Name: Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso linnesto embrionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Scopri come generare arti aploidi mutagenizzati nell'axolotl per screening genetico. Questa tecnica di innesto embrionale consente di studiare la rigenerazione e salvare fenotipi letali in anfibi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare Katherine Roberts per la sua cura della colonia axolotl. I finanziamenti per questo lavoro sono stati erogati dal Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 e 15-RMB-YALE-01) e dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Fellowship F32HD086942).

Le procedure sperimentali utilizzate in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yale (IACUC, 2017–10557) ed erano conformi a tutte le politiche e linee guida federali che disciplinano l'uso degli animali vertebrati. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati sull'Ambystoma mexicanum (axolotls) in strutture dell'Università di Yale.
1. Generazione di embrioni diploide
<ol><li>Ottenere embrioni diploidi GFP per fungere da ospiti di innesto attraverso l'accoppiamento naturale utilizzando uno o due genitori gfp 24.</li>
	<li>Raccogliere le uova diploide appena posate e metterle in un setaccio di metallo.</li>
	<li>Sciacquare accuratamente le uova con la soluzione del 40% di Holtfreter (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7.4).</li>
	<li>Mettete le uova nella soluzione fresca del 40% di Holtfreter e conservatele a 12 gradi centigradi. NOTA: gli embrioni diploidi devono sempre essere ottenuti prima di passare alla generazione di embrioni aploidi.</li>
</ol>2. Generazione di embrioni aploidi
<ol><li>Preparazione del donatore di gameti femminili<ol>
<li>48 h prima di effettuare l'attivazione in vitro, anestesizzare un axolotl femminile bianco o bianco/RFP sessualmente maturo per immersione in MS-22 2thong tampone HEPES nel 40% soluzione Holtfreter25.</li>
		<li>Assicurarsi che l'animale sia completamente anetizzato dopo circa 30 min di immersione pizzicando saldamente la coda tra il pollice e l'indice. Gli animali completamente anestesizzati non rispondono fisicamente ad alcun pizzico.</li>
		<li>Preparare una soluzione di gonadotropina corionica umana (HCG) contenente 10.000 U/mL in salina sterile.</li>
		<li>Utilizzando una siringa insulinica da 30 G, iniettare 0,15 CC di HCG (1.500 unità) nella muscolatura dorsale all'arto posteriore della femmina anetizzata con un angolo di 45 gradi rispetto alla linea mediana per evitare il contatto con il midollo spinale.</li>
		<li>Riportate la femmina al 40% di Holtfreter e mettetela in un frigorifero da 8,12 gradi centigradi.</li>
		<li>Dopo 48 h, riportare la femmina a temperatura ambiente. Mettere alcune pietre o piante di plastica nel suo contenitore come superfici per la deposizione delle uova. NOTA: Le femmine iniettate con HCG spesso depositano casi di gelatina vuoti per diverse ore prima di deporre le uova.</li>
		<li>Rimuovere le pietre o piante di plastica dopo che la femmina ha iniziato costantemente deponendo le uova.</li>
		<li>Lasciare che la femmina si sieda nel serbatoio vuoto per 30 min a 1 h. NOTA: Trattenendo i materiali per l'animale di deporre le uova permetterà un controllo più rigoroso della raccolta degli ovociti.</li>
	</ol></li>
	<li>Collezione di gameti maschili<ol>
<li>Mentre la deposizione dell'uovo della femmina è in stallo, anestesizza un axolotl maschile GFP -essere sessualmente maturo per fungere da donatore di sperma, come nel punto 2.1.1.</li>
		<li>Posizionare il maschio completamente anetizzato sulla schiena su asciugamani di carta umidi sotto un microscopio dissegente.</li>
		<li>Se lo sperimentatore è destrorso, posizionare la punta di una pipetta P1000 alla base della cloaca con la mano destra.</li>
		<li>Posizionare l'indice sinistro e il pollice della mano sinistra di 2,3 cm rostral sul bacino. Spremere delicatamente l'animale mentre si spostano le dita verso le zampe posteriori per eliminare i campioni di urina spermica.</li>
		<li>Raccogliere ciascuno che viene lavato fuori dalla cloaca in un singolo tubo di microcentrifuga. Ripetere questo processo per raccogliere da 6 a 10 campioni.</li>
		<li>Pipetta 5,0 l da ogni campione su una piastra di Petri per ispezionare la qualità dello sperma utilizzando un microscopio invertito. NOTA: I campioni di spermatozoi concentrati sono di colore bianco latteo, in genere vanno da 5 a 20 -L, e di solito vengono recuperati dopo che vengono estratti diversi campioni di urina spermica di volume più elevato. Lo sperma raccoglierà nella parte inferiore dei tubi in campioni di volume più elevato quando lasciato indisturbato. I campioni concentrati di spermatozoi sani sono altamente motili e perdono attività man mano che la loro concentrazione diminuisce. I maschi sani possono produrre fino a 50 -L di sperma concentrato.</li>
	</ol></li>
	<li>Collezione gamete femminile<ol>
<li>Dopo aver ottenuto e confermato un campione di spermatozoi sano, anestesizzare l'axolotl femminile iniettato da HCG come nel passo 2.1.1.</li>
		<li>Posizionare la femmina completamente anetizzata su asciugamani di carta umidi sulla schiena.</li>
		<li>Estrarre le uova non fecondate dalla femmina utilizzando un movimento della mano simile a quello nel passaggio 2.2.4.</li>
		<li>Raccogliere le uova con pinze bagnate e trasferirle in una piastra di petri di 10 cm. Trattare le uova con sperma irradiato entro 15 min dalla raccolta.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di gameti maschili e attivazione in vitro<ol>
<li>Utilizzare una pipetta P10 o P20 per pipettare lo sperma su e giù, rompendo i grumi per formare una sospensione omogenea.</li>
		<li>Approssimare la percentuale di spermatozoi motili posizionando una goccia di 0,5 ll di sospensione dello sperma non diluita su un coperchio della piastra di Petri o su un vetrino di vetro ed esaminando con un microscopio invertito.</li>
		<li>Aggiungete 9,5 ll di 0,1 x la soluzione di Ringer modificata di Marc (MMR; Tabella dei materiali) a questo campione per fare una diluizione di spermatoma 20x. Delicatamente pipette su e giù per mescolare.</li>
		<li>Con un microscopio invertito, contare lo sperma in tre gocce da 1,0 ll dell'aliquota diluita 20 volte su una copertura di piastra di Petri o su un emocitometro per stimare la concentrazione di spermatozoi della sospensione non diluita.</li>
		<li>Preparare lo sperma per l'irradiazione diluindo un'aliquota del campione di sperma originale a circa 80.000 cellule motili/mL in sterile 0,1x MMR.</li>
		<li>Contare il numero di uova ottenute negli ultimi 15 min. Utilizzare la punta della pipetta per distribuire questa sospensione in uno strato spesso 1 mm.</li>
		<li>Utilizzando un ascensore di plastica, posizionare il campione a 4 cm dalle lampadine di un parassa da 254 nm. Geneticamente disattivare lo sperma irradiando il campione con 800.000 uJ/mm2.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta P10, pipette la sospensione sulle uova non fecondate, ricoprendo ogni uovo con 0,25-0,5 litri di sperma irradiato. Lasciare che le uova si siedano a temperatura ambiente per 30 min.</li>
		<li>Dopo 30 min, allagare le uova con 0,1x MMR. Mettete immediatamente le uova in un'incubatrice di 8-10 gradi centigradi per le iniezioni il giorno successivo o a 18 gradi centigradi per le iniezioni entro 7 ore dopo l'attivazione (hpa).</li>
		<li>Dejelly aploidi con forza affilata 30 min dopo l'idratazione. Mettete immediatamente le uova in un'incubatrice di 8-10 gradi centigradi per le iniezioni il giorno successivo o a 18 gradi centigradi per le iniezioni lo stesso giorno.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mutagenesi e manutenzione haploid
<ol><li>Microiniezioni CRISPR/Cas9<ol>
<li>Progetta sgRNA utilizzando CRISPRscan e sintetizza26,27.</li>
		<li>Per la mutagenesi multiplex, preparate uno stock di 5 sgRNA (10 ng/L per ogni sgRNA) e una proteina Cas9 (1 g/l). Preparare una diluizione di 100 volte di questo stock (0,1 ng/L per sgRNA, 10 ng/L Cas9) per l'iniezione. Per il singolo gene, alta frequenza di mutazione, seguire il protocollo descritto in precedenza28.</li>
		<li>Iniettare gli embrioni aploidi allo stadio a cella singola di 7 ha se immagazzinati a 18 gradi centigradi o iniettare gli embrioni il giorno successivo allo stadio di 2/8 cellule se sono immagazzinati a 8.10 gradi centigradi.</li>
		<li>Trasferire gli embrioni a 1,0 x MMR con 400 polisucrosi al 20%.</li>
		<li>Se a singola cellula, iniettare a ogni embrione una goccia di 5 nL della soluzione di iniezione (circa 1/4 raggio dell'uovo) contenente una massa totale di 0,5 pg/sgRNA e 50 pg Proteina Cas9. Se multicellulare, distribuire questa massa iniettando volumi più piccoli in più cellule.</li>
		<li>Lasciare che gli embrioni guariscano nella polisucrosi 400 per un minimo di 4 h e un massimo di 18 h a 18 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alloggiamento embrionale aploide<ol>
<li>Trasferire gli embrioni a 0,1x MMR con antibiotico-antimicotico.</li>
		<li>Casa ogni embrione in un pozzo individuale di una piastra di 24 pozze, come alcuni moriranno o si svilupperanno in modo anomalo. Mantenere a 16/18 gradi centigradi. Temperature più basse possono essere utilizzate per prolungare lo sviluppo, se necessario.</li>
		<li>Sostituire i supporti con mMR fresco 0.1x con antibiotico-antimicotico a giorni alterni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparazione dell'embrione dell'ospite diploide
<ol><li>Mantenere gli embrioni nel rivestimento della gelatina a 12-16 gradi centigradi fino a raggiungere lo stadio da 22 a 26.</li>
	<li>Raccogliere gli embrioni pronti per l'innesto, posizionarli all'interno di un setaccio (dimensioni della rete di 4 mm) e sciacquarli delicatamente con il 40% della soluzione di Holtfreter.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in mMR calibro sterilizzato 0,1x contenenti 1,5% di candeggina fino a 2 min. Sommergendo completamente gli embrioni nella soluzione di candeggina e vorinferoli delicatamente per garantire che il rivestimento della gelatina entri pienamente in contatto con la soluzione di candeggina per uccidere i microbi presenti sugli embrioni.</li>
	<li>Dopo 2 min, diluire la soluzione di candeggina contenente gli embrioni con un volume uguale di filtro-sterilizzato 0.1x MMR.</li>
	<li>Versare delicatamente gli embrioni in un setaccio candeggina sanitizzato (dimensioni maglia 4 mm) e risciacquare gli embrioni cinque volte con 0,1m MMR sterilizzato con filtro.</li>
	<li>Collocare gli embrioni in sterili piatti di Petri da 10 cm con 0,1 mM con antibiotici per la denicecciatura (penicillina 100 unità/mL, streptomicina 100 g/l, 0,25 g/mL, gentamicin 25 g/mL).</li>
	<li>Sotto uno stereoscopio fluorescente, rimuovere i cappotti di gelatina e le membrane vitelline dagli embrioni GFP utilizzando pinze affilate (dimensioni della punta 0,05 x 0,01 mm2).</li>
	<li>Trasferire gli embrioni di GFP in una nuova piastra di Petri. Ridurre al minimo la quantità di liquido trasferito dalla piastra di Petri dove sono stati dejellied.</li>
	<li>Risciacquare gli embrioni dell'ospite di GFP con sterili 0,1 volte MMR con antibiotici da quattro a sei volte per rimuovere i contaminanti.</li>
	<li>Collocare gli embrioni puliti a 4 gradi centigradi durante la notte prima dell'innesto. NOTA: Il raffreddamento degli embrioni li rende più rigidi e puliti separazioni del mesoderma dall'endoderma fattibile.</li>
</ol>5. Generazione Chimera aploide-diploide-diploide
<ol><li>Preparazione chirurgica di piatti e supporti<ol>
<li>Preparare sterili piatti chirurgici operativi versando autoclaved 2% agarose in 0.1x MMR in sterili 35 mm piatti di Petri facile afferratura. Riempire i piatti di petri a metà strada con agarose.</li>
		<li>Dopo che l'agarose si raffredda, utilizzare un bisturi sterile per tagliare una depressione lunga 25 mm nell'agarose per tenere gli embrioni in posizione.</li>
		<li>Riempire il piatto con supporti chirurgici sterili (0,1m MMR con anti-micoplasma 2,5 g/mL, amphotericin B 0,25 g/mL e ciprofloxacin 10,0 g/mL) e conservare in frigorifero a 4 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedura di innesto dell'embrione<ol>
<li>Collocare all'interno della depressione della parabola operativa prescolata un donatore sano di aploide con uno o due embrioni dell'ospite diploide GFP e corrispondente allo stadio all'interno della depressione della parabola operativa preclata contenente supporti chirurgici (Figura 3). NOTA: Se possibile, eseguire la procedura su una fase di raffreddamento (10 o inferiore).</li>
		<li>Utilizzare due pinze ultra-sottili e autoclaved (punta dritta, dimensioni della punta 0,05 x 0,02 mm2) per rimuovere gli strati di ectoderm e mesodermi dall'ospite con l'arto gemma vicino al centro (Figura 4). NOTA: La regione di innesto di tessuto rettangolare comprende il bocciolo dell'arto ed estende dalla nona somite alla metà posteriore del rigonfiamento branchiale, circa 2 mm, lungo l'asse posteriore anteriore. Lungo l'asse dorsoventrale, la regione innestata si estende per circa 1,5 mm, comprese le somiti appena oltre il bordo ventrale del rigonfiamento branchiale branchiale. La regione innestata comprende tutto il mesoderma laterale della piastra e le metà laterali dei somiti, senza disturbare l'endoderma sottostante. Vedere Figura 4 e il video di accompagnamento per i dettagli.</li>
		<li>Mettere da parte il tessuto ospite e rimuovere un lasso di tessuto di dimensioni equivalenti dal donatore aploide utilizzando gli stessi metodi.</li>
		<li>Posizionare la lastra di tessuto del donatore aploide sulla regione corrispondente dell'embrione del donatore.</li>
		<li>Fissare il tessuto coprendolo con un frammento di vetro rettangolare autoclato da un vetro di copertura del microscopio schiacciato e premendolo delicatamente nel corpo dell'embrione ospite.</li>
		<li>Capovolgere l'embrione del donatore aploide sul suo lato opposto per raccogliere il germoglio dell'arto per il secondo embrione ospite. Ripetere i passaggi da 5.2.2 a 5.2.5.</li>
		<li>Rimuovere con cautela i tessuti ospiti in eccesso rimanenti e l'embrione del donatore dal piatto.</li>
		<li>Lasciare gli innesti con le ancore del frammento di vetro in posizione per 60-75 min, controllando ogni 20 min per assicurarsi che il vetro non sia scivolato via.</li>
		<li>Dopo che gli innesti di tessuto aderiscono completamente, utilizzare le pinze per staccare lentamente le ancore del frammento di vetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manutenzione Chimera<ol>
<li>Trasferite gli embrioni innestati su supporti chirurgici freschi e manteneteli a 8,12 gradi centigradi durante la notte per guarire. Casa individualmente embrioni innestati in piastre 12 o 24-bene.</li>
		<li>Dopo 36-48 h, trasferire gli embrioni innestati in sterile 0,1x MMR antibiotic-antimicotic. I forti antibiotici nei media chirurgici causano tossicità negli embrioni innevati dopo 3 giorni.</li>
		<li>Sostituire i supporti con mMR freschi 0,1x e antibiotici ogni 2/3 giorni.</li>
		<li>Mantenere gli embrioni innestati a 18 gradi centigradi fino a quando non sono in grado di nutrirsi di28.</li>
		<li>Dopo 1 o 2 mesi di sviluppo e cura, gli arti aploidi possono essere segnati per la purezza dell'innesto utilizzando un microscopio a dissezione fluorescente. NOTA: La presenza di tessuto GFP non neurale o non-sanguinario derivato da host negli arti è un indicatore di innesto impuro ed è spesso associata allo sviluppo anormale degli arti. Questi animali dovrebbero essere esclusi da ulteriori analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li>
<li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li>
<li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li>
<li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li>
<li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate%3A+the+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li>
<li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Axolotl+Heads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li>
<li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li>
<li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li>
<li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li>
<li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352(2013).</li>
<li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li>
<li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I%3A+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li>
<li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+%2832+Gb%29+Axolotl+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548(2018).</li>
<li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li>
<li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Quarterly+Review+of+Biology%22%5BJournal%5D)">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li>
<li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li>
<li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li>
<li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Meets+Single%3A+The+Application+of%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR%2FCas9+in+Haploid+Embryonic+Stem+Cells.+Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li>
<li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+husbandry%2C+breeding%2C+metamorphosis%2C+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li>
<li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Medicine%3A+Research+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+A+%22Salamanders+in+Regeneration+Research%3A+Methods+and+Protocols%22">Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl%2C+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li>
<li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+stages+of+development+of+the+axolotl%2C+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li>
<li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f.+Entwicklungsmechanik%22%5BJournal%5D)">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li>
<li>Fei, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono alcuni passaggi critici nel nostro protocollo per la generazione di chimere aploidi-diploidi che il tecnico operativo dovrebbe prendere in considerazione per risultati di innesto coerenti.
La ragione più probabile per cui la generazione di aploidi fallisce è dovuta a cattive condizioni di attivazione in vitro. Le quantità adeguate di spermatozoi motile devono essere utilizzate per attivare le uova. Per prolungare la motilità, i campioni di sperma devono sempre essere mantenuti a 4 grad...

Storicamente, l'innesto di tessuto embrionale negli anfibi è stata una tecnica importante per esplorare i meccanismi fondamentali della biologia dello sviluppo e della rigenerazione. L'axolotl, una specie di salamandra, possiede un'impressionante capacità di rigenerare i tessuti e strutture complesse come arti e organi dopo lesioni o amputazioni. Allo stesso modo impressionante, possono ricevere, senza rigetto, innesti tissutali da altri individui a stadi embrionali, giovani e adulti1,2,3. Regioni di embrioni che producono intere strutture come arti, code, occhi e teste, e tessuti più specifici, come neuroectodermi e somiti, possono essere innestati tra embrioni per produrre animali chimerici1,2,4,5,6. Per quasi un secolo, studi su tali animali chimerici hanno fornito informazioni cruciali sulla rigenerazione, la differenziazione dei tessuti, il controllo delle dimensioni e il patterning1,7,8.
Nell'ultimo decennio, numerosi studi trascrizionali sui tessuti rigeneranti hanno prodotto approfondimenti sui programmi genetici alla base della rigenerazione della salamandra9,10,11,12,13. Questi studi hanno aggiunto un elenco in espansione di geni candidati che, ad oggi, sono in gran parte caratterizzati nel contesto della rigenerazione. Tecniche mirate di mutagenesi, come CRISPR/Cas, ora permettono lo studio di tali geni, e tali approcci genetici sono notevolmente facilitati dal recente sequenziamento e assemblaggio del grande genoma axolotl14,15,16.
Abbiamo cercato di sviluppare tecniche che associavano la biologia dello sviluppo classico alla nuova tecnologia genetica allo scopo di sezionare i meccanismi di rigenerazione. I metodi per la generazione di embrioni aploidi di axolotle e altre salamandre sono stati stabiliti per decenni17. Mentre queste tecniche sono state a lungo notate come vantaggi delle salamandre come organismi modellogenetico 18, pochi studi genetici successivi hanno incorporato animali aploidi. Usiamo l'attivazione in vitro nell'axolotl per produrre embrioni aploidi che fungono da donatori di tessuti per l'innesto19. Utilizzando embrioni che trasportano marcatori genetici fluorescenti, abbiamo ideato metodi affidabili per generare arti derivati quasi interamente dai tessuti donatrici (Figura 1A). Combinando queste due tecniche, abbiamo aggirato la letale embrionale tardiva associata all'aploidia, consentendo la produzione di arti aploidi completamente sviluppati e innestati (Figura 1B, Figura 1Be Figura 2).
Conducendo la mutagenesi mediata DA CRISPR/Cas in embrioni aploidi prima dell'innesto per creare axolotli chimerici con arti aploidi mutanti, possiamo studiare la funzione genica specificamente nel contesto dello sviluppo e della rigenerazione degli arti. Ciò consente il salvataggio di arti da fenotipi mutanti potenzialmente embrionali-letali. Mentre la microiniezione CRISPR/Cas può generare animali altamente mutanti, tali animali sono tipicamente altamente mosaici, con un certo grado di ritenzione di alleli wildtype e una varietà di mutazioni distinte nei siti mirati14,20. La mutagenesi a base di CRISPR nelle cellule aploidi aumenta la penetrazione delle mutazioni della perdita di funzione di singolo allele, in quanto non possono essere mascherate da alleli wildtype conservati. Per questo motivo, lo screening basato su CRISPR nelle linee cellulari aploidi viene sempre più utilizzato per studiare la base genetica di molti processi cellulari21,22,23. Combinando il tracciamento del lignaggio basato su CRISPR con i nostri protocolli di innesto di boccioli aploidi, l'approccio qui descritto può servire come piattaforma per schermi genetici aploidi in animali viventi20.

<table><tbody><tr><td>#55 Dumont Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-1</td><td>Utilizzare solo materiale Dumostar (può essere sterilizzato in autoclave)</td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td>20 mL</td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400 (polisaccarosio 400)</td><td>bioworld</td><td>40600032-3</td><td>Ficoll 400</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1914-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore di riscaldamento/raffreddamento</td><td>RevSci</td><td>RS-IF-233</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina corionica umana</td><td>Merk</td><td></td><td>Chorulon</td></tr><tr><td>Megascript T7 Kit di trascrizione</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1334</td><td>40 reazioni</td></tr><tr><td>Miroscope Cooling Stage</td><td>Brook Industries</td><td>Personalizzato</td><td></td></tr><tr><td>Personalizzato NLS Cas9 Proteina</td><td>PNAbio</td><td>CP01-200</td><td>4 fiale da 50 &; g di proteina ciascuna</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpt-1</td><td>Livello di trattamento</td></tr><tr><td><forte>Ricette</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,0x Soluzione di Ringer modificata di Marc (MMR)</td><td></td><td></td><td>0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7,8), ph 7,4</td></tr><tr>Soluzione di <td></td><td></td><td>Holtfreter al 40%</td><td>20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7,4</td></tr></tbody></table>

generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Un insieme crescente di tecniche e risorse genetiche consente ai ricercatori di sondare le origini molecolari della capacità di alcune specie di salamandre, come gli axolotl, di rigenerare interi arti da adulti. Qui, illustremo le tecniche utilizzate per generare axolotl chimerici con arti anteriori aploidi aploidi con anammi aploidi con anamne aploidi con anamne mutagenizzati di Cas9 che possono essere utilizzati per esplorare la funzione genica e la fedeltà della rigenerazione degli arti. Uniamo diverse tecniche embrionali e genetiche, tra cui la generazione di aploidi tramite attivazione in vitro, la mutagenesi CRISPR/Cas9 e l'innesto di tessuto in un unico protocollo per produrre un sistema unico per lo screening genetico aploide in un organismo modello di rigenerazione. Questa strategia riduce il numero di animali, lo spazio e il tempo necessari per l'analisi funzionale dei geni nella rigenerazione degli arti. Ciò consente anche di sapiere le funzioni specifiche della rigenerazione dei geni che possono essere necessarie per altri processi essenziali, come l'organogenesi, la morfogenesi dei tessuti e altri processi embrionali essenziali. Il metodo qui descritto è una piattaforma unica per condurre lo screening genetico degli aploidi in un sistema modello di vertebrato.

Lo sviluppo di embrioni aploidi può essere distinto dagli embrioni diploidi dal loro fenotipo29della loro "sindrome aploide". In fase di innesto, gli embrioni aploidi presentano una curvatura ridotta lungo l'asse anteriore-posteriore e un recinto incompleto della spina del tuorlo (Figura 3A). Un microscopio fluorescente può essere utilizzato per garantire che gli embrioni aploidi siano privi di espressioni GFP di deriv...

Questo obiettivo di questo protocollo è quello di produrre axolotl chimerici con arti anteriori aploidi derivati dal tessuto donatore mutageno Cas9 utilizzando tecniche di innesto di tessuti embrionali.

Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Questo protocollo consente la produzione di arti aploidi mutagenizzati che possono essere utilizzati per lo screening genetico nell'axolotl. Negli aploidi, anche la mutagenesi di basso livello può produrre perdita di fenotipi di funzione all'interno delle cellule. Questa tecnica di innesto può anche essere utilizzata per salvare fenotipi letali embrionali.Questo metodo può essere utilizzato per studiare la rigenerazione in qualsiasi specie anfibiana suscettibile di fecondazione e innesto in vitro. Prima di utilizzare embrioni aploidi come donatori, si consiglia di praticare e confermare il successo degli innesti tra embrioni diploidi positivi e negativi della GFP. Per la preparazione del donatore di gameti femminili, anestetizza un axolotl femminile RFP bianco o bianco sessualmente maturo per fungere da donatore di gameti.Dopo aver confermato la mancanza di risposta alla simulazione del dolore, utilizzare una siringa per insulina calibro 30 per iniettare 0,15 millilitri di gonadotropina corionica umana nella muscolatura dorsale all'arto posteriore. Inserire la siringa con un angolo di 45 gradi sulla linea mediana per evitare il contatto con il midollo spinale. Mettere l'animale iniettato nella soluzione fresca del 40%Holtfreter e trasferire l'axolotl in un frigorifero da otto a 12 gradi Celsius per 48 ore.Quindi riportare la femmina a temperatura ambiente. Mentre la femmina depone le uova, posiziona un maschio completamente anestetizzato in posizione supina su tovaglioli di carta umidi sotto un microscopio sezionante e posiziona la punta di una pipetta P1000 alla base della cloaca con la mano dominante. Posizionare l'altro indice e il pollice da due a tre centimetri rostrali al bacino e spremere delicatamente l'animale mentre si spostano le dita verso le zampe posteriori per sciacquare i campioni di urina spermica raccogliendo ogni campione in un nuovo tubo di microcentrifugo.Quindi trasferire cinque microlitri da ogni campione in una piastra di Petri per ispezionare la qualità dello sperma utilizzando un microscopio invertito. Dopo il conteggio, diluire lo sperma a una concentrazione di otto volte 10 al quarto cellule per millilitro in MMR sterile 0,1X e trasferire 0,5 microlitri di spermatozoi per uovo in una nuova piastra di Petri. Quindi utilizzare la punta della pipetta per stendere la sospensione a uno strato spesso un millimetro e utilizzare un sollevatore di plastica per posizionare il campione a quattro centimetri dai bulbi di un reticolatore da 254 nanometri per l'irradiazione a otto volte 10 alle cinque microjoule per millimetro al quadrato.Dopo aver raccolto un campione di sperma sano, posizionare la femmina in posizione supina su una pila di asciugamani di carta umidi e utilizzare un movimento di vampate di calore simile per estrarre le uova non fecondate dall'axolotl femminile. Quindi utilizzare le forcette bagnate per trasferire le uova in una piastra di Petri di 10 centimetri. Entro 15 minuti dalla raccolta, utilizzare una pipetta P10 per erogare lo sperma irradiato sulle uova non fecondate che rivestino ogni uovo con 0,25-0,5 microlitri di sperma inattivato.Dopo aver permesso alle uova di sedersi a temperatura ambiente per 30 minuti, inondare le uova di 0,1X MMR. Trenta minuti dopo l'idratazione, utilizzare forcep affilate per sconfesare le uova e posizionare le uova a 18 gradi Celsius per la microiniezione entro sette ore. Per generare una chimera aploide-diploide, posizionare un donatore aploide sano con uno o due embrioni ospiti diploidi positivi alla GFP abbinati allo stadio all'interno del trogolo di un piatto operativo pre-refrigerato contenente mezzo chirurgico su uno stadio di raffreddamento di 10 gradi Celsius o inferiore.Utilizzare due forcelle di punta dritta autoclavate ultra fini per rimuovere l'intero bocciolo dell'arto e gli strati circostanti di ectoderma e tessuto mesoderma e mettere da parte il tessuto ospite. Rimuovere una foschia tissutale di dimensioni equivalenti dal donatore aploide e posizionare la foschia del tessuto donatore aploide sulla regione corrispondente dell'embrione ospite. Fissare il tessuto con un frammento di vetro rettangolare autoclavato da un vetro di copertura del microscopio schiacciato e premere delicatamente il tessuto nel corpo dell'embrione ospite.Lasciare l'ancora in posizione per 60-75 minuti controllando ogni 20 minuti per confermare che il vetro non è scivolato prima di utilizzare le forcep per staccare il frammento di vetro di copertura. Trasferire gli embrioni innestati in un mezzo chirurgico fresco che consenta loro di guarire da otto a 12 gradi Celsius durante la notte prima di ospitare gli embrioni innestati individualmente in piastre da 12 o 24 pozzi. Il 38,7% degli ovociti si è sviluppato in embrioni aploidi normalmente sviluppati.Nella fase di innesto, gli embrioni aploidi mostrano una curvatura ridotta lungo l'asse anteriore-posteriore e un recinto incompleto della spina del tuorlo. Inoltre, un microscopio fluorescente può essere utilizzato per confermare che gli embrioni aploidi sono privi di espressione GFP di derivazione paterna. Gli innesti falliti e impuri producono una varietà di fenotipi.Quando gli innesti sono puliti e normalmente sviluppati, l'espressione della GFP dovrebbe essere limitata principalmente al plesso brachiale, la rete neurale derivata dal midollo spinale ospite. L'espressione GFP punctate è presente anche in singole cellule che sembrano essere neuroni sensoriali nelle cellule ospiti derivate dal sangue che migrano nell'arto in via di sviluppo. Quando si utilizza donatori positivi alla RFP, gli arti di innesto aploide mostrano un'espressione universale di RFP.Durante lo sviluppo, gli arti aploidi non mutagenizzati sono significativamente più corti degli arti anteriori diploidi opposti negli animali chimerici. Gli arti aploidi non mutagenizzati si rigenerano completamente, sebbene dimostrino un leggero ritardo nel raggiungere lo stadio di crescita digitale rispetto ai diploidi. Ricordarsi di utilizzare una tecnica sterile e rimuovere e sostituire completamente gli strati completi di mesoderma ed ectoderma dall'ospite embrionale al fine di produrre un arto innestato in modo pulito.Gli arti mutanti possono essere amputati e segnati per i fenotipi di rigenerazione. Gli alleli mutanti possono essere quantificati con il sequenziamento di nuova generazione. In combinazione con la mutagenesi CRISPR-Cas9, la nostra tecnica di innesto ci ha permesso di condurre uno schermo di selezione negativa di geni mirati negli arti aploidi rigeneranti.

generation-chimeric-axolotls-with-mutant-haploid-limbs-through

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Un passo-passo guida mirate a generare embrioni di zebrafish chimerico da trapianto allo stadio di blastula o gastrula.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

Zebrafish trapianto di cellule consente la combinazione di genetica e dell'embriologia per generare chimere tessuto specifiche. Questo video dimostra gastrula scena trapianti di cellule che hanno permesso al nostro laboratorio per studiare il ruolo delle popolazioni astrogliali e spunti indicazioni specifiche durante la formazione commessura nel proencefalo.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

A causa del corion duro e morbido embrioni, la manipolazione degli embrioni Medaka è più coinvolto che in zebrafish. Questo video mostra passo per passo le procedure di come manipolare gli embrioni Medaka, tra cui dechorionation, montaggio in agarosio per l'imaging e il trapianto di cellule per la produzione di chimere. Queste procedure sono essenziali per l'uso Medaka zebrafish e in un laboratorio per sfruttare al massimo delle loro caratteristiche complementari per la dissezione genetica...

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Innestando perline imbevute di fattori di crescita o inibitori specifici delle vie di segnalazione negli embrioni in via di sviluppo, è possibile testare direttamente i loro effetti in vivo. In questo protocollo, le perle vengono innestate nella gemma dell'arto per determinare gli effetti di queste molecole sull'espressione genica e sulla trasduzione del segnale.

L&#39;innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Geni essenziali per la sopravvivenza pongono ostacoli tecnici per la creazione di linee mutanti. Rincorsa aggira la letalità combinando genoma editing con trapianto di cellule germinali primordiali per creare animali portatori di mutazioni di germline. Rincorsa consente anche la generazione efficiente di omozigoti mutanti nella generazione1 F. Qui, il passo di trapianto è dimostrato.

Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

Qui presentiamo protocolli di ecocardiografia per acquisizione di immagini bidimensionali e tridimensionali del cuore pulsante della Salamandra axolotl (Ambystoma mexicanum), una specie di modello nella rigenerazione del cuore. Questi metodi consentono la valutazione longitudinale della funzione cardiaca ad alta risoluzione spazio-temporale.

Ecocardiografia 2D e 3D nell'Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Presentato qui è un protocollo per eseguire il knock-out genico limitato nel tempo e nello spazio nei midollo spinale axolotl iniettando il complesso CAS9-gRNA nel canale centrale del midollo spinale seguito dall'elettroporazione.

Knock-out gene diretto delle cellule staminali neurali del midollo spinale ad axolotl tramite elettroporazione dei complessi CAS9 Protein-gRNA

Questo articolo descrive come eseguire un metodo chirurgico per inibire la formazione dell'epidermide della ferita durante la rigenerazione dell'arto axolotl suturando immediatamente la pelle a tutto spessore sul piano di amputazione. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i ruoli funzionali dell'epidermide della ferita durante le prime fasi della rigenerazione degli arti.

Inibizione della formazione dell'epidermide della ferita tramite chirurgia del lembo della pelle completa durante la rigenerazione degli arti Axolotl

Gli arti ricombinanti sono un potente modello sperimentale che consente di studiare il processo di differenziazione cellulare e la generazione di modelli sotto l'influenza di segnali embrionali. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per generare arti ricombinanti con cellule mesodermiche di pollo, adattabili ad altri tipi di cellule ottenute da organismi diversi.

Test degli arti ricombinanti di pollo per comprendere la morfogenesi, i modelli e i primi passi nella differenziazione cellulare

Viene presentato un protocollo per la chirurgia dell'osteotomia femorale con l'uso della fissazione interna della placca in axolotl maturi. La procedura può essere utilizzata per eseguire studi comparativi sulla rigenerazione degli arti e sulla guarigione delle fratture negli anfibi acquatici.

Stabilizzazione di un'osteotomia del femore con una fissazione della placca nell'Ambystoma mexicanum

In questo protocollo, mostriamo come preparare il tessuto axolotl per la microscopia a forza atomica (AFM) ed eseguire misurazioni dell'indentazione nella cartilagine degli arti intatta e in rigenerazione.

Misurazioni al microscopio a forza atomica della cartilagine in arti axolotl intatti e in rigenerazione

Scopri come generare arti aploidi mutagenizzati nell'axolotl per screening genetico. Questa tecnica di innesto embrionale consente di studiare la rigenerazione e salvare fenotipi letali in anfibi.

Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale

Esplora altri video