Name: Tecnologia a cellule incapsulate per la consegna dei biologici allocchio del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Scopri la microincapsulazione con alginato per la somministrazione di biologici nell'occhio del topo. Questo metodo consente il rilascio prolungato di agenti terapeutici minimizzando le reazioni immunitarie.

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Lo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni assegnate a B. R. dai National Institutes of Health (R01EY019320), dal Department of Veterans Affairs (RX000444 e BX003050) e dal South Carolina SmartState Endowment.

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con la dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca ophtalmic e Vision e sono stati approvati dalla Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee sotto il protocollo ID 00399.
1. Cultura cellulare
<ol><li>Generare cellule epiteliali del pigmento reticolare umano (ARPE-19) linea cellulare esprimendo stabilmente il gene di scelta secondo i protocolli pubblicati14,15.</li>
	<li>Mantenere le cellule nel Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrate con 10% siero bovino fetale (FBS).</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 e 5% di CO2.</li>
	<li>Sostituire il supporto ogni 2-3 giorni.</li>
	<li>Passare le cellule dopo aver raggiunto 70%-80% confluenza utilizzando le procedure di coltura tissutale standard.</li>
</ol>2. Incapsulamento delle celle
<ol><li>Mescolare l'alginato di sodio con l'acqua deionizzata (DI) per una concentrazione finale del 2% w/v e purificare per filtrazione con un filtro di siringa sterile da 0,2 m.</li>
	<li>Preparare le cellule da mescolare con la soluzione alginata prostrando, centrifugandole e lavandole con una soluzione salina tamponata da 10 mM HEPES (pH - 7,4). Utilizzando un emocitometro, contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare finale a 1 x 106 in soluzione alginata. NOT:</</c1> Il processo di incapsulamento deve essere eseguito all'interno di un cappuccio sterilizzato.</li>
	<li>Caricare 300 aliquote di alginato e miscela di cellule in una siringa da 3 mL e attaccarla a una pompa di siringa. La soluzione sarà pompata attraverso un ago da 30 G con punta smussata in un bagno sterile in gelling posto in uno sterile becher 50 mL sotto la punta della siringa a 7 mm per un ago per il bagno distanza di spruzzatura.</li>
	<li>Il bagno gelling contiene un volume di 40 mL di 10 mM HEPES tampinato su saliera contenente 100 mM di cloruro di calcio (CaCl2) e 0,5% w/v poly-L-ornithine (PLO). L'OLP è un rivestimento polimerico secondario che può essere omesso o modificato in base alle esigenze dello sperimentatore.</li>
	<li>Regolare la tensione e la portata e mantenerle entrambe costanti durante il processo di incapsulamento a una portata di 60 mm/h e una tensione iniziale di 6,0 kV per produrre microcapsule di 150 m.</li>
	<li>Collegare la clip di filo anodo (rosso) di una punta dell'ago generatore ad alta tensione all'ago e collegare la clip di terra (nero) al filo di rame che è a metà strada immersa nel bagno gelling. Un lotto della miscela algerata : miscela cellulare (1 mL) impiega circa 30 min per preparare le cellule incapsulate (circa 25.000 microcapsule).</li>
	<li>Lavare due volte le microcapsule formate contenenti cellule con soluzione di lavaggio (10 mM HEPES salina tamponata contenente 1,5 mM CaCl2, pH - 7,4). Non utilizzare PBS per il lavaggio.</li>
	<li>Incubare le cellule incapsulate con il 10% di supporti DMEM integrati FBS in un'incubatrice umidificata a 37 e 5% di CO2. NOT:</</c5> Gli strumenti di processo di incapsulamento sono illustrati nella Figura 1.</li>
</ol>3. Conferma che l'incapsulamento non influisce sulla vitalità delle celle
<ol><li>Dopo aver incubato le cellule incapsulate per 24 h nei supporti, preparare un piccolo campione di 500 l (30 capsule da 30 dollari) per la colorazione.</li>
	<li>Lavare le microcapsule 2x utilizzando una soluzione di lavaggio (10 mM HEPES tamponata su una salina contenente 1,5 mM CaCl2) e macchiarle per la vitalità morta utilizzando un kit di analisi vivo/morto.</li>
	<li>Preparare una miscela di colorazione di calceina AM (acetoxymethyl) ed ethidium homodimer-1 a concentrazioni finali di 2 m e 4 M, rispettivamente.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL della miscela di colorazione alle cellule incapsulate e incubare per 30-45 min al buio a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Con attenta aspirazione, aspirare la soluzione di colorazione e lavare le microcapsule 2x con la soluzione di lavaggio. Utilizzare un sistema di microscopio fluorescente per osservare e immaginare le cellule incapsulate. NOT:</</c1> La documentazione dell'incapsulamento è illustrata nella Figura 2.</li>
</ol>4. Conferma che le capsule sono della dimensione appropriata per la consegna e la consegna del biologico
<ol><li>Le iniezioni intravitrali nell'occhio di un topo vengono in genere eseguite con un ago da 27 G con la punta smussata (diametro interno di 210 m) attaccato a una siringa Hamilton da 2,5 luna.</li>
	<li>Generare capsule che vanno da 100 a 200 m, diluirle in supporti senza siero e tirarle con cura nella siringa Hamilton. PBS non è un veicolo adatto, in quanto le capsule altnate si dissolveranno in PBS.</li>
	<li>Espelle lentamente 1 goccia di llà contenenti capsule su un vetrino al microscopio e determinarne l'integrità utilizzando un microscopio verticale a campo luminoso.</li>
	<li>Regolare le dimensioni della capsula (vedere il punto 2.3) regolando di conseguenza la tensione e la portata. Le microcapsule più piccole sono prodotte in modo non lineare aumentando la tensione e riducendo leggermente la portata8. Nelle nostre mani, capsule di 150 m di diametro si sono rivelate le più adatte. La regolazione della dimensione della capsula dipende anche dal mantenere costante la concentrazione di alginato modificando gli altri parametri.</li>
	<li>Mantenere un set separato di cellule in capsule della dimensione appropriata nel mezzo senza siero per determinare la quantità di secrezione del biologico desiderato. Utilizzare ELAISA sensibili o gonfiazioni occidentali per determinare la concentrazione dei biologici nel supernatante.</li>
	<li>Determinare la quantità necessaria di capsule che devono essere iniettate in base alla NOTa PK/PD (farmacocinetica/farmacodinamica) della terapia. Nelle nostre mani, 10 capsule per occhio di topo dimostrato di essere più efficace.</li>
</ol>5. Consegna di capsule nel mouse Vitreous
<ol><li>Eseguire iniezioni intravitriche utilizzando un microscopio dissezioso. Vedere la figura 3 per la configurazione chirurgica e i materiali utilizzati durante la procedura. Un protocollo dettagliato per iniezioni intravitreous può essere trovato altrove16.</li>
	<li>Anestetizza i topi mediante iniezione intraperitoneale di xilosina e ketamina (20 mg/kg e 80 mg/kg) o altri anestetici preferiti approvati dal comitato per la cura e l'uso degli animali dell'istituto specifico. Assicurarsi la profondità appropriata di anestesia utilizzando un pizzicodi 17.</li>
	<li>Dilatare le pupille di topo con fenilefrina HCL (2,5%) e solfato di atropina (1%) per consentire una buona visibilità della camera vitrea e applicare un gel per gli occhi lubrificante agli occhi per mantenerli idratati durante la procedura.</li>
	<li>Puntura della sclera al limbo con un ago da 26 G come foro guida, assicurandosi che 1) l'ago sia ad un angolo di 45 gradi con l'occhio e il tavolo e 2) la punta smussata è rivolta verso l'alto per evitare di forare la lente.</li>
	<li>Inietta con attenzione le capsule usando un ago da 27 G con punta smussata attaccato a una siringa Hamilton con un angolo di 45 gradi sotto ispezione visiva, assicurandoti di evitare di toccare l'obiettivo con l'ago. La lesione della lente porterà alla formazione della cataratta. Le capsule devono essere visibili nel vitreous utilizzando il microscopio dissettante (Figura 4A).</li>
	<li>Dopo la retrazione dell'ago, trattare il sito di iniezione con unguenti antibiotici neomicina e solfati di polimyssina B oltre all'unguento antibiotico oftalmico dexamethasone.</li>
	<li>Applicare la soluzione oftalmica goniotaire demulcente (2,5%) ad entrambi gli occhi per evitare che le cornee si asciughino durante il periodo di recupero.</li>
	<li>Posizionare il mouse su una piastra di riscaldamento tenuto a 37 gradi centigradi e monitorare fino a quando non è completamente sveglio.</li>
	<li>Un'iniezione di successo di cellule ARPE-19 incapsulate dovrebbe rivelare la presenza di capsule intatte nella camera vitrea del topo con solo piccole quantità di detriti quando si immagina l'occhio con tomografia a coerenza ottica o altri metodi (Figura 4B).</li>
	<li>L'occhio del topo iniettato, dopo alcuni giorni di recupero a causa dell'intervento chirurgico, è ora pronto per il paradigma sperimentale a portata di mano. NOT:</</c5> L'impostazione chirurgica e la documentazione delle capsule nell'occhio sono illustrati rispettivamente nella Figura 3 e Figura 4.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+systems%3A+entering+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drug delivery systems: entering the mainstream.</a> Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).</li>
<li>Tonnesen, H. H., Karlsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+in+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+and+Industrial+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Alginate in drug delivery systems.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).</li>
<li>Vilos, C., Velasquez, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+strategies+based+on+polymeric+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic strategies based on polymeric microparticles.</a> Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).</li>
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<li>Huang, S., Fu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+materials-based+cell+and+drug+delivery+systems+in+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration.</a> Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).</li>
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<li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term%2C+sustained+intraocular+delivery+of+a+VEGF+antagonist+using+encapsulated+cell+technology+implant+for+the+treatment+of+choroidal+neovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455(2012).</li>
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<li>Jove Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Holz, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+Safety+of+Lampalizumab+for+Geographic+Atrophy+Due+to+Age-Related+Macular+Degeneration%3A+Chroma+and+Spectri+Phase+3+Randomized+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).</li>
<li>Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+inhibition+as+a+therapeutic+strategy+in+retinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).</li>
<li>Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Non+Membrane-Targeted+Human+Soluble+CD59+Attenuates+Choroidal+Neovascularization+in+a+Model+of+Age+Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19078(2011).</li>
<li>Vincent, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+combination+PDGF+%2F+VEGF-antagonist+ECT+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290(2013).</li>
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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Questa tecnica di incapsulamento delle cellule è relativamente veloce e facile da eseguire; tuttavia, per ottenere risultati accurati a valle, è necessario tenere presenti alcuni punti. Le cellule devono essere mantenute in coltura in un piatto Petri prima dell'incapsulamento e tenute a giusta confluenza. L'incapsulamento deve essere eseguito in una corretta cappa di ventilazione con flusso d'aria regolato, se possibile. Troppo forte di una corrente d'aria può influenzare la formazione di capsule, soprattutto negli esper...

Le terapie basate sulle cellule rappresentano tecniche biologiche rivoluzionarie che sono state ampiamente applicate in medicina. Recentemente, sono stati applicati con successo nel trattamento di malattie neurodegenerative, malattie degli occhi, e il cancro. Le terapie cellulari coprono un'ampia gamma di campi, dalla sostituzione cellulare alla somministrazione di farmaci, e questo protocollo si concentra su quest'ultimo. Le microcapsule alginate biodegradabili (MC) hanno dimostrato l'efficacia come sistema di somministrazione e stanno diventando ampiamente utilizzate in campo biomedico. Alginato è stato utilizzato in microincapsulazione grazie al suo semplice processo di gelling, biodegradabilità, eccellente biocompatibilità e stabilità in condizioni in vivo41,2,3.
Il metodo dell'elettrospray, come tecnica di microincapsulamento, è stato utilizzato con successo per incapsulare peptidi e proteine utilizzando algerino (polimero di base) e poli-l-ornitina (polimero di rivestimento secondario). Entrambi i polimeri sono naturalmente trovati e utilizzati per la loro biocompatibilità5,6,7. Tuttavia, la sfida principale nelle terapie basate sulle cellule è la soppressione del sistema immunitario dell'ospite per evitare effetti collaterali causati da farmaci immunosoppressori. La permeabilità delle microcapsule algonate è considerata una proprietà adatta per l'incapsulamento cellulare, che consente la diffusione di nutrienti, rifiuti e fattori terapeutici all'interno e all'esterno delle cellule mascherandoli dalla risposta immunitaria dell'ospite8,9,10.
Nell'occhio, le cellule incapsulate sono state utilizzate negli studi clinici per la consegna costante di biologici (cioè fattori di crescita11,12 e antagonisti fattore di crescita13) per il trattamento della retinite pigmentosa o degenerazione maculare legata all'età. Altri obiettivi come gli inibitori del complemento14 sono attualmente in fase di esplorazione in ambienti preclinici.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 3 mL</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1" Ago smussato</td><td>SAI Tecnologia di infusione</td><td>B30-100</td><td></td></tr><tr><td>Acido alginico sale sodico, da alghe brune</td><td>Sigma</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>Atropina Solfato Soluzione oftalmolica (1%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-215-15</td><td>per dilatazione pupillare</td></tr><tr><td>BD Siringa da 1 ml 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm)</td><td>Becton, Dickinson e L'azienda</td><td>DG518105 500029609 REF 309625</td><td>per generare il foro guida</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio, anidro, granulare</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal Tears</td><td>Alcon</td><td>NDC 0078-0429-47</td><td>per lubrificare gli occhi durante l'anestesia</td></tr><tr><td>Goniotaire: Ipromellosa (2,5%) Soluzione demulcente oftalmolica (sterile)</td><td>Altaire Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 59390-182-13</td><td>per lubrificare gli occhi durante l'anestesia</td></tr><tr><td>Punta dell'ago/siringa di Hamilton: 27 G, Small Hub RN NDL, lunghezza custum (12 mm), stile di punta 3, 6/PK</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>per la somministrazione intravitreale di capsule</td></tr><tr><td>Siringa di Hamilton: 2,5 &; L, Modello 62 RN SYR, NDL Venduto separatamente</td><td>Hamilton</td><td>7632-01</td><td>per la somministrazione intravitreale di capsule</td></tr><tr><td>Tampone HEPES, 1 M</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP299100</td><td></td></tr><tr><td>Generatore ad alta tensione</td><td>ESD EMC Technology</td><td>ES813-D20</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornitina cloridrato, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12111</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina e Polimixina B Solfato e Desametasone Unguento oftalmolico</td><td>SANDOZ</td><td>NDC 61314-631-36</td><td>antibiotico per prevenire l'infezione dopo iniezione intravitreale</td></tr><tr><td>Fenofenefrina cloridrato Soluzione oftalmolica (2,5%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-201-15</td><td>per dilatazione pupillare</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile filtri, 0,2 &mu; m</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>GRASEBY</td><td>MS16A</td><td></td></tr></tbody></table>

tecnologia a cellule incapsulate per la consegna dei biologici all'occhio del mouse

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Molte terapie attuali in fase di sviluppo per le malattie del polo posteriore dell'occhio sono biologiche. Questi farmaci devono essere somministrati frequentemente, in genere tramite iniezioni intravitrali. Le cellule incapsulate che esprimono il biologico di scelta stanno diventando uno strumento per la produzione e il rilascio di proteine locali (ad esempio, tramite la somministrazione di farmaci a lungo termine). Inoltre, i sistemi di incapsulamento utilizzano materiali permeabili che consentono la diffusione di nutrienti, rifiuti e fattori terapeutici all'interno e all'esterno delle cellule. Ciò si verifica mentre si mascherano le cellule dalla risposta immunitaria dell'ospite, evitando la necessità di soppressione del sistema immunitario dell'ospite. Questo protocollo descrive l'uso dell'algerino come polimero nel microincapsulamento accoppiato con il metodo elettrospray come tecnica di microincapsulazione. Le cellule ARPE-19, una linea cellulare RPE umana che nasce spontaneamente, è stata utilizzata in esperimenti di terapia cellulare a lungo termine a causa della sua funzionalità di durata, ed è usato qui per incapsulare e consegnare le capsule agli occhi del topo. Il manoscritto riassume i passaggi per la microincapsulazione cellulare, il controllo qualità e la consegna oculare.

Le cellule ARPE-19 sono una linea cellulare UMANA RPE immortalata spontaneamente che ha dimostrato di essere suscettibile di incapsulamento e sopravvivenza a lungo termine dopo l'impianto di capsule nell'occhio. Gli strumenti per l'incapsulamento algerato sono illustrati nella Figura 1. In questo studio, è stato dimostrato che dopo l'incapsulamento in algerino, le cellule in capsule altnate sono state confermate da immagini a campo luminoso (Figura 2A). I saggi ...

Presentato qui è un protocollo per l'uso dell'alginato come polimero nel microincapsulamento di cellule immortalate per la consegna a lungo termine di biologici agli occhi dei roditori.

Tecnologia a cellule incapsulate per la consegna dei biologici all'occhio del mouse

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Questa tecnica è un modo affidabile per fornire qualsiasi contenuto come farmaci, proteine o cellule in luoghi specifici in tessuti o animali. È possibile tenere traccia della consegna e ottimizzare il rilascio del contenuto in base all'esperimento che si desidera. Può essere usato per trattare numerose malattie dalla guarigione delle ferite alle malattie oculari e cardiache.Il principale vantaggio di questo metodo è la capacità di fornire cellule terapeutiche utilizzando microcapsule alginate ai siti bersaglio senza causare reazioni immunitarie e mantenere un parto prolungato di terapie appena secrete per un periodo di tempo più lungo. Inizia coltivando cellule epiteliali retiniche secondo le indicazioni manoscritte. Passare le cellule quando raggiungono il 70-80% di confluenza utilizzando procedure standard di coltura tissutale.Per incapsulare le cellule, mescolare l'alginato di sodio con acqua deionizzata per una concentrazione finale del 2% di peso in volume e purificare la miscela tramite filtrazione con un filtro siringa sterile da 0,2 micrometri. Tripinare, centrifugare e lavare le cellule con soluzione salina tamponata HEPES da 10 millimolare. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare finale a un milione per un millilitro di soluzione di alginato.Caricare 300 aliquote microlitri dell'alginato e le cellule si mescolano in una siringa da tre millilitri e attaccarla a una pompa per siringhe. Preparare un bagno gelificante secondo le indicazioni manoscritte e posizionare in un becher sterile da 50 millilitri sotto la punta della siringa con un ago di sette millimetri per bagnare la distanza di spruzzatura. Regolare la tensione a otto kilovolt e la portata a 30 millimetri all'ora per produrre microcapsule di dimensioni di circa 150 micrometri.Collegare la clip di terra nera al filo di rame che è a metà del bagno di gelata e collegare la clip del filo anodo rosso all'ago. Ci vogliono circa 30 minuti per preparare le cellule incapsulate da ogni lotto di millilitro dell'alginato e della miscela cellulare. Una volta formate, lavare due volte le microcapsule con soluzione di lavaggio e incubarle con mezzi DMEM integrati al 10%FBS in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5%CO2.Dopo un'incubazione 24 ore su 24, preparare un campione di microcapsule da 500 microliter per la colorazione lavandoli due volte in soluzione di lavaggio. Utilizzare un kit di saggi LIVE/DEAD per macchiarli per la vitalità. Per assicurarsi che le microcapsule siano dimensionate in modo appropriato, diluirle in mezzi senza siero.Aspirateli con cura con una siringa Hamilton da 2,5 microliter. Espellere lentamente un microlitro cadere su uno scivolo del microscopio e determinare l'integrità delle microcapsule utilizzando un microscopio Brightfield verticale. In un topo opportunamente anestetizzato, applicare il lubrificante oculare per mantenere l'umidità degli occhi e utilizzare un ago per siringhe smussato da 26 gauge da 3/8 pollici per stabilire una puntura oculare iniziale appena sotto il limbo.Assicurarsi di avvicinarsi all'occhio da una direzione nasale con un angolo di 45 gradi mantenendo la punta smussata verso l'alto per evitare la perforazione dell'obiettivo. Successivamente, assicurarsi che l'intera punta dell'ago sia inserita nell'occhio per la generazione del foro guida, ma fare attenzione a non andare troppo lontano e forare la retina temporale. Una volta completato questo, ritrarre lentamente l'ago.All'interno del micromanipolatore, posizionare una siringa Hamilton a punta smussata calibro 27 da 27 calibri riempita con soluzione di capsula e allineare l'ago con il foro guida iniziale. Tenere la testa dell'animale in una posizione stabile e manovrare deliberatamente l'ago verso l'occhio. Per garantire una corretta posizione dell'ago all'interno del vitreo, inserire la siringa fino a quando la punta dell'ago non può essere visualizzato dietro l'obiettivo.Quindi iniettare lentamente la soluzione della capsula nel corso di 25-30 secondi. E una volta completata, ritrarre gradualmente la siringa con punta smussata per ridurre al minimo le lesioni all'occhio. Se necessario, regolare la dimensione della capsula regolando la tensione e la portata in base alle direzioni del manoscritto.L'incapsulamento delle cellule nell'alginato è stato confermato con l'imaging Brightfield e un test LIVE/DEAD ha dimostrato che il 90% delle cellule erano post-incapsulamento praticabili. La vitalità a lungo termine delle cellule è stata assicurata sciogliendo le capsule in citrato di sodio e ripiazzando. L'iniezione intravitreale è stata eseguita sotto ispezione visiva che ha permesso la visualizzazione delle capsule nel vitreo.Quando si tenta questa procedura, non utilizzare PBS per alcuna procedura di lavaggio perché PBS dissolve le microcapsule alginate formate. Dopo il suo sviluppo, il nostro laboratorio viene utilizzato come sistema di consegna per trattare forme di insufficienza cardiaca e ipertensione. Questa tecnica è considerata uno strumento promettente per il futuro trattamento di diverse malattie cardiovascolari e neurologiche.

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Bioengineering

Bioingegneria

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Modello murino di endoftalmite batterica: un metodo per generare endoftalmite batterica tramite iniezione intravitreale di sospensione batterica nell'occhio del topo

Questo video mostra una tecnica di somministrazione potenziata dalla convezione (CED) per la somministrazione di anticorpi nel cervello del topo. Il cranio di un topo anestetizzato viene esposto e viene creato un foro di bava nell'area bersaglio per la somministrazione di anticorpi. Un catetere a gradini contenente anticorpi viene inserito nel sito target e, tramite una pompa di infusione, viene creato un gradiente di pressione per erogare gli anticorpi a una velocità controllata.

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L'iniezione sottoretinica è una tecnica chirurgica per la consegna efficace di geni all'epitelio pigmentato retinico nell'occhio del topo.  Qui descriviamo un metodo semplice e replicabile per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico in topi sperimentali.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

Qui dimostriamo un nuovo approccio all'utilizzo di tomografia a coerenza ottica spectral-domain ad alta risoluzione (HR-SD-OCT) per assistere la consegna degli agenti di terapia genica nello spazio subretinal, valutare la sua copertura area e caratterizzano la vitalità del fotoricettore.

Tomografia ottica di coerenza di risoluzione ultraelevata Mouse per aiutare l'iniezione intraoculare nella ricerca retinica terapia genica

Descriviamo qui un metodo di iniezione intravitreale e la successiva quantificazione batterica nel modello di topo di endoftalmite batterica. Questo protocollo può essere esteso per misurare le risposte immunitarie dell'ospite e l'espressione batterica e genica ospite.

Iniezione intravitreale e quantificazione dei parametri di infezione in un modello di topo di endoftalmite batterica

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare in modo non invasivo la distribuzione spazio-temporale dei liposomi nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.

Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche

Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Scopri la microincapsulazione con alginato per la somministrazione di biologici nell'occhio del topo. Questo metodo consente il rilascio prolungato di agenti terapeutici minimizzando le reazioni immunitarie.

Tecnologia a cellule incapsulate per la consegna dei biologici all'occhio del mouse

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