Un sistema microfisiologico intestino/fegato per la valutazione farmacocinetica e tossicologica

I sistemi microfisiologici hanno la capacità di emulare la farmacocinetica e la risposta tossicologica del corpo umano a trattamenti specifici di interessi. I sistemi microfisiologici hanno il potenziale per sostituire i test sugli animali in quanto il loro uso può migliorare il potere predittivo dei metodi in vitro e ridurre il costo e il tempo degli studi farmacocinetici e tossicologici. 24 ore prima della somministrazione della sostanza in esame, dividere un'aliquota di 800 microliter del mezzo William ES tra i compartimenti più grandi e più piccoli del chip a due organi e aspirare il mezzo basolaterale e apicali da ogni equivalente barriera intestinale nelle 24 piastre del pozzo preparate.

Utilizzando forcep sterili, integrare un inserto per due circuiti di chip per organo nel vano più grande e aggiungere 200 microlitri di DMEMS al lato apicali. Utilizzando ampie punte di foro, integrare 20 equivalenti epatici per circuito nel compartimento più piccolo del chip dei due organi e collegare il sistema all'unità di controllo. Quindi collegare l'unità di controllo a un alimentatore d'aria pressurizzato e impostare la pressione su circa più o meno 300 barre e una frequenza di pompaggio di 0,3 Hertz.

Il giorno successivo diluire la soluzione di acetaminofene stock a una concentrazione di 12 micromolari. Per sostituire il mezzo nel sistema, aspirare il mezzo basolaterale e apicali dall'equivalente barriera intestinale nel chip a due organi e aggiungere 500 microlitri di nuovo mezzo di coltura appropriato nel grande compartimento sul lato basolaterale organoide e 300 microlitri al piccolo compartimento. Dopo aver verificato la presenza di bolle, emulare la somministrazione orale con l'aggiunta di 200 microlitri di una soluzione di acetaminofene micromolare sul lato apicico degli inserti della coltura intestinale e collegare il sistema microfisiologico alla centralina.

Raccogliere il volume totale sia dal lato intestinale apicali che basolaterali, nonché dal piccolo compartimento in triplice copia nei punti temporali indicati. Una volta raccolti tutti i campioni, impostare tutti i parametri rilevanti per l'analisi HPLC come indicato nella tabella e filtrare la fase mobile attraverso un filtro a membrana da 0,4 micron sotto vuoto. Quindi filtrare i campioni attraverso un filtro siringa PVDF di dimensioni dei pori da 0,22 micron e conservare i campioni in una fiala prima di iniziare la misurazione UV HPLC.

Per valutare la vitalità organoide, trasferire tutti i 20 sferoidi da ciascuno replicare a singoli pozzi di una piastra da 96 pozza e trasferire gli inserti di coltura cellulare in singoli pozzi di una piastra di 24 pozza. Lavare gli equivalenti tissutali tre volte con DPBS fresco per lavaggio e aggiungere 300 microlitri di una soluzione MTT milligrammo per millilitro ad ogni pozzo sperimentale. Dopo un'incubazione di tre ore nell'incubatore di coltura cellulare, sostituire la soluzione MTT con 200 microlitri di isopropanolo per pozzo per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius per estrarre l'MTT formazan dall'intestino e dagli equivalenti epatici.

La mattina seguente, trasferire 200 microlitri di ogni supernatante al pozzo appropriato nella piastra del pozzo 96 e leggere il formazan su un lettore di lastre a 570 nanometri per consentire il calcolo della capacità relativa delle cellule di ridurre l'MTT utilizzando la densità ottica media di ogni punto di tempo rispetto al controllo negativo. Per l'analisi citochimica e istologica dei campioni, fissare prima l'intestino e gli equivalenti epatici in paraformaldeide al 4% in PBS molare 0,1 per 25 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare gli organoidi cinque volte in PBS per 10 minuti per lavaggio, prima di macchiare gli equivalenti intestinali e epatici con tetrametilhodamina isotiocianato phalloidin Alexa Fluor 647 phalloidin per un'ora a temperatura ambiente.

Alla fine dell'incubazione, trasferire i campioni sul mezzo di congelamento per alcuni minuti prima di congelare i tessuti in azoto liquido. Successivamente, utilizzare un criostato per acquisire crio-sezioni di crioide epatiche spesse da 10 a 12 micron e montare le sezioni tissutali in mezzo di montaggio con DAPI per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza confocale. Per la colorazione mitocondriale e nucleare, coprire completamente i campioni con soluzione di colorazione mitocondriale per un'incubazione da 15 a 45 minuti a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con 5% di anidride carbonica.

Al termine dell'incubazione, sostituire con cura la soluzione di colorazione con paraformaldeide dal 2 al 4% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo il fissaggio, sciacquare delicatamente le cellule due volte con PBS fresco per cinque minuti per lavaggio prima di etichettare i campioni con soluzione di lavoro di colorazione dell'acido nucleico per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con lavaggi di tre, cinque minuti in PBS protetti dalla luce e utilizzare la macchia di acido nucleico per facilitare la quantificazione del numero di macchie mitocondriali che esprimono cellule su un microscopio fluorescente con i set di filtri appropriati.

L'integrazione della barriera intestinale umana e di un equivalente epatico in un dispositivo microfluidico a due chip d'organo consente di valutare le proprietà farmacocinetiche e tossicologiche dei trattamenti di interesse. Dopo il trattamento, i campioni di supporti possono essere analizzati da HPLC. Gli organoidi possono essere analizzati per la loro espressione genica, i valori di resistenza elettrica transeteliale, l'espressione e l'attività proteica, nonché per le loro caratteristiche morfologiche.

L'analisi MTT può essere eseguita per valutare la fattibilità organoide, nonché per rilevare eventi tossici molto precoci in risposta al trattamento con acetaminofene. Il flusso del supporto non influisce significativamente sull'assorbimento dell'acetaminofene, mentre migliora significativamente la funzionalità equivalente epatica, indicando che l'assorbimento dell'acetaminofene intestinale umano e il metabolismo epatico possono essere emulati in questo sistema microfisiologico. I sistemi microfisiologici hanno il potenziale per sostituire i modelli animali nello sviluppo e nella scoperta di farmaci in quanto imitano meglio la fisiologia umana e possono essere utilizzati per promuovere lo sviluppo di farmaci a una velocità più elevata e a costi inferiori per rischio e complessità.