellulare d...

Il latte materno trasmette il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), anche se solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta. I neonati allattati al seno ingeriscono 105x 108 leucociti materni al giorno, anche se queste cellule sono poco studiate. Qui descriviamo l'isolamento del latte materno leucociti e un'analisi della loro capacità fagocitica.

Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Abbiamo sviluppato un metodo rigoroso per isolare le cellule dal latte materno umano per studiare la fagocitosi cellulare dipendente dagli anticorpi, o ADCP, dai fagociti del latte materno contro i bersagli dell'HIV. Questa tecnica facilita l'isolamento relativamente rapido e facile delle cellule del latte materno per valutare la capacità delle popolazioni di leucociti di eseguire l'ADCP. A dimostrare la procedura sarà Alisa Fox, una tecnico del mio laboratorio.Dopo aver selezionato un antigene target pertinente, utilizzare un kit commerciale per biotinilato la proteina di interesse secondo il protocollo del produttore. E depositare il campione biotinilato nella camera superiore di una colonna di spin. Aggiungere PBS fino a 400 microlitri e cappuccio la camera prima di inserire la colonna in un tubo di raccolta per la centrifugazione.Dopo aver scartato il flusso, aggiungere PBS a 400 microlitri per una seconda centrifugazione. Scartare il flusso attraverso, aggiungere PBS a 400 microlitri e misurare la concentrazione proteica con uno spettrofotometro per coniugare la proteina biotinilata alle microsfere micrometriche. Incubare sei microgrammi di proteine con 12 microlitri di perline in 200 microlitri di PBS per piastra di perline coniugate a temperatura ambiente per due ore, con vortici delicati ogni 20 minuti.Alla fine dell'incubazione, pellettare le perline coniugate dalla proteina per centrifugazione e scartare il supernatante. Dopo un delicato vortice, rimospendare la proteina in 1200 microlitri dello 0,1%BSA in PBS e lavare il tubo per centrifugazione altre due volte come appena dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, rimorsi il pellet in 1200 microlitri in PBS più BSA.Per impostare le piastre di dosaggio ADCP, preparare prima 12 diluizioni di microliter di anticorpo, o siero immunitario di interesse, nel 2%BSA in PBS in una piastra rotonda inferiore di 96 pozzetti. Aggiungere 10 microlitri di perline coniugate proteiche per pozzo alla piastra per un'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 200 microlitri di PBS più BSA.Dopo aver ottenuto latte materno umano da donne in allattamento sane che esprimono utilizzando una pompa, entro quattro ore dall'espressione separare il contenuto di latte per centrifugazione e versare con cura il latte scremato e il grasso, lasciando il pellet cellulare indisturbato. Pulire l'interno del tubo con una salvietta priva di pelucchi per rimuovere tutto il grasso dalla parete del tubo e aggiungere 10 millilitri di PBS più HSA. Rimescolare il pellet con pipettazione delicata per evitare l'attivazione cellulare nell'apoptosi e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione.Dopo un secondo lavaggio in PBS più HSA come appena dimostrato, rimorsi delicatamente le cellule in uno o due millilitri di PBS fresco più HSA per il conteggio. Per un saggio ADCP, invertire rapidamente la piastra ADCP preparata per decantare il supernatante dopo la centrifugazione finale e aggiungere cinque volte 10 a una quarta cellule di latte materno appena isolate in 200 microlitri di PBS più BSA per un'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule e lavare il pellet due volte in 200 microlitri di PBS fresco come dimostrato.Dopo l'ultimo lavaggio, macchiare le cellule con 0,5 microgrammi per millilitro di vitalità fissabile macchiare 450 per pozzo in 50 microlitri di PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule per due lavaggi in PBS fresco come dimostrato e macchiare le cellule per i marcatori di leucociti di interesse per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione, raccogliere la centrifugazione delle cellule e lavare le cellule due volte in 200 microlitri di 1%BSA più PBS per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, fissare i pellet in 200 microlitri dello 0,5% di formaldeide per pozzo per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Per l'analisi citometrica del flusso dei campioni di cellule, impostare un citometro di flusso dotato di un lettore di piastre ad alta produttività per prelevare 175 microlitri di campione e raccogliere 5000 cellule per pozzo. Eseguire la gating iniziale per eliminare doppietti e detriti su un grafico a dispersione in avanti rispetto a quello a dispersione laterale.Utilizzare un grafico a dispersione laterale rispetto alla macchia di vitalità per eliminare le cellule morte. E usa un grafico a dispersione laterale rispetto al CD45 per differenziare le principali classi di leucociti. Per tutte le cellule positive cd45, o per ogni sottoinsieme di leucociti di interesse, misurare l'attività della fagocitosi cellulare dipendente dall'anticorpo sgando con un marcatore sulle cellule positive del tallone in un istogramma del canale del fluoroforo appropriato per le perline coniugate.Quindi calcolare i punteggi di fagocitosi cellulare dipendente dall'anticorpo come mediana dell'intensità di fluorescenza delle cellule positive del tallone della percentuale del CD45 totale più le cellule nella popolazione positiva. Qui viene mostrata la strategia di gating per eliminare doppietti, detriti e cellule morte. Tra l'uno e il 12% delle cellule vive totali sono tipicamente leucociti positivi cd45 con la maggior parte dei presunti monociti bassi CD45 da basso a intermedio CD45 che sembrano essere precursori, o a cellule immature, basate sulla dispersione laterale rispetto alla gating CD45.I presunti granulociti sono definiti come celle intermedie CD45 ad alta dispersione laterale. La misurazione dell'attività ADCP delle cellule del latte materno appena isolate utilizzando un anticorpo monoclonale umano specifico per l'HIV a un mese dopopartum rivela che il trattamento con inibitore dell'actina Citochalasin D e o recettore Fc che blocca gli anticorpi prima dell'incubazione con perline accoppiate con antigene legato agli anticorpi provoca l'attività ADCP a o al di sotto di quella osservata in presenza di anticorpi di controllo. Il punteggio ADCP determinato per le cellule positive totali cd45 è comunemente compreso tra 25 e 35 volte sopra i livelli di fondo, definito utilizzando un controllo negativo, anticorpo monoclonale anti-antrace.Ogni campione di latte materno è unico e alcuni pellet possono essere difficili da vedere. Inoltre, le popolazioni di leucociti, e quindi i punteggi ADCP, possono variare immensamente da un campione all'altro.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule B dal sangue periferico umano utilizzando anticorpi biotinilati specifici per le cellule non B e microsfere magnetiche coniugate con streptavidina.

Isolamento e purificazione di cellule B da sangue periferico umano

Questo video mostra un test per misurare la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP) da parte dei fagociti del latte materno. Microsfere marcate in fluorescenza, coniugate a un complesso antigene-anticorpo, sono combinate con una sospensione cellulare isolata dal latte materno per indurre la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente da parte dei leucociti fagociti. Dopo aver marcato le cellule con anticorpi contro l'antigene leucocitario comune (CD45), la citometria a flusso viene...

Un test in vitro per misurare la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente da parte dei fagociti

Qui si descrive un protocollo per isolare sottoinsiemi di precursore cellule B dal sangue del cordone ombelicale. Una sufficiente quantità e qualità di acidi nucleici può essere estratto dalle cellule e utilizzati in saggi successivi utilizzando DNA o RNA.

Isolamento di precursori delle cellule B di sottoinsiemi di sangue del cordone ombelicale

Qui descritto è un protocollo per isolare e studiare ulteriormente i leucociti infiltranti della decidua basalis e della decidua parietalis - l'interfaccia materno-fetale umana. Questo protocollo mantiene l'integrità dei marcatori della superficie cellulare e produce un numero sufficiente di cellule vitali per le applicazioni a valle, come dimostrato dall'analisi della citometria a flusso.

L&#39;isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Vengono descritte le tecniche che descrivono una procedura a gradiente per separare gli esosomi dalle particelle del virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Questa procedura è stata utilizzata per isolare gli esosomi dalle particelle di HIV nel plasma umano da individui infetti da HIV. Gli esosomi isolati sono stati analizzati per il contenuto di citochine/chemochine.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Descriviamo un metodo per misurare la velocità dei fagosomi che si muovono verso il centro cellulare in cellule viventi infettate con o senza il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) di tipo 1, utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale a disco rotante per identificare le cellule infette fluorescenti e la microscopia a campo chiaro per rilevare i fagosomi.

Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

Il sangue periferico umano è comunemente usato per la valutazione della risposta immunitaria umorale. Qui vengono descritti i metodi per isolare le cellule B umane dal sangue periferico, differenziare le cellule B umane in cellule B secernenti anticorpi (ASC) in coltura ed enumerare le IgM- e IgG-ASC totali tramite un test ELISpot.

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

Descriviamo un metodo per la lavorazione del fluido di lavaggio bronchoalveolar e corrisponde al sangue periferico di individui cronicamente affetti da HIV sulla terapia antiretrovirale per valutare i serbatoi polmonari di HIV. Questi metodi portano all'acquisizione di cellule T CD4 altamente pure e macrofagi alveolar che possono successivamente essere utilizzati per immunofenofizzazione e quantificazioni HIV DNA/RNA mediante reazione a catena di polimerasi ultrasensibili.

Trattamento del bronchoalveolar Lavage Fluid e del sangue abbinato per il macrofago alveoere e CD4- Immunofenotyping a cellule T e valutazione del serbatoio dell'HIV

Presentato qui è un protocollo ottimizzato per isolare, coltivare, tradurre e differenziare i monociti primari umani da individui infettati dall'HIV e dai controlli sani.

Isolamento, trasfezione e cultura dei monociti umani primari

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo compatibile con l'automazione ad alto rendimento per isolare cellule mononucleate del sangue periferico umano per la biobanca e altri scopi.

Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano da Buffy Coats tramite separazione di microsfere immunomagnetiche ad alto rendimento

Questo protocollo è progettato per accelerare e consentire l'isolamento efficace delle vescicole extracellulari dal latte materno umano con elevata purezza.

Isolamento rapido di vescicole extracellulari derivate dal latte materno umano

Impara a isolare i leucociti dal latte materno umano per studiare la fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi contro HIV. Questo metodo consente di analizzare la capacità fagocitaria delle cellule immunitarie.

Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per luso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV (Video) | JoVE Journal

Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV

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