Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV

Il latte materno trasmette il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), anche se solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta. I neonati allattati al seno ingeriscono 10⁵x 10⁸ leucociti materni al giorno, anche se queste cellule sono poco studiate. Qui descriviamo l'isolamento del latte materno leucociti e un'analisi della loro capacità fagocitica.

Abbiamo sviluppato un metodo rigoroso per isolare le cellule dal latte materno umano per studiare la fagocitosi cellulare dipendente dagli anticorpi, o ADCP, dai fagociti del latte materno contro i bersagli dell'HIV. Questa tecnica facilita l'isolamento relativamente rapido e facile delle cellule del latte materno per valutare la capacità delle popolazioni di leucociti di eseguire l'ADCP. A dimostrare la procedura sarà Alisa Fox, una tecnico del mio laboratorio.

Dopo aver selezionato un antigene target pertinente, utilizzare un kit commerciale per biotinilato la proteina di interesse secondo il protocollo del produttore. E depositare il campione biotinilato nella camera superiore di una colonna di spin. Aggiungere PBS fino a 400 microlitri e cappuccio la camera prima di inserire la colonna in un tubo di raccolta per la centrifugazione.

Dopo aver scartato il flusso, aggiungere PBS a 400 microlitri per una seconda centrifugazione. Scartare il flusso attraverso, aggiungere PBS a 400 microlitri e misurare la concentrazione proteica con uno spettrofotometro per coniugare la proteina biotinilata alle microsfere micrometriche. Incubare sei microgrammi di proteine con 12 microlitri di perline in 200 microlitri di PBS per piastra di perline coniugate a temperatura ambiente per due ore, con vortici delicati ogni 20 minuti.

Alla fine dell'incubazione, pellettare le perline coniugate dalla proteina per centrifugazione e scartare il supernatante. Dopo un delicato vortice, rimospendare la proteina in 1200 microlitri dello 0,1%BSA in PBS e lavare il tubo per centrifugazione altre due volte come appena dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, rimorsi il pellet in 1200 microlitri in PBS più BSA.

Per impostare le piastre di dosaggio ADCP, preparare prima 12 diluizioni di microliter di anticorpo, o siero immunitario di interesse, nel 2%BSA in PBS in una piastra rotonda inferiore di 96 pozzetti. Aggiungere 10 microlitri di perline coniugate proteiche per pozzo alla piastra per un'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 200 microlitri di PBS più BSA.

Dopo aver ottenuto latte materno umano da donne in allattamento sane che esprimono utilizzando una pompa, entro quattro ore dall'espressione separare il contenuto di latte per centrifugazione e versare con cura il latte scremato e il grasso, lasciando il pellet cellulare indisturbato. Pulire l'interno del tubo con una salvietta priva di pelucchi per rimuovere tutto il grasso dalla parete del tubo e aggiungere 10 millilitri di PBS più HSA. Rimescolare il pellet con pipettazione delicata per evitare l'attivazione cellulare nell'apoptosi e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione.

Dopo un secondo lavaggio in PBS più HSA come appena dimostrato, rimorsi delicatamente le cellule in uno o due millilitri di PBS fresco più HSA per il conteggio. Per un saggio ADCP, invertire rapidamente la piastra ADCP preparata per decantare il supernatante dopo la centrifugazione finale e aggiungere cinque volte 10 a una quarta cellule di latte materno appena isolate in 200 microlitri di PBS più BSA per un'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule e lavare il pellet due volte in 200 microlitri di PBS fresco come dimostrato.

Dopo l'ultimo lavaggio, macchiare le cellule con 0,5 microgrammi per millilitro di vitalità fissabile macchiare 450 per pozzo in 50 microlitri di PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule per due lavaggi in PBS fresco come dimostrato e macchiare le cellule per i marcatori di leucociti di interesse per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione, raccogliere la centrifugazione delle cellule e lavare le cellule due volte in 200 microlitri di 1%BSA più PBS per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, fissare i pellet in 200 microlitri dello 0,5% di formaldeide per pozzo per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Per l'analisi citometrica del flusso dei campioni di cellule, impostare un citometro di flusso dotato di un lettore di piastre ad alta produttività per prelevare 175 microlitri di campione e raccogliere 5000 cellule per pozzo. Eseguire la gating iniziale per eliminare doppietti e detriti su un grafico a dispersione in avanti rispetto a quello a dispersione laterale.

Utilizzare un grafico a dispersione laterale rispetto alla macchia di vitalità per eliminare le cellule morte. E usa un grafico a dispersione laterale rispetto al CD45 per differenziare le principali classi di leucociti. Per tutte le cellule positive cd45, o per ogni sottoinsieme di leucociti di interesse, misurare l'attività della fagocitosi cellulare dipendente dall'anticorpo sgando con un marcatore sulle cellule positive del tallone in un istogramma del canale del fluoroforo appropriato per le perline coniugate.

Quindi calcolare i punteggi di fagocitosi cellulare dipendente dall'anticorpo come mediana dell'intensità di fluorescenza delle cellule positive del tallone della percentuale del CD45 totale più le cellule nella popolazione positiva. Qui viene mostrata la strategia di gating per eliminare doppietti, detriti e cellule morte. Tra l'uno e il 12% delle cellule vive totali sono tipicamente leucociti positivi cd45 con la maggior parte dei presunti monociti bassi CD45 da basso a intermedio CD45 che sembrano essere precursori, o a cellule immature, basate sulla dispersione laterale rispetto alla gating CD45.

I presunti granulociti sono definiti come celle intermedie CD45 ad alta dispersione laterale. La misurazione dell'attività ADCP delle cellule del latte materno appena isolate utilizzando un anticorpo monoclonale umano specifico per l'HIV a un mese dopopartum rivela che il trattamento con inibitore dell'actina Citochalasin D e o recettore Fc che blocca gli anticorpi prima dell'incubazione con perline accoppiate con antigene legato agli anticorpi provoca l'attività ADCP a o al di sotto di quella osservata in presenza di anticorpi di controllo. Il punteggio ADCP determinato per le cellule positive totali cd45 è comunemente compreso tra 25 e 35 volte sopra i livelli di fondo, definito utilizzando un controllo negativo, anticorpo monoclonale anti-antrace.

Ogni campione di latte materno è unico e alcuni pellet possono essere difficili da vedere. Inoltre, le popolazioni di leucociti, e quindi i punteggi ADCP, possono variare immensamente da un campione all'altro.