Name: Risolvere acqua, proteine e lipidi da In Vivo Confocal Raman Spectra di Stratum Corneum attraverso un approccio chemiometrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Scopri la spettroscopia Raman confocale in vivo per analizzare acqua, proteine e lipidi nello strato corneo umano. Questo metodo chemiometrico migliora la ricerca clinica sulle malattie cutanee.

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Gli autori riconoscono molto il sostegno finanziario del dipartimento di assistenza alla pulizia della pulizia aziendale. Vogliamo esprimere la nostra gratitudine ai direttori associati analitici Ms. Jasmine Wang e Dr. Robb Gardner per la loro guida e supporto e la signora Li Yang per il suo aiuto sulla raccolta dei dati.

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale dell'Ospedale pediatrico di Pechino in conformità con le linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki del 1975. È stato condotto secondo le linee guida ICH per la buona pratica clinica. Lo studio ha avuto luogo da maggio a luglio 2015.
1. Collezione di spettri Raman confocali in vivo da soggetti umani con dermatite atopica
<ol><li>Includere argomenti conformi ai seguenti criteri.<ol>
<li>Includere soggetti di età compresa tra 4 e 18 anni.</li>
		<li>Includere soggetti con dermatite atopica da lieve a moderata (punteggio di 2 o 3 secondo la valutazione globale del medico) con sintomi di malattia attivi sul 5%-30% della superficie corporea, con almeno due lesioni sulle braccia.</li>
		<li>Includere soggetti in buona salute, escludendo i sintomi direttamente correlati alla malattia di AD.</li>
		<li>Includere soggetti che forniscono il consenso informato scritto.</li>
		<li>Includere i soggetti con un valore ITA (Individual Topology Angle) superiore a 40 nella posizione di test.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Escludere i soggetti che soddisfano uno dei seguenti criteri.<ol>
<li>Escludere i soggetti che stanno partecipando o che hanno precedentemente partecipato a uno studio clinico in qualsiasi struttura di prova nelle precedenti 4 settimane.</li>
		<li>Escludere soggetti con cancro o che sono stati diagnosticati o trattati per il cancro entro 5 anni prima dello studio.</li>
		<li>Escludere i soggetti diabetici.</li>
		<li>Escludere i soggetti affetti da una malattia immunologica o infettiva che potrebbe mettere il soggetto a rischio o interferire con l'accuratezza dei risultati dello studio (ad esempio, epatite, tubercolosi, HIV, AIDS, lupus o artrite reumatoide).</li>
		<li>Escludere i soggetti che hanno condizioni della pelle che potrebbero interferire con misurazioni strumentali o impediranno la chiara valutazione della pelle solo alla dermatite atopica. Esempi includono pelle estremamente secca, pelle danneggiata, tagli, graffi, scottature, segni di nascita, tatuaggi, cicatrici estese, eruzioni cutanee, crescita eccessiva dei capelli, o acne.</li>
		<li>Escludere i soggetti che utilizzano farmaci immunosoppressori orali, antibiotici o altre terapie sistemiche nell'ultimo mese, ad eccezione dei tranquillanti minori.</li>
		<li>Escludere i soggetti con qualsiasi altra condizione medica che, a parere dello sperimentatore, li impedisca di partecipare allo studio.</li>
		<li>Escludere i soggetti con una maggiore pigmentazione nell'area di prova.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etichettare l'area di lesione del partecipante allo studio della dermatite atopica e contrassegnare con un'area di 3 cm x 4 cm sul sito di lesione o vicino al sito di lesione, come illustrato nella Figura 1A.</li>
	<li>Etichettare l'area di non lesione con lo stesso indicatore nel sito del corpo della controparte (ad esempio, l'avambraccio sinistro contro l'avambraccio destro) come illustrato nella Figura 1B.</li>
	<li>Posizionare il sito del corpo contrassegnato a stretto contatto con la finestra dello strumento in vivo confocal Raman, come illustrato nella Figura 2A e Nella Figura 2B. Coprire l'intera finestra per evitare l'impatto della luce della stanza sul sito del corpo.</li>
	<li>Eseguire la raccolta dei dati Raman. NOTA: Lo strumento ha una risoluzione spettrale di 2 cm-1 e 50x microscopia obiettivo (NA - 0,9 immersione olio), utilizzando un laser da 671 nm con una potenza di 17 mW. La lunghezza d'onda viene calibrata utilizzando lo spettro di una lampada al neon-argon integrata. La calibrazione dell'intensità viene eseguita misurando lo spettro di uno standard di calibrazione del vetro DEL NIST (National Institute of Standards).<ol>
<li>Spostare lo stato attivo fino a quando non viene osservato uno spettro come illustrato nella Figura 2C, quindi spostare la messa a fuoco lontano dalla superficie della pelle di 10 m.</li>
		<li>Iniziare la raccolta dei dati per 26 fasi con una dimensione di passo di 2 m nella regione di frequenza 2.510 cm-1–4.000 cm-1. Utilizzare un tempo di esposizione di 1 s e misurare otto repliche per ogni area della durata totale di 10-15 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Raccolta di spettri confocali Raman da materiali di riferimento
<ol><li>Collocare i materiali di riferimento, i principali componenti dello strato della pelle umana, il corneo19,sulla finestra dello strumento confocale Raman (vedi Tabella dei materiali: Bovine Serum Albumin (BSA), acqua divinonizzata (acqua DI), ceramide, colesterolo, acidi grassi e squalene).</li>
	<li>Raccogliere gli spettri Raman dei materiali di riferimento consecutivamente dall'esterno del materiale al centro del materiale utilizzando gli stessi parametri di raccolta descritti in precedenza.</li>
	<li>Integrare l'area sotto ogni spettrale Raman tra l'intervallo di 2.510-4.000 cm-1 e identificare i primi tre punti valore massimo in queste 26 misurazioni. Media degli spettri Raman da questi tre punti per ottenere gli spettri finali del materiale di riferimento.</li>
</ol>3. Rimozione degli spettri outlier attraverso l'analisi chemiometrica
<ol><li>Determinare la superficie della pelle e rimuovere gli spettri fuori pelle.<ol>
<li>Modificare l'estensione del file da '.ric' a '.mat' e caricare il file .mat sulla piattaforma software MATLAB.</li>
		<li>Correggere la linea di base utilizzando Linea di base (quadrati minimi ponderati automaticamente) facendo clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati importato in Analizza . Altri strumenti Pre-elaborazione nel software PLS_Toolbox con impostazione predefinita.</li>
		<li>Sommare i valori compresi tra 2.910–2.965 cm-1 per ottenere i valori di intensità in ogni spettro Raman dalla misurazione di 26 passi consecutivi, come illustrato nella Figura 3A tramite la funzione sum in MATLAB.</li>
		<li>Interpolare il valore di offset dello strumento (valore nell'asse X nella figura 3B) da 26 a 260 utilizzando la funzione linspace in MATLAB.</li>
		<li>Interpolare il valore di intensità da 26 a 260 utilizzando il metodo spline in MATLAB, sfruttando i valori di posizione 260 appena generati.</li>
		<li>Utilizzare le funzioni polifit e polivale di MATLAB per ottenere il nuovo insieme di valori di intensità con 260 punti. In primo luogo, utilizzare i valori di posizione e intensità 260 come input X e Y per la funzione polifit, rispettivamente. Impostare il valore del grado su 20. Quindi, utilizzare i coefficienti di output e i 260 valori di posizione estesa come input per il polivale per ottenere i valori di intensità 260 finali.</li>
		<li>Utilizzare le funzioni max e min di MATLAB per identificare i punti massimi e minimi dai valori di intensità 260 appena interpolati.</li>
		<li>Calcolare il valore dell'intensità media dividendo la somma del valore di intensità massima e minima per due.</li>
		<li>Identificare il valore di intensità dai valori di intensità 260 (calcolati dal punto 3.1.6) più vicino al valore di intensità media e impostare il valore della posizione corrispondente come superficie della pelle. Impostare questo valore di posizione come punto zero nell'asse X come illustrato nella Figura 3B.</li>
		<li>Modificare tutti gli altri valori di posizione in base al punto zero e alla dimensione nota del passo di 2 m.</li>
		<li>Rimuovere tutti gli spettri raccolti sopra la superficie della pelle in base al loro valore di posizione.</li>
		<li>Importare il resto dei dati in PLS_Toolbox per creare un set di dati e rinominarlo "RamanData.mat".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere gli spettri outlier con l'effetto di luce della stanza.<ol>
<li>Caricare il set di dati degli spettri Raman (RamanData.mat) dopo la rimozione degli spettri fuori interfaccia e implementare l'analisi PCA.</li>
		<li>Caricare il set di dati nel software PLS_Toolbox nella piattaforma MATLAB e fare clic con il pulsante destro del mouse sul dataset per scegliere Analizza . PCA.</li>
		<li>Selezionare Normalizza come approccio di pre-elaborazione e scegliere Nessuno per la convalida incrociata.</li>
		<li>Utilizzare i tre componenti per l'analisi di scomposizione PCA, come illustrato nella figura 2 supplementare.</li>
		<li>Rimuovere il coperchio nella finestra di raccolta dello strumento Raman in vivo e raccogliere gli spettri della luce ambiente nella regione ad alta frequenza utilizzando gli stessi parametri utilizzati per la raccolta dei dati dei materiali di riferimento.</li>
		<li>Identificare il fattore di effetto della luce della stanza attraverso il confronto con gli spettri di sfondo della luce della stanza, come mostrato nella Figura 3 supplementare.</li>
		<li>Rimuovere gli spettri con un valore di punteggio corrispondente significativamente più alto del normale (più del 99,8% dei valori di punteggio dell'intero set di dati, ovvero 0,16 in questo studio).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Selezione del numero dei componenti nell'analisi della decomposizione MCR
<ol><li>Correggere la linea di base degli spettri Raman utilizzando lo stesso approccio descritto in precedenza (sezione 3.1.2).</li>
	<li>Eseguire l'analisi PCA sul set di dati pre-elaborato come descritto in precedenza (sezione 3.2) ad eccezione della selezione di "PQN" – "Mean Center" anziché "Normalize" e tracciare i valori eigenvalues in scala logaritmica insieme al numero di componenti (20) come numero predefinito in l'analisi di scomposizione facendo clic sul pulsante Scegli componenti e selezionare log(eigenvalues) come valore Y. Scegliere da tre a otto come numero di componenti utilizzati per l'analisi MCR.</li>
	<li>Eseguire l'analisi MCR.<ol>
<li>Caricare il set di dati nel software MCR_main20 tramite il pulsante Selezione dati.</li>
		<li>Scegliere il numero di componenti (da tre a otto) facendo clic sul pulsante Determinazione del numero di componenti.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Pure nella scheda Stima iniziale, selezionare Concentrazione nella scheda Direzione selezione variabile e fare clic sul pulsante Fai.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante OK e quindi sul pulsante Continua alla pagina successiva.</li>
		<li>Fare clic su Continua nella pagina successiva, quindi selezionare fnnls e 6 rispettivamente nelle schede Implementazione e Nr. delle specie con profili non negatività. Fare clic sul pulsante Continua.</li>
		<li>Scegliere gli stessi parametri della sezione 4.3.5 per questa pagina e fare clic su Continua.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+depth+-+scanning+confocal+Raman+microspectrometer+for+rapid+in+vivo+determination+of+water+concentration+profiles+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).</li>
<li>Crowther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+effects+of+topical+moisturizers+on+changes+in+stratum+corneum+thickness%2C+water+gradients+and+hydration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo.</a> British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).</li>
<li>Egawa, M., Tagami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+depth+profiles+of+water+and+water-binding+substances+in+the+stratum+corneum+determined+in+vivo+by+Raman+spectroscopy+between+the+cheek+and+volar+forearm+skin%3A+effects+of+age%2C+seasonal+changes+and+artificial+forced+hydration%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration.</a> British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).</li>
<li>Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrowther%2C+JM+%22Changes+in+Stratum+Corneum+Thickness%2C+Water+Gradients+and+Hydration+by+Moisturizers%22">Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).</li>
<li>Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+confocal+Raman+study+of+the+delivery+of+trans+retinol+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin.</a> Applied Spectroscopy. 61 (8), 804(2007).</li>
<li>Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-in+vivo+correlation+in+skin+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro-in vivo correlation in skin permeation.</a> Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).</li>
<li>Hanlon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+in+vivo+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Prospects for in vivo Raman spectroscopy.</a> Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1(2000).</li>
<li>Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+niacinamide+containing+formulations+on+the+molecular+and+biophysical+properties+of+the+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum.</a> International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).</li>
<li>Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+stratum+corneum+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in stratum corneum barrier function.</a> Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).</li>
<li>Pezzotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+of+human+skin%3A+looking+for+a+quantitative+algorithm+to+reliably+estimate+human+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008(2015).</li>
<li>Mlitz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+filaggrin+mutations+on+Raman+spectra+and+biophysical+properties+of+the+stratum+corneum+in+mild+to+moderate+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+European+Academy+of+Dermatology+and+Venereology%22%5BJournal%5D)">Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis.</a> Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).</li>
<li>Janssens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+to+protein+ratio+plays+an+important+role+in+the+skin+barrier+function+in+patients+with+atopic+eczema%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema.</a> British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).</li>
<li>Faiman, R., Larsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+C+H+stretching+vibrational+frequencies+in+the+Raman+spectra+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).</li>
<li>Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+spectroscopic+deconvolution+procedure+for+complex+biological+systems%3A+vibrational+components+in+the+FT-Raman+spectra+of+ice-man+and+contemporary+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society%2C+Faraday+Transactions%22%5BJournal%5D)">Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin.</a> Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).</li>
<li>Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+organization+and+stratum+corneum+thickness+determined+in+vivo+in+human+skin+analyzing+lipid-keratin+peak+%282820-3030+cm-+1%29+using+confocal+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).</li>
<li>Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+uptake+and+skin+occlusion+following+topical+application+of+oils+on+adult+and+infant+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin.</a> Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).</li>
<li>Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Raman+microscopy+for+investigating+the+penetration+of+various+oils+into+the+human+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo.</a> Journal of Dermatological Science. , (2015).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MCR+approach+revealing+protein%2C+water+and+lipid+depth+profile+in+atopic+dermatitis+patients%27+stratum+corneum+via+in+vivo+confocal+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. , (2019).</li>
<li>Caspers, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCaspers%2C+PJ+%22In+vivo+Skin+Characterization+by+Confocal+Raman+Microspectroscopy%22">In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy</a>. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).</li>
<li>Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCR-ALS+GUI+2.0%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).</li>
<li>Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+normalization+method+in+in+vivo+stratum+corneum+analysis+using+confocal+Raman+microscopy+to+compensate+nonhomogeneous+distribution+of+keratin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin.</a> Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).</li>
<li>Wise, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemometrics+tutorial+for+PLS_Toolbox+and+Solo%5BTitle%5D)+AND+%22Eigenvector+Research%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo.</a> Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Durante la raccolta dei dati, come descritto nei paragrafi 2 e 3 del protocollo, ogni profilo di profondità è stato raccolto in un'area con contatto tra la finestra dello strumento e la pelle trovando le aree più scure dalle immagini microscopiche evidenziate nei cerchi rossi in Figura 2C. Una volta individuate queste aree, è stato fondamentale iniziare il profilo di profondità sopra la superficie della pelle per determinare con precisione la posizione della superficie dell...

Negli studi clinici, la spettroscopia Raman confocale in vivo ha dimostrato la sua capacità unica di determinare lo spessore dello strato di corneo e il contenuto d'acqua1,2,3,4e di tracciare la penetrazione materiali attivi applicati topicamente alla pelle5,6. Come approccio non invasivo, la spettroscopia confocale Raman rileva i segnali molecolari in base alle modalità vibrazionali. Pertanto, l'etichettatura non è necessaria7. La spettroscopia Raman confocale in vivo fornisce informazioni chimiche con risoluzione di profondità basata sulla natura confocale della tecnica. Queste informazioni dipendenti dalla profondità sono molto utili per studiare gli effetti dei prodotti per la cura della pelle4,8, invecchiamento9,10, cambiamenti stagionali3, così come le malattie di funzione di barriera cutanea, come la dermatite atopica11,12. Ci sono molte informazioni nella regione ad alta frequenza della spettroscopia confocale Raman (2.500–4.000 cm-1), dove l'acqua produce picchi distinti nella regione tra 3.250–3.550 cm-1. Tuttavia, i picchi Raman di proteine e lipidi, che sono centrati tra circa 2.800-3.000 cm-1, si sovrappongono a vicenda perché i segnali sono prodotti principalmente da gruppi di metilene (-CH2-) e metili (-CH3)13 . Queste informazioni sovrapposte presentano una sfida tecnica quando si ottengono quantità relative di singole specie molecolari. Per risolvere questa sfida sono stati utilizzati il montaggio di picco14,15 e la posizione di picco selettiva12,16 approcci. Tuttavia, è difficile per questi singoli metodi basati sul picco estrarre le informazioni pure sui componenti perché più picchi Raman dallo stesso componente cambiano contemporaneamente17. Nella nostra recente pubblicazione18è stato proposto un approccio MCR per chiarire le informazioni pure sui componenti. Utilizzando questo approccio, tre componenti (acqua, proteine e lipidi) sono stati estratti da un grande set di dati spettroscopici Raman confocale in vivo.
L'esecuzione di grandi studi clinici può essere impegnativa per gli individui che raccolgono dati spettroscopici in vivo. In alcuni casi, l'acquisizione spettrale può richiedere attrezzature operative per molte ore in un giorno e lo studio può estendersi fino a settimane o mesi. In queste condizioni, i dati spettroscopici possono essere generati da operatori di apparecchiature che non dispongono delle competenze tecniche necessarie per identificare, escludere e correggere tutte le fonti di artefatti spettroscopici. Il set di dati risultante può contenere una piccola frazione di outlier spettroscopici che devono essere identificati ed esclusi dai dati prima dell'analisi. Questo documento illustra in dettaglio un processo di analisi chemiometrica per "ripulire" un set di dati Clinico Raman prima di analizzare i dati con MCR. Per rimuovere correttamente gli outlier, è necessario identificare i tipi di outlier e la causa potenziale per la generazione degli spettri outlier. Quindi, è possibile sviluppare un approccio specifico per rimuovere gli outlier mirati. Ciò richiede una conoscenza preliminare del set di dati, inclusa una comprensione dettagliata del processo di generazione dei dati e della progettazione dello studio. In questo set di dati, la maggior parte degli outlier sono spettri bassi segnale-rumore e provengono principalmente da 1) spettri raccolti sopra la superficie della pelle (6.208 su 30.862) e 2) forte contributo allo spettro dalla luce della stanza fluorescente (67 su 30.862). Gli spettri raccolti sopra la superficie della pelle producono una risposta Raman debole, poiché il punto focale laser si avvicina alla superficie della pelle ed è per lo più nella finestra dello strumento sotto la pelle. Gli spettri con un forte contributo dalla luce fluorescente della stanza vengono generati a causa dell'errore dell'operatore dello strumento o del movimento del soggetto, il che produce una condizione in cui la finestra di raccolta confocale Raman non è completamente coperta dal sito del corpo del soggetto. Sebbene questi tipi di artefatti spettrali possano essere identificati e corretti durante l'acquisizione spettrale da parte di un esperto spettroscopico al momento dell'acquisizione dei dati, gli operatori di strumenti addestrati utilizzati in questo studio sono stati istruiti a raccogliere tutti i dati, a meno che è stato osservato un guasto catastrofico. Il compito di identificare ed escludere gli outlier è incorporato nel protocollo di analisi dei dati. Il protocollo presentato è stato sviluppato per risolvere questa sfida. Per affrontare gli spettri basso segnale-rumore sopra la superficie della pelle, la posizione della superficie della pelle deve essere determinata prima per consentire la rimozione degli spettri raccolti sopra la superficie della pelle. La posizione della superficie della pelle è definita come la profondità in cui il punto focale laser Raman è la metà della pelle e la metà fuori della pelle, come illustrato nella figura supplementare 1. Dopo aver rimosso gli spettri bassi segnale-rumore, viene implementata un'analisi principale dei componenti (PCA) per estrarre il fattore dominato dai picchi di luce ambiente fluorescenti. Questi outlier vengono rimossi in base al valore del punteggio del fattore corrispondente.
Questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su come vengono determinati sei componenti principali nel processo MCR. Questo viene fatto attraverso un'analisi PCA seguita da confronto forma spettrale tra i carichi per i modelli generati con un diverso numero di componenti principali. Il processo sperimentale per la raccolta dei dati dei materiali di riferimento e dei soggetti umani è anche spiegato in dettaglio.

<table><tbody><tr><td>Albumina sierica bovina Colesterolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-solfato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Eritro-Diidrosfingosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DI acqua</td><td></td><td></td><td>Purificata con Milipore (18.2M&Omega;)</td></tr><tr><td>Analizzatore cutaneo Gen2-SCA</td><td>River Diagnostics, Rotterdam, Paesi Bassi</td><td>Gen2</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 2018b</td><td>Mathwork</td><td>2018b</td><td></td></tr><tr><td>N-behenoyl-D-eritro-sfingosina</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Lignoceroil-D-eritro-sfinganina(ceramide)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido oleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido palmitico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido palmitoleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLS_Toolbox versione 8.2</td><td>Eigenvector Research Inc.</td><td>8.2</td><td></td></tr><tr><td>RiverICon</td><td>River Diagnostics, Rotterdam, Paesi Bassi</td><td>versione 3.2</td><td></td></tr><tr><td>Squalene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido stearico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

risolvere acqua, proteine e lipidi da in vivo confocal raman spectra di stratum corneum attraverso un approccio chemiometrico

Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach

Lo sviluppo di questo metodo spettroscopico Raman confocale in vivo consente la misurazione diretta di acqua, proteine e lipidi con risoluzione di profondità nei soggetti umani. Queste informazioni sono molto importanti per le malattie legate alla pelle e caratterizzano le prestazioni dei prodotti per la cura della pelle. Questo protocollo illustra un metodo per la raccolta di spettri confocali Raman e la successiva analisi del set di dati spettrale sfruttando la chemiometria. L'obiettivo di questo metodo è quello di stabilire un protocollo standard per la raccolta dei dati e fornire indicazioni generali per l'analisi dei dati. La pre-elaborazione (ad esempio, la rimozione degli spettri anomali) è una fase critica nell'elaborazione di set di dati di grandi dimensioni da studi clinici. Ad esempio, forniamo indicazioni basate sulla conoscenza preliminare di un set di dati per identificare i tipi di outlier e sviluppare strategie specifiche per rimuoverli. Viene eseguita un'analisi dei componenti principali e gli spettri di carico vengono confrontati con gli spettri dei materiali di riferimento per selezionare il numero di componenti utilizzati nell'analisi finale della risoluzione della curva multivariata (MCR). Questo approccio ha esito positivo per l'estrazione di informazioni significative da un set di dati spettrale di grandi dimensioni.

In questo studio clinico, sono stati raccolti spettri Raman confocali in vivo da 28 soggetti dai 4 ai 18 anni. Un totale di 30.862 spettri Raman sono stati raccolti con il protocollo di raccolta dati di cui sopra. Questo set di dati spettrale di grandi dimensioni contiene outlier spettrali del 20%, come illustrato nella figura 4A. Gli spettri outlier basso segnale-rumore sono stati rimossi dopo aver determinato la superficie della pelle, seguito dalla PCA per identificare gli spettri con...

Qui, presentiamo un protocollo per la raccolta di spettri Raman confocali da soggetti umani in studi clinici combinati con approcci chemiometrici per la rimozione degli outlier spettrali e la successiva estrazione di caratteristiche chiave.

Risolvere acqua, proteine e lipidi da In Vivo Confocal Raman Spectra di Stratum Corneum attraverso un approccio chemiometrico

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in ...

La misurazione diretta di acqua, proteine e lipidi con risoluzione della profondità nei soggetti umani è molto importante per le malattie legate alla pelle, per la caratterizzazione delle prestazioni del prodotto per la cura della pelle. Questo metodo, insieme alla successiva analisi, sfrutta la chemiometria per estrarre informazioni chimiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di raccogliere il set di dati Raman clinico da operatori di strumenti addestrati che non dispongono di competenze tecniche per identificare, escludere e correggere tutte le fonti di artefatti spettroscopici.Il set di dati risultante può quindi essere elaborato per identificare gli outlier che devono essere esclusi dalla data precedente all'analisi. Durante l'analisi dei dati, una sfida chiave è la rimozione degli outlier e l'identificazione del numero dei componenti chiave nel set di dati. L'approccio mostra in questo video sfrutta la conoscenza precedente del set di dati clinici e l'approccio chemiometrico per estrarre con successo l'acqua, le proteine e i lipidi con risoluzione della profondità.A dimostrare la procedura sarà Li Yang, tecnico del nostro laboratorio di C&T. Per iniziare, fare in modo che il soggetto posizionare un sito del corpo della lesione marcato o un sito di controllo a stretto contatto con la finestra di imaging dello strumento Raman confocale in vivo. Assicurati che coprano l'intera finestra per evitare l'impatto della luce della stanza sull'imaging.Quindi, apri il software e sposta la messa a fuoco fino a quando non viene visto uno spettro simile a quello mostrato qui. Successivamente, spostare la messa a fuoco a 10 micron dalla superficie della pelle. Raccogli i dati per 26 passaggi con una dimensione del passo di due micron nella regione di frequenza mostrata qui, utilizzando un tempo di esposizione di un secondo.Misurare otto repliche per ogni area, della durata totale fino a 15 minuti. In primo luogo, utilizzare la finestra di comando e MATLAB per modificare l'estensione del file dei dati raccolti da ric a mat. Quindi caricare il file mat sulla piattaforma software MATLAB, come mostrato qui.Correggere la linea di base del set di dati utilizzando il metodo automatico dei quadrati meno ponderati, andando alla finestra PLS_Workspace e facendo clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati importato, scorrendo fino ad Analizzare, selezionando Altri strumenti e facendo clic su Pre-elaborazione. Nella finestra visualizzata fare clic su Mostra. Scorrere quindi verso il basso la barra degli strumenti Metodi disponibili fino al filtro Linea di base quadrati affittati ponderati automatici e selezionare Aggiungi.Quindi, fare clic su OK per impostare le opzioni e applicare la pre-elaborazione ai dati. Salvare questo come Spectra_baseline. Tornare quindi alla finestra di comando e sostituire i dati utilizzando il risultato corretto per la linea di base.Ora, vai all'editor di testo ed esegui il programma come mostrato qui. Questo riassumerà i valori tra 2910 e 2965 centimetri inversi per ottenere i valori di intensità sotto ogni spettro Raman dalla misurazione di 26 passaggi consecutivi e memorizzarli in un file Excel. In MATLAB, andate al workspace e impostate il percorso dei dati in Depth_save, come mostrato.Quindi, utilizzate il processo qui descritto per interpolare il valore di offset dello strumento da 26 a 260 utilizzando la funzione linspace in MATLAB. Questo processo interpolerà il valore di intensità da 26 a 260 utilizzando il metodo spline, sfruttando i valori di posizione 260 appena generati. Inoltre, utilizzerà i valori di posizione e intensità 260 rispettivamente come input x e y per la funzione polyfit, impostando il valore di grado su 20.Quindi, utilizzerà i coefficienti di uscita e i 260 valori di posizione estesa come input per il polivale, per ottenere i valori finali di intensità 260. Successivamente, calcolerà l'intensità media e troverà il punto nella curva più vicino all'intensità media. Cambierà anche il valore di profondità in base alla superficie della pelle, nella dimensione nota del passo di due micron.Ora, esegui il programma. Caricare il set di dati degli spettri Raman dopo la rimozione degli spettri esterni della pelle nel software PLS_Toolbox, sotto la piattaforma MATLAB e fare clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati per scegliere Analizza e quindi PCA. Quindi, fare clic su Scegli pre-elaborazione.Selezionate Normalizza (Normalize) come approccio di pre-elaborazione. Quindi, non scegliere nessuno per la convalida incrociata. Quindi, compilare il modello utilizzando i tre componenti per l'analisi di decomposizione PCA.Ora, rimuovere il coperchio nella finestra di raccolta degli strumenti Ramen in vivo e raccogliere gli spettri di luce della stanza nella regione ad alta frequenza utilizzando gli stessi parametri utilizzati per la raccolta dei dati del materiale di riferimento. Identificare il fattore di effetto luce della stanza attraverso il confronto con lo sfondo della luce della stanza. Ora, rivedi i punteggi e rimuovi gli spettri con il valore di punteggio corrispondente significativamente più alto del normale.Ciò significa rimuovere i valori di punteggio di oltre il 99,8% dell'intero set di dati, che è 0,16 in questo studio. Salvare i dati x-block di calibrazione risultanti. Infine, vai al browser PLS_Workspace e modifica il nuovo file.Selezionare le etichette di riga e passare a Eliminazione disco rigido esclusa per eliminare definitivamente i dati esclusi prima di salvare di nuovo il file. Inizia correggendo la linea di base degli spettri Raman usando lo stesso appena mostrato. Eseguire quindi l'analisi PCA sul set di dati pre-elaborazione.Tracciate gli autovalori in scala logaritmica insieme al numero di componenti facendo clic sul pulsante Scegli componente (Choose Component) e selezionate log(eigenvalues) come valore y. Per eseguire analisi della risoluzione delle curve multivariate, utilizzare innanzitutto il pulsante di selezione dei dati per caricare il set di dati nel software MCR_main dati. Scegliete manualmente il numero di componenti e impostate il numero del componente tra tre e otto.Quindi, nella scheda Stima iniziale, fare clic sul pulsante Pure. Selezionare Quindi Concentrazione e fare clic sul pulsante Fai. Una volta aggiornata la schermata, fare clic sul pulsante OK e quindi su Continua per passare alla pagina successiva.Fare clic su Continua e in Implementazione applicare fnnls. Selezionare quindi sei dal menu a discesa per il numero di specie con profili di non negatività e fare clic su Continua. Nella pagina successiva scegliere gli stessi parametri e fare clic su Continua.Per determinare la posizione sulla superficie della pelle, l'area sotto il picco Raman della proteina è stata integrata per ottenere il profilo di profondità del segnale proteico. La superficie della pelle è stata definita come la posizione in cui il valore di intensità dal profilo di profondità interpolato era più vicino all'intensità media. La posizione esatta della superficie della pelle non deve coincidere con un punto dati sperimentale.Un totale di 30.862 spettri Raman sono stati raccolti con il protocollo di raccolta dati descritto in questo video. Questo set di dati spettrali di grandi dimensioni contiene valori anomali spettrali del 20%. Una corretta identificazione e rimozione degli spettri anomali è importante per ottenere un set di dati adeguato.Qui, si può vedere il contributo dalle luci della stanza, sovrapposto a uno spettro di riferimento di Roomlight. L'analisi dei componenti principali è stata eseguita sul set di dati Raman confocale pre-elaborazione e l'autovalore, insieme al numero di fattori utilizzati, viene tracciato qui. Una significativa diminuzione dell'autovalore è stata osservata per il fattore nove.Questa osservazione suggerisce di studiare modelli con il numero di componenti principali che variano da tre a otto fattori per l'inclusione nel modello di risoluzione della curva multivariata. Quando si tenta questa procedura, è fondamentale avviare un profilo di profondità sopra la superficie della pelle, per determinare con precisione la posizione della superficie della pelle. Questa metodologia consente di esaminare l'impatto dei prodotti per la cura della pelle sui componenti chiave della pelle, tra cui acqua, proteine e lipidi.

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