Un modello di espressione della chemiochina ectopica per testare il reclutamento macrofrofo in vivo
25 settembre 2019
Per testare l'effetto di una chemiochina sul reclutamento di macrofagi in vivo, l'intero montaggio in situ ibridazione è stato utilizzato per rilevare l'espressione ectopica della chemiochina, e l'immunostainizzazione è stata utilizzata per etichettare i macrofagi. L'imaging dal vivo è stato utilizzato per l'osservazione in tempo reale della migrazione dei macrofafi.
Il protocollo qui descritto ci permette di indagare la funzione di una chemiochina e il comportamento del macrofago in vivo. La maggior parte dei modelli sperimentali esistenti di chemiotassi cellulare si basano su esperimenti su cellule in vitro. Ma gli esperimenti in vitro a volte sono troppo semplici per modellare l'ambiente complesso in vivo.
Inoltre, potrebbero non rappresentare l'abilità di chemioa attrazione in vivo. Questi metodi utilizzano il vantaggio specifico del pesce zebra per l'osservazione diretta del comportamento cellulare, che è difficile per i topi. Inizia generando costrutti transgenici TGFABP-10A interleuchina-34.
Iniettare i costrutti interleuchina-34 FABP-10A in uno stadio cellulare Tg(mpeg1:GFP)transgenico e un embrione di pesce di tipo selvatico insieme alla MRNA traspostasi. Sollevare e raccogliere gli embrioni secondo le istruzioni del manoscritto. Quindi, fissarli con paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 gradi Celsius o per due ore a temperatura ambiente.
Dopo la fissazione, lavare gli embrioni con PBST tre volte per cinque minuti per lavaggio. Disidratare gli embrioni separatamente con il 50% di metanolo in PBST, seguito dal 100% di metanolo, quindi passare al metanolo fresco al 100% e conservarli a -20 gradi Celsius per almeno 2 ore. Quando è pronto per l'ibridazione della sonda, reidratare gli embrioni separatamente nel 50% di metanolo in PBST.
Quindi, lavarli con PBST tre volte per cinque minuti per lavaggio. Digerire gli embrioni con proteinasi K in PBST a temperatura ambiente. Quindi, scartare la soluzione di digestione e ripetere la fissazione con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.
Dopo la fissazione, lavare gli embrioni due volte con PBST per 10 minuti per lavaggio. Eseguire la preibridizzazione con buffer di ibridazione riscaldato a 65 gradi Celsius per almeno un'ora. Quindi, preriscaldare la sonda interleuchina-34 a 65 gradi Celsius per 10 minuti.
Riciclare il buffer di ibridazione nel tubo originale ed eseguire l'ibridazione con la sonda preriscaldata a 65 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare gli embrioni con 50%formamide e 2X SSCT seguito da 2X SSCT e poi 0.2X SSCT a 65 gradi Celsius. Ripetere ogni lavaggio tre volte con 20 minuti per lavaggio.
Quindi, lavare gli embrioni tre volte con PBST per cinque minuti per lavaggio. Bloccare i campioni con 600 millilitri di tampone di blocco per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 400 microlitri di soluzione anticorpale HRP anti-digoxigenina e incubare gli embrioni a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo e lavare gli embrioni sei volte con PBST per 20 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sciacquare ogni campione con 30 microlitri di 1X più diluente di amplificazione per cinque minuti. Incubare i campioni nella soluzione di lavoro della tiroramina del fluorofo per cinque-15 minuti al buio.
Estensione del tempo di incubazione a 30 minuti se i segnali sono deboli. Quindi, lavare gli embrioni con PBST tre volte per 10 minuti per lavaggio. E incubarli con l'anticorpo primario a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, lavare gli embrioni cinque volte con PBST per 30 minuti per lavaggio e incubarli con gli anticorpi secondari a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare gli embrioni tre volte in PBST per 10 minuti per lavaggio e conservarli nel 70% di glicerolo al buio a quattro gradi Celsius o -20 gradi Celsius più a lungo. Prima dell'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza per selezionare gli embrioni doppi positivi DS rossi e GFP.
Per montare il pesce, utilizzare un bagno di metallo per riscaldare un millilitro dell'1% di agarosio fuso basso fino a oltre 90 gradi Celsius. Quindi, raffreddarlo a temperatura corporea e mescolare in 50 microlitri dello 0,2% di tricaina. Trasferire gli embrioni anestetizzati su un piccolo piatto montato con uno scivolo di copertura sul fondo.
Rimuovere l'acqua circostante e far cadere lentamente l'agarosio a bassa fusione sugli embrioni. Impostare con cura la posizione del pesce prima che l'agarosio si sia solidificato, mantenendo l'area epatica vicino allo scivolo di copertura. Una volta che l'agarosio si è solidificato, coprirlo con cura con un altro strato di agarosio per rinforzarlo.
Posizionare il piatto sul tavolo porta microscopio confocale, coprire il pesce con la soluzione E2 con tricaina e iniziare l'imaging. Per utilizzare il microscopio confocale, aprire il software Zen Black 2.3 e fare clic su individua, quindi incubare, quindi impostare la temperatura su 29 gradi Celsius. Fare clic sul menu di acquisizione e selezionare la modalità di scansione e i laser necessari nel menu di configurazione intelligente.
Quindi selezionare Z-stack e posizione. Fate clic sul menu di progettazione sperimentale e selezionate Abilita esperimento multiblobloglio nel primo blocco per trovare l'esempio con un ingrandimento basso. Quindi, passare all'ingrandimento elevato e lasciare che l'area osservata al centro del campo visivo.
Impostare le informazioni sulla posizione e sulla pila Z. Quindi, seleziona l'intensità del laser appropriata, gli strati di scansione e la velocità di imaging. Una volta che tutti i blocchi sono stati configurati, impostare il numero appropriato di cicli e iniziare la registrazione.
Questo protocollo è stato utilizzato per iniettare un interleuchina-34 specifico per il fegato sul plasmide di espressione in embrioni di pesce transgenico, i macrofagi sono stati etichettati con GFP. L'ibridazione e l'immunosocienza a montaggio completo in situ sono state utilizzate per analizzare l'espressione dell'interleuchina-34 e dei macrofagi etichettati GFP. I numeri delle cellule macrofagi sono stati analizzati quantitativamente in interiettati e costruiscono la regione epatica e di coda degli embrioni iniettati.
L'imaging dal vivo è stato utilizzato per osservare direttamente i macrofagi, etichettati come verdi, passando dal fegato di un pesce di controllo e migrando nel fegato di un interleuchina-34 sull'espressione del pesce. I passaggi importanti di questo protocollo includono la selezione di una linea transgenica adatta per etichettare la cellula di interesse. E tessuto appropriato per l'imaging della tua espressione di gene transgenico e un'adeguata finestra di tempo di osservazione.
Questa tecnica potrebbe essere applicata per studiare la funzione di altre chemiochine sul comportamento di altre cellule, come cellule T e neutrofili in vivo.
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Panoramica
Questo studio indaga il ruolo di una chemiochina nel reclutamento dei macrofagi utilizzando modelli in vivo. I metodi impiegati includono l'ibridizzazione in situ su intero monte e l'imaging in vivo per osservare il comportamento dei macrofagi in tempo reale.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
Contesto
- I modelli esistenti di chemotassi cellulare spesso si basano su esperimenti in vitro.
- I modelli in vitro possono semplificare eccessivamente il complesso ambiente in vivo.
- L'osservazione diretta del comportamento cellulare è difficile nei tradizionali modelli mammiferi.
- Gli zebrafish offrono un vantaggio unico per lo studio della migrazione cellulare in vivo.
Obiettivo dello studio
- Esplorare la funzione di una specifica chemiochina.
- Analizzare il comportamento dei macrofagi in un organismo vivente.
- Migliorare la comprensione della chemotassi in un ambiente più rappresentativo.
Metodi utilizzati
- Ibridizzazione in situ su intero monte per la rilevazione delle chemiochine.
- Immunocolorazione per etichettare i macrofagi.
- Imaging in vivo per l'osservazione in tempo reale della migrazione dei macrofagi.
- Utilizzo di zebrafish come organismo modello.
Risultati principali
- Rilevazione con successo dell'espressione delle chemiochine in vivo.
- L'imaging in tempo reale ha rivelato dinamici modelli di migrazione dei macrofagi.
- I risultati suggeriscono che la chemiochina svolge un ruolo significativo nel reclutamento dei macrofagi.
- Dimostrazione dei vantaggi dell'utilizzo di zebrafish per tali studi.
Conclusioni
- Lo studio evidenzia l'importanza dei modelli in vivo per comprendere la chemotassi.
- I risultati possono influenzare future ricerche sulle risposte immunitarie.
- L'utilizzo di zebrafish può migliorare lo studio del comportamento cellulare in un ambiente complesso.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Direct in vivo modeling of chemokine-driven macrophage recruitment addresses a critical gap in translational immunology by enabling quantitative, real-time analysis of cell migration within a physiologically relevant context. This zebrafish-based workflow supports predictive confidence in target validation and de-risks early discovery decisions by providing robust, quantitative outputs on immune cell behavior. The approach enhances portfolio triage by clarifying the functional impact of chemokine modulation in a living system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of chemokine targets in a live vertebrate system.
- Supports biological de-risking by revealing in vivo cell migration dynamics.
- Provides quantitative evidence for target engagement and pathway relevance.
- Facilitates predictive confidence in advancing chemokine-modulating assets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, fluorescently labeled macrophage models for downstream screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of cell recruitment and localization.
- Supports assay standardization for compound evaluation targeting chemotaxis pathways.
- Enables scalable imaging workflows for comparative analysis across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vivo cell migration data with disease-relevant immune mechanisms.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of chemokine function.
- Supports risk-adjusted advancement by linking mechanistic findings to translational endpoints.
- Facilitates biomarker identification for immune cell recruitment in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This ectopic chemokine expression model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of immune cell recruitment in vivo, supporting both target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Quantifies macrophage migration in response to chemokine overexpression, clarifying pathway function.
- Screening: Provides standardized, reproducible imaging and cell counting outputs for assay development.
- Analytics: Enables statistical comparison of cell numbers and localization between experimental groups.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to disease-relevant immune responses in vertebrate models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other chemokines and immune cell types for broader portfolio application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in chemokine target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish transgenesis and live imaging techniques.
- Demands access to confocal microscopy and quantitative image analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptable to other immune cell types and chemokines with appropriate transgenic lines.
- Dependent on precise timing and tissue selection for optimal observation windows.
