Name: Generazione di gradienti di farmaci eterogenei in tutte le popolazioni di cancro su un acceleratore evoluzione microfluidico per losservazione in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri la dinamica evolutiva del cancro con l'acceleratore evoluzione microfluidico per studi a lungo termine a livello di singola cellula. Questa tecnologia consente il monitoraggio in tempo reale di morfologia, motilità e migrazione cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato da NSF PHY-1659940.

1. Fabbricazione di dispositivi microfluidici
<ol><li>Generare il modello microfluidico desiderato utilizzando un software di progettazione del layout (vedere Materiali supplementari).</li>
	<li>Fabbricare la fotomaschera. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.<ol>
<li>Utilizzando uno scrittore laser, scrivere il modello su una lastra di vetro soda-lime rivestito con 100 nm di Cr e 500 nm di photoresist A-1518.</li>
		<li>Sviluppare il fotoresist con lo sviluppatore A300MIF per 60 s.</li>
		<li>Incidere il cromo senza protezione dal fotoresist utilizzando Cr-7 Chromium Etchant.</li>
		<li>Elimina il fotoresist residuo con una spogliarellista fotoresist a 70 gradi centigradi per 45 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pattern il fotoresist. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.<ol>
<li>Cappotto di rotazione HMDS su wafer di silicio a 4000 giri/min per 40 s.</li>
		<li>Spin cappotto fotoresist A4330 su wafer di silicio a 4000 rpm per 40 s.</li>
		<li>Cuocere il wafer di silicio a 95 gradi centigradi per 60 s.</li>
		<li>Utilizzare l'allineatore maschera per esporre i raggi UV al wafer di silicio.</li>
		<li>Sviluppare il fotoresist con lo sviluppatore A300MIF per 4 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'incisione DRIE. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.<ol>
<li>Asciugare il wafer modellato con il fotoresist utilizzando un sistema Silicon Deep Reactive Ion Etching (DRIE) per una profondità di 100 m.</li>
		<li>Spogliare il fotoresist con acetone e plasma inciso con un plasma etcher.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ossidazione e silanizzazione del wafer. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.<ol>
<li>Eseguire l'ossidazione termica sul wafer di silicio inciso in un forno a 1100 gradi centigradi per 1 h.</li>
		<li>Attendere che il wafer di silicio si raffreddi, quindi mettere il wafer in un desiccatore con qualche goccia di trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) gocciolava in un piccolo contenitore vicino al wafer.</li>
		<li>Pompare la pressione del desiccatore a 0,5 atm a temperatura ambiente per 60 min. Lo stampo del wafer di silicio dovrebbe diventare idrofobico dopo una corretta silanizzazione, che può essere testata aggiungendo diverse goccioline d'acqua sul wafer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Litografia morbida. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.<ol>
<li>Mescolare prepolimero e cross-linker (da kit polimetilsiloxane (PDMS) a un rapporto di peso 10:1.</li>
		<li>Versare il PDMS misto per creare una pellicola di 10 mm di altezza sullo stampo di wafer di silicio silanizzato.</li>
		<li>Degas il sistema di wafer PDMS-silicon risultante in un desiccatore per 30 min a 1 h.</li>
		<li>Incubare il wafer PDMS-silicon in un'incubatrice di 70 gradi centigradi durante la notte per curare il PDMS.</li>
		<li>Una volta che il PDMS è guarito, sbucciare con cura la pellicola PDMS dal wafer di silicio.</li>
		<li>Utilizzando aghi biopsia, perforare le porte di inserimento in base alla posizione del modello sul PDMS e utilizzare un punzone circolare per tagliare chip di 27 mm di diametro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legame strato PDMS.<ol>
<li>Il calore cura due pile di cilindri PDMS da 27 mm (senza patterning), che diventeranno lo strato di serbatoio e lo strato di tappatura del dispositivo.</li>
		<li>Ritagliare due cerchi da 7 mm intorno alle insenature sullo strato del serbatoio e utilizzare un ago biopsia per perforare i fori alle porte di ristoro sullo strato di tappatura.</li>
		<li>Legare tre pile di PDMS (stack modellato, strato di serbatoio, strato di tappatura) con trattamento al plasma di ossigeno.</li>
		<li>Con l'ago della biopsia, perforare i fori alle prese e alla porta centrale del dispositivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione della linea di file multimediali e celle
<ol><li>Preparare i supporti per la coltura di linee cellulari PC3, tra cui PC3-EMT e PC3-EPI: mescolare RPMI 1640 medio con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1x antibiotic-antimycotico. Generare le linee di cella come descritto in precedenza14. NOTA: le linee cellulari PC3 sono mantenute nei media di cui sopra in incubatrici umidificate a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Dividi le cellule e la sottocultura ogni 3 giorni, prima che raggiungano il 100% di confluenza.</li>
	<li>Le linee cellulari transfect con marcatori fluorescenti con etichettaci citoplasmase per una migliore visualizzazione, come descritto in precedenza12, in modo tale che PC3-EMT esprime GFP citoplasmica e PC3-EPI esprime mCherry citoplasmaco. Si noti che la tecnologia è compatibile anche con qualsiasi cella con etichetta fluorescente e con l'imaging a campo luminoso di cellule senza etichetta.</li>
</ol>3. Configurazione sperimentale
<ol><li>Fabbricazione del supporto per piastre metalliche<ol>
<li>Fabbricare un supporto di piastra sufficiente a contenere piatti di coltura simultanei permeabili a gas per esperimenti paralleli mediante lavorazione o stampa 3D. Il file CAD 3D ("piastra a 3 piani. FCStd") può essere trovato su GitHub come riferimento (https://github.com/kechihl/3-well-plate).</li>
		<li>Svitare i componenti del supporto (Figura 2) con un cacciavite. Disinfettare i componenti tramite esposizione ai raggi UV per almeno 1 h e lasciare in un ambiente sterile. NOTA: Il supporto è progettato per fornire condizioni sostanziali per l'equilibrio termico e composizioni ideali del gas, con insenature a canale di gas che consentono il flusso d'aria. Maggiori dettagli possono essere trovati nel nostro lavoro precedente12.</li>
		<li>Preparare fino a tre piatti di coltura permeabili al gas, di cui la membrana cellulare è relativamente flessibile.</li>
	</ol></li>
	<li>Seeding della linea cellulare<ol>
<li>24 ore prima dell'inizio dell'esperimento, raccogliere le cellule PC3-EPI e PC3-EMT propsinizzazione per 5 min. Aggiungere supporti di coltura preriscaldati, quindi centrificare a 150 x g per 3 min e scartare il supernatante.</li>
		<li>Contare le celle di ogni PC3-EPI e PC3-EMT utilizzando un emocitometro e isolare un totale di 2,5 x 104 di ogni tipo di cellula per ogni piatto di coltura permeabile per gas.</li>
		<li>Mescolare e risospendere i due tipi di cellule in 2 mL di mezzi di coltura e seminare le cellule in ciascuna delle parabole di coltura permeabili al gas.</li>
		<li>Lasciare l'intero supporto della piastra nell'incubatrice durante la notte per le cellule da attaccare.</li>
		<li>Disinfettare i dispositivi PDMS tramite esposizione ai raggi UV per almeno 1 h e lasciare in un ambiente sterile.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostazione dell'unità di controllo termico e del sistema di alimentazione del gas<ol>
<li>Come mostrato nella Figura 3, istituire un sistema di alimentazione del gas costituito da unità di controllo CO2 e O2, una pompa di gas, una camera di miscelazione a gas, un umidificatore o un gorgogliatore e tre set separati di valvole di gas e indicatori di pressione. Maggiori dettagli possono essere trovati nel nostro lavoro precedente12.</li>
		<li>Impostare le unità di controllo CO2 e O2 in modo da regolare il tasso di miscelazione del gas dai serbatoi CO2 e N2 e dalla sorgente O2. In alternativa, qualsiasi sistema di approvvigionamento di gas che fornisca gas in condizioni di ossia funzionerebbe.</li>
		<li>Assicurarsi che il gas combinato nella camera di miscelazione e umidizzato da un gorgogliatore in modo tale che l'umidità relativa sia aumentata fino all'85% (come letto da un monitor di umidità relativa) e che il gas porti a tre valvole di gas indipendenti con indicatori di pressione per controllare e monitorare la portata del gas nel supporto della piastra.</li>
		<li>Posizionare l'intero supporto della piastra in un'unità di controllo termico di incubazione in fase con sottounità di riscaldamento separate per il coperchio e la piastra inferiore, con tutte le unità impostate a 37 gradi centigradi. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.</li>
	</ol></li>
	<li>Installazione di dispositivo microfluidico. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.<ol>
<li>Identificare che i componenti dettagliati del supporto piastra 3-po sono in ordine, come in Figura 2. Ognuno dei tre pozzi sono identici e indipendenti, con un paio di canali di gas per ogni pozzo. Ogni pozzo possiede un portapiatti a gas permeabile, un supporto per chip PDMS, un supporto per finestre di vetro e un paio di finestre di vetro da 35 mm. Questi componenti possono essere assemblati utilizzando le viti montate. NOTA: Le finestre di vetro assicurano che vi sia uno spazio termoisolato tra la membrana di coltura permeabile a gas e il pozzo in modo che non si verifichi la condensa dell'acqua a causa delle differenze di temperatura all'interfaccia. Si noti che i 3 pozzi sono indipendenti e 3 esperimenti possono essere eseguiti separatamente.</li>
		<li>Mezzo di coltura pre-caldo a 37 gradi centigradi e degas in una camera a vuoto per 20 min.</li>
		<li>Trattare i chip PDMS utilizzando un sistema plasma di ossigeno per 30 s al fine di mantenere l'idrofiliacertezza.</li>
		<li>Impostare il sistema di siringhe. Caricare due siringhe lentamente con mezzi di crescita e altre due siringhe con il reagente di interesse desiderato (media, media con droga, ecc.). Collegare ogni singola siringa a un tubo da 50 cm (0,020" x 0,060"OD) con un ago da 23 G in un perno di acciaio cavo. Inserire un perno in acciaio cavo nell'altra estremità del tubo.</li>
		<li>Prime il tubo e inserire il perno d'acciaio in ogni chip PDMS attraverso lo strato di tappatura. Riempire il livello del serbatoio e umidare il pattern pattern PDMS con i supporti. Lo strato di serbatoio funziona come una trappola a bolle su chip per evitare che le bolle d'aria entrino nel modello microfluidico.</li>
		<li>Caricare una siringa da 1 mL con i supporti di coltura. Collegare la siringa a un tubo da 5 cm (0,020" x 0,060"OD) con un ago da 23 G che eroga in un perno d'acciaio cavo. Inserire un perno in acciaio cavo nell'altra estremità del tubo e prime il tubo.</li>
		<li>Inserire il perno in acciaio cavo nel foro centrale del chip, dove un numero eccessivo di supporti può essere estratto dal chip in un secondo momento durante il processo di sigillazione del chip.</li>
		<li>Poiché ogni dispositivo PDMS richiede quattro siringhe da 10 mL caricate su una pompa di siringa, caricare due siringhe da 10 mL per chip nel ponte di prua. Posizionare le altre due siringhe nel ponte di ritiro del sistema di siringhe.</li>
		<li>Posizionare il chip direttamente sopra le membrane di coltura permeabili al gas (con cellule già aderenti alle membrane). Per evitare di intrappolare microbolle nel modello microfluidico, erogare 1 mL di supporti preriscaldati e degassati nella parabola di coltura permeabile a gas di 35 mm prima dell'assemblaggio, quindi assicurarsi che il chip si avvicini alla superficie liquida con un angolo di inclinazione di 15 gradi.</li>
		<li>Bloccare il piatto di coltura a gas permeabile e il pozzo nel portapiatti a gas permeabile per ogni chip, con il titolare del chip PDMS che spinge il dispositivo PDMS verso il basso.</li>
		<li>Nastro adesivo su un sigillante sulla parte superiore del dispositivo PDMS e morsetto con il supporto del chip PDMS per evitare che il chip si secchi.</li>
		<li>Impostare la portata del flusso multimediale intorno all'array in modo che sia di 20 l/h.</li>
		<li>Impostare l'intera piastra nell'incubatrice sul palco sullo stadio motorizzato di un microscopio invertito. Collegare il sistema di alimentazione del gas ai canali del gas e pressurizzare la membrana di coltura a gas permeabile contro il chip PDMS installato per garantire la sigillazione del dispositivo. Mantenere la pressione del misuratore a 0,2 psi (1,4 x 104 Pa).</li>
		<li>Estrarre lentamente un numero eccessivo di supporti nel chip utilizzando la siringa da 1 mL dal foro centrale. Osservare il chip al microscopio mentre si estrae i supporti e quindi interrompere l'estrazione quando il chip è sigillato. La sigillazione dei trucili dovrebbe essere ovvia poiché una parte delle cellule verrebbe schiacciata dalle microstrutture.</li>
		<li>Collegare l'unità di rilevamento della temperatura dell'incubatrice sul palco alla piastra a 3 pozze tazzini e impostarla a 37 gradi centigradi.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imaging time-lapse a cella singola
<ol><li>Configurare il software di imaging utilizzando un microscopio invertito per l'acquisizione di immagini time-lapse. Si noti che per un esperimento EA è necessario un microscopio fluorescente invertito con stadio x-y completamente motorizzato, manopola di messa a fuoco, otturatore e cubo del filtro.</li>
	<li>Configura il software per acquisire immagini su due canali con ingrandimento 10 volte superiore per ogni chip con cucitura automatica delle immagini dopo un round di messa a fuoco automatica. Tieni presente che i sistemi di correzione automatica come Perfect Focus non garantiscono una qualità dell'immagine soddisfacente. Si consiglia di generare una superficie di messa a fuoco personalizzata per l'acquisizione di immagini a lungo termine in base alla messa a fuoco automatica o manuale sul chip.</li>
	<li>Prendere immagini ogni ora e lasciare esperimento in esecuzione sulla scala cronologica di settimane. Monitorare la qualità dell'immagine su base giornaliera e aggiornare la superficie di messa a fuoco, se necessario.</li>
	<li>Preparare il chip PDMS e la parabola di coltura permeabile a gas per la successiva analisi immunofluorescente, come descritto in precedenza13.</li>
</ol>5. Elaborazione e analisi delle immagini
<ol><li>Elaborazione post-sperimentale<ol>
<li>Converti le immagini in formato TIFF per l'elaborazione delle immagini e le misurazioni utilizzando Fiji/ImageJ.</li>
		<li>Comprimere i file TIFF per facilitare un'ulteriore elaborazione delle immagini.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi Fiji/ImageJ<ol>
<li>Per identificare le cellule, eseguire La sottrazione di sfondo e l'analisi delle particelle per identificare i punti luminosi fluorescenti per il rilevamento della posizione delle celle e il conteggio automatico delle celle.</li>
		<li>Utilizza i plugin (Manual Tracking, Chemotaxis, Migration Tool, Trackmate) per analizzare la motilità e la migrazione delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

La coltura cellulare convenzionale è stata sviluppata quasi un secolo fa e rimane il modello preclinico più frequentemente utilizzato nella ricerca biomedica, nonostante la sua comprovata capacità limitata di prevedere i risultati clinici nel cancro17. I modelli animali offrono la massima rilevanza fisiologica e una ragionevole somiglianza genetica con gli esseri umani, ma sono stati a lungo riconosciuti per avere limitazioni significative nella previsione degli esiti umani18</su...

Il cancro è stato sempre più riconosciuto come un ecosistema complesso che dipende non solo dalla continua disregolazione delle popolazioni di cellule mutate, ma anche dalle interazioni vitali tra le cellule tumorali e il microambiente ospite. In questo senso, il cancro si evolve su un paesaggio adattivo che si manifesta con una combinazione di fattori, tra cui un microambiente tumorale eterogeneo e un incrocio con una varietà di cellule ospiti, che contribuiscono a pressioni selettive per ulteriori cambiamenti epigenetici1,2,3. Nel contesto dei tumori solidi, la distribuzione irregolare della chemioterapeutica e di altre sfumature di risorse contribuisce alla loro eterogeneità molecolare e può svolgere un ruolo nello sviluppo della resistenza ai farmaci, una maggiore angiogenesi a particolari tumori sottopopolazioni, e anche metastasi4,5,6. Gli studi convenzionali sulla coltura cellulare 2D in vitro, pur possedendo una capacità sperimentale su larga scala e conveniente, forniscono condizioni mediche, uniformi e fisse, spesso prive del preciso controllo ambientale spaziale e temporale necessario per emulare la dinamica tumorale in vivo. Pertanto, è necessario disporre di modelli ex vivo più rappresentativi per riprodurre il microambiente tumorale prima dei modelli animali nella pipeline di sviluppo dei farmaci, al fine di una migliore previsione della progressione del cancro e di risposte ai farmaci all'interno dello stress dinamico Paesaggi. La microfluidica è stata proposta per colmare il divario tra studi sulla coltura cellulare 2D e studi sugli animali in vivo più complessi che potrebbero non essere in grado di sostenere studi quantitativi controllabili7,8,9.
Un sistema in vitro ideale per caratterizzare la dinamica delle cellule tumorali dovrebbe possedere la capacità di generare un microambiente eterogeneo per imitare le risposte cellulari adattabili che possono avvenire in un tumore, nonché consentire l'osservazione di queste dinamiche in un risoluzione a cella singola. In questo articolo, descriviamo una piattaforma di coltura cellulare microfluidica, un dispositivo basato su PDMS chiamato "Evolution Accelerator" (EA), che consente studi paralleli in vitro della dinamica delle cellule tumorali a risoluzione cellulare con acquisizione di dati in tempo reale corso di settimane, pur mantenendo stabilmente gradienti di stress in tutto il paesaggio culturale. La progettazione di questa piattaforma si basa sul nostro lavoro precedente, in cui le dinamiche evolutive degli organismi in una metapopolazione possono essere accelerate10,11. In particolare, in un gruppo di popolazioni separate spazialmente che interagiscono a un certo livello, quando esposte a un paesaggio di stress eterogeneo, le specie più in forma possono dominare in una popolazione locale più velocemente rispetto a quella di una grande popolazione uniforme. Le specie vantaggiose migrano quindi verso i microhabitat vicini in cerca di risorse e spazio, e alla fine dominano l'intera popolazione. Come mostrato nella Figura 1,il modello del chip EA microfluidico è composto da (i) una coppia di canali serpentini che forniscono una circolazione dei supporti freschi e costruiscono condizioni limite fisse per la diffusione chimica e (ii) la regione di coltura cellulare esagonale che consiste di 109 camere esagonali interconnesse e 24 camere semi-esagonali al centro, simile a una struttura a nido d'ape. Il chip è 100 m di profondità. I canali mediatici e la regione di coltura cellulare sono collegati con piccole fessure (larghe circa 15 m), che impediscono il flusso diretto dei media e il conseguente stress da taglio nell'area di coltura cellulare, ma consentono comunque alle sostanze chimiche di diffondersi attraverso piccole fessure e scambiare nutrienti, rifiuti metabolici, ecc. La generazione di gradienti chimici è illustrata nella Figura 1B, in cui un canale multimediale contiene 0,1 mM di fluoresceina mentre l'altro canale è privo di fluoresceina. Le cellule sono coltivate su una membrana permeabile a gas, incapsulata dalle microstrutture attraverso la pressione posteriore positiva sulla membrana contro il chip. I componenti del titolare del dispositivo sono illustrati nella Figura 2e la configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 3, dove la coltura viene mantenuta al microscopio invertito a 37 , con umidità relativa superiore all'85%, e condizionata in composizione del gas normoxia.
Questo sistema fornisce un'osservazione dettagliata delle interazioni cellulari localizzate tramite canali luminosi e fluorescenti e consente analisi a valle risolte nello spazio come l'immunofluorescenza, la macchia occidentale o la spettrometria di massa. In precedenza abbiamo dimostrato come una prova di principio di questo modello microfluidico cancro su chip sulla co-coltura a lungo termine delle cellule tumorali della prostata PC3 epiteria e mesenchymal12, nonché l'emergere di cellule poliploidi di resistenza ai farmaci 12 cellule tumorali utilizzando la linea cellulare PC3 epiteliale13. Mentre presentiamo l'applicazione di questa piattaforma per comprendere la dinamica spatiotemporale del PC3 epiteliale e delle cellule tumorali della prostata mesenchymal sotto un gradiente di stress di docetaxel, il sistema microfluidico può essere facilmente applicato a qualsiasi combinazione di linee cellulari e gradienti di risorse (ad es. droghe, nutrienti, ossigeno).

<table><tbody><tr><td>10 mL siringhe BD Luer-Lok tip</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>1x anti-anti</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>Merck KGaA</td><td>18441123163</td><td>Rivelatore fotoresist</td></tr><tr><td>AZ1518</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ1518</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>AZ4330</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ4330</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>Cr Mordenzante</td><td>al cromo Sigma-Aldrich</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>DWL66+</td><td>Fotomaschera da scrittura</td></tr><tr><td>Esametildisilazano (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379212</td><td>Per il miglioramento dell'adesione fotoresist</td></tr><tr><td>Perni cavi in acciaio</td><td>Nuovo Inghilterra Piccolo Tubo</td><td>NE-1300-01</td><td>&nbsp;. 025 OD .017 ID x .500 lungo / tipo 304 WD fullhard</td></tr><tr><td>ibidi Sistema di riscaldamento, piastre multi-pozzetto, K-Frame</td><td>ibidi</td><td>10929</td><td>Incubatore a tavolino&nbsp;</td></tr><tr><td>Ago di erogazione Luer-Lok 23 G</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Per collegare siringhe e tubi</td></tr><tr><td>Piatto Lumox 35</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.331</td><td>Piatto per colture cellulari permeabile ai gas</td></tr><tr><td>Microposit Remover 1165</td><td>Dow Electronic Materials</td><td>Microposit Remover 1165</td><td>Photoresist Stripper</td></tr><tr><td>Microseal B Sigillante adesivo</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>Adesivo sigillante</td></tr><tr><td>O-Ring (per la sigillatura della piastra Lumox)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K114</td><td>Trattino n. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70</td></tr><tr><td>O-Ring (per la sigillatura della finestra in vetro inferiore)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K74</td><td>Trattino n. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70</td></tr><tr><td>Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching</td> System <td>Plasmatic Systems, Inc</td><td>Plasma-Preen</td><td>Sistema al plasma di ossigeno</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Samco RIE800iPB DRIE</td><td>Samco</td><td>RIE800iPB</td><td>Sistema di mordenzatura a ioni reattivi profondi</td></tr><tr><td>Allineatore maschera Suss MA6 Allineatore</td> maschera <td>SUSS MicroTec</td><td>MA6</td>&<td>nbsp;</td></tr><tr><td>Elastomero siliconico Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Elastomero PDMS</td></tr><tr><td>Incisore al plasma TePla M4L Incisore</td><td>al plasma PVA TePla</td><td>M4L</td><td></td></tr><tr><td>Tricloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil-silano (PFOTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Per silanizzazione di wafer di silicio</td></tr><tr><td>Tubo microbore Tygon (0,020" x 0,060" OD)</td><td>Tubi Cole-Parmer</td><td>EW-06419-01</td><td> per la distribuzione di contenuti multimediali</td></tr></tbody></table>

generazione di gradienti di farmaci eterogenei in tutte le popolazioni di cancro su un acceleratore evoluzione microfluidico per l'osservazione in tempo reale

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

La coltura cellulare convenzionale rimane il modello preclinico più utilizzato, nonostante la sua capacità limitata di prevedere i risultati clinici nel cancro. Sono stati proposti modelli microfluidici cancero-su chip per colmare il divario tra le colture 2D convenzionali semplificate e i modelli animali più complicati, che hanno una capacità limitata di produrre risultati quantitativi affidabili e riproducibili. Qui, presentiamo un modello microfluidico cancro su chip che riproduce i componenti chiave di un microambiente tumorale complesso in modo completo, ma è abbastanza semplice da fornire solide descrizioni quantitative delle dinamiche tumorali. Questo modello microfluidico cancro su chip, l'"Acceleratore evoluzione", scompone una grande popolazione di cellule tumorali in una serie interconnessa di microambienti tumorali generando un paesaggio di stress chemioterapico eterogeneo. La progressione e la dinamica evolutiva del cancro in risposta al gradiente farmacologico possono essere monitorate per settimane in tempo reale, e numerosi esperimenti a valle possono essere eseguiti in complemento alle immagini time-lapse scattate nel corso degli esperimenti.

Convalida della crescita cellulare ottimale sul chip Uno degli obiettivi principali della piattaforma sperimentale è quello di riprodurre i componenti e le interazioni chiave in un microambiente tumorale complesso in modo completo, ma abbastanza semplice da fornire dati quantitativi, affidabili e riproducibili. Questo obiettivo può essere raggiunto solo se abbiamo il pieno controllo dei fattori ambientali fisici e biochimici. Dobbiamo escludere i fattori indesiderati o...

Vi presentiamo un modello microfluidico cancro su chip, la tecnologia "Evolution Accelerator", che fornisce una piattaforma controllabile per studi quantitativi a lungo termine in tempo reale della dinamica del cancro all'interno di condizioni ambientali ben definite a singola cellula livello. Si prevede che questa tecnologia funzionerà come modello in vitro per la ricerca fondamentale o lo sviluppo di farmaci preclinici.

Generazione di gradienti di farmaci eterogenei in tutte le popolazioni di cancro su un acceleratore evoluzione microfluidico per l'osservazione in tempo reale

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

Questo modello microfluidico on-chip sul cancro che chiamiamo acceleratore dell'evoluzione, fornisce una piattaforma controllabile per studi quantitativi a lungo termine e in tempo reale sulla dinamica del cancro in condizioni ambientali ben definite a un singolo livello cellulare. La tecnologia ci permette di sondare le dinamiche evolutive del cancro in un panorama di stress simile a un tumore. Fornire informazioni tra cui morfologia, popolazione, motilità e migrazione nel tempo a livello cellulare.Con la capacità di controllare e monitorare il comportamento delle popolazioni tumorali miste sotto gradienti di stress ben controllati, la nostra tecnologia può presentare un modello più fisiologicamente rilevante per lo sviluppo di farmaci preclinici. Il metodo di imballaggio di tenuta a pressione presentato può essere implementato anche in altri sistemi microfluidici che richiedono una sofisticata regolazione della composizione del gas ambientale e della capacità dell'esperimento a valle. La chiave per eseguire con successo un esperimento a lungo termine è garantire un ambiente fisicamente e biochimicamente stabile.I fattori tra cui temperatura, umidità e composizione del gas devono

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Abbiamo descritto un protocollo per la microfabbricazione del gradiente apparecchio che può generare microfluidi che possono generare gradienti spaziali e temporali ben definite microambiente. In questo approccio, il gradiente di generazione dispositivo a microfluidi può essere utilizzato per studiare la migrazione delle cellule diretto, l'embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi del cancro.

Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

Vi presentiamo la procedura per la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo a microfluidi che ricrea eterogenei microambienti...

Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

Descriviamo un test di sensibilità ai farmaci ad alto rendimento per cellule primarie di mieloma multiplo. Consiste in una ricostruzione del microambiente del midollo osseo (compresa la matrice extracellulare e lo stroma) in piastre multipozzetto e in un metodo non invasivo per la quantificazione longitudinale della vitalità cellulare.

Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

Il controllo dei gradienti chimici e di ossigeno è essenziale per le colture cellulari. Questo articolo riporta un dispositivo microfluidico in polidimetilsilossano-policarbonato (PDMS-PC) in grado di generare in modo affidabile combinazioni di gradienti chimici e di ossigeno per studi di migrazione cellulare, che può essere praticamente utilizzato nei laboratori biologici senza strumentazione sofisticata.

Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

Attraverso un'ampia varietà di indicazioni di malattia, modelli più fisiologicamente rilevanti sono in corso programmi di scoperta della droga sviluppata e implementata in. Il nuovo modello di sistema descritto qui di seguito viene illustrato come tridimensionale del tumore sferoidi possono essere coltivate e proiettati in un sistema basato su piastra 1536 pozzetti ad alta produttività per la ricerca di nuovi farmaci oncologici.

Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti

Descriviamo un metodo per costruire dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari. Questo dispositivo consente l'analisi delle risposte cellulari ai segnali solubili in microambienti 3D con gradienti chemioattrattante definiti. Gli organoidi sono meglio di cellule singole al rilevamento di ingressi rumorosi deboli.

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Questo protocollo descrive la generazione di sferoidi derivati dal paziente e l'analisi a valle, tra cui la quantificazione della proliferazione, il test di citotossicità, la citometria di flusso, la colorazione dell'immunofluorescenza e l'imaging confocale, al fine di valutare il farmaco potenziale dei candidati come terapie anti-neoplastiche. Questo protocollo supporta la medicina di precisione con l'identificazione di farmaci specifici per ogni paziente e lo stadio della malattia.

Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali

Questo rapporto descrive un metodo microfluidico basato su chip per impostare un esperimento di coltura a cella singola in cui è possibile ottenere l'abbinamento ad alta efficienza e l'analisi microscopica di più cellule singole.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Presentiamo un sistema microfluidico per studi ad alta produttività su macchinari di vita complessi, composto da 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e un modulo di miscelazione in loco. Il chip microfluidico consente l'analisi delle condizioni micro-ambientali altamente complesse e dinamiche in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Nell'era dell'immunoterapia e della profilazione genomica a singola cellula, la biologia del cancro richiede nuovi strumenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato. Descriviamo protocolli per sfruttare co-colture microfluidiche tumore-immunitarie in contesti 2D e 3D, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico delle funzioni cellulari.

Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

L'ipossia è un segno distintivo del microambiente tumorale e svolge un ruolo cruciale nella progressione del cancro. Questo articolo descrive il processo di fabbricazione di un cancro ipossico su chip basato sulla tecnologia di stampa cellulare 3D per ricapitolare una patologia del cancro correlata all'ipossia.

Cancro ipossia stampato in cellule 3D su chip per ricapitolare la progressione patologica del cancro solido

Scopri la dinamica evolutiva del cancro con l'acceleratore evoluzione microfluidico per studi a lungo termine a livello di singola cellula. Questa tecnologia consente il monitoraggio in tempo reale di morfologia, motilità e migrazione cellulare.

Generazione di gradienti di farmaci eterogenei in tutte le popolazioni di cancro su un acceleratore evoluzione microfluidico per losservazione in tempo reale (Video) | JoVE Journal

Generazione di gradienti di farmaci eterogenei in tutte le popolazioni di cancro su un acceleratore evoluzione microfluidico per l'osservazione in tempo reale

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