Screening e identificazione di piccoli peptidi mirati Fibroblast Growth Factor Receptor2 utilizzando una Phage Display Peptide Library
30 settembre 2019
Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening di piccoli peptidi che si legano a FGFR2 utilizzando una libreria di peptidi di visualizzazione del fago. Analizziamo ulteriormente l'affinità dei peptidi selezionati verso la FGFR2 in vitro e la sua capacità di sopprimere la proliferazione cellulare.
Rispetto ad altri metodi, questo protocollo è più facile da scoprire nuovi antagonisti, agonie e modulatori allosterici quantitativamente e qualitativamente senza conoscere la struttura di idro-diluizione e la formazione della proteina bersaglio. Questo protocollo è altamente efficiente, facile da gestire, economico e disponibile in commercio. Combina questo metodo di screening ad alta produttività con l'analisi ITC, i piccoli peptidi funzionali possono essere ottenuti quantitativamente e qualitativamente.
A dimostrare la procedura saranno Ying Zhao e Qiang Wang, studenti laureati del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare una soluzione di FGFR2 nel tampone di rivestimento a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Aggiungere un millilitro della soluzione a un piatto di 35 centimetri quadrati e ruotare ripetutamente fino a quando la superficie è completamente bagnata.
Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori. Il giorno successivo, versare la soluzione di rivestimento e aggiungere la soluzione di blocco preparata. Incubare a quattro gradi Celsius per almeno un'ora, quindi scartare la soluzione di blocco e lavare rapidamente il piatto sei volte con TBST assicurandosi che il piatto non si asciughi.
Ricostituire la libreria originale di fago in un millilitro di TBST e aggiungere questo al piatto rivestito. Scuotere delicatamente la piastra su uno shaker a temperatura ambiente per due ore. Dopo questo, scartare il supernatante e lavare il piatto 10 volte con TBST.
Elutare il fago legato aggiungendo un millilitro di 0,2 glicina molare HCL al piatto e dondolando delicatamente a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire l'eluente in un tubo di microcentrifugo sterilizzato e neutralizzarlo con 100 microlitri di un tris-HCL molare a pH 9.1. In primo luogo, prewarm le piastre LB e IPTG X-Gal preparate a 37 gradi Celsius per almeno un'ora prima dell'uso.
Utilizzando punte di pipetta con cartucce filtranti, preparare 100 microlitri di dieci volte diluizioni dell'eluente in LB. Dopo che la coltura E.coli preparata raggiunge la fase di registro intermedio, erogare 200 microlitri della coltura in tubi di microcentrifugo sterilizzati uno per ogni diluizione eluente. Per avviare l'infezione, aggiungere 50 microlitri di ogni diluizione ai tubi contenenti la coltura di E.coli. Vortice rapidamente e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi utilizzare bastoncini di rivestimento per rivestire le piastre LB e IPTG X-GAL con 90 microlitri di questa miscela. Dopo cinque minuti, invertire le piastre e incubarle durante la notte a 37 gradi Celsius. Conta le placche quando appaiono.
Per iniziare, diluire la coltura notturna in 20 millilitri di LB in un pallone Erlenmeyer da 250 millilitri. Aggiungere l'eluente non amplificato e incubare a 37 gradi Celsius con scuotimenti vigorosi per 4-1/2 ore. Quindi, centrifuga la coltura a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Trasferire il supernatante su un tubo fresco. Centrifugare di nuovo usando le stesse condizioni e scartare il pellet. Trasferire l'80% superiore del supernatante in un tubo fresco e aggiungerlo all'1/6° volume del 20% di polietilene glicole e al cloruro di sodio 2,5 molare.
Lasciare precipitare il fago durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, centrifuga il fago precipitato a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Scartare nuovamente il supernatante e la centrifuga utilizzando le stesse condizioni.
Utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante residuo. Rimescolare il pellet in un millilitro di TBS e trasferire il supernatante in un tubo di microcentrifugo. Centrifuga a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Trasferire il supernatante in un tubo di microcentrifugo fresco e precipitare nuovamente aggiungendo 1/6° volume di glicole polietilene al 20% e cloruro di sodio molare 2,5. Incubare sul ghiaccio per 15-60 minuti. Quindi, centrifuga a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Scartare nuovamente il supernatante e la centrifuga utilizzando le stesse condizioni. Utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante residuo. Rimescolare il pellet in 200 microlitri di TBS e centrifuga per un minuto in più per rimuovere le impurità.
Quindi trasferire il supernatante su un tubo di microcentrifugo fresco per ottenere l'eluente amplificato. In questo studio, il numero di input di fago viene mantenuto invariato, mentre la concentrazione di rivestimento della proteina FGFR2 viene gradualmente ridotta. I risultati del giacimento del fago suggeriscono che il numero di fagi recuperati aumenta gradualmente e che dopo tre round, c'è un aumento di 65 volte rispetto a quello del primo turno.
Viene quindi condotto un esperimento ITC per misurare l'affinità del piccolo peptide con FGFR2. I risultati indicano che il peptide SP1 ha un'alta affinità verso FGFR2. Questi dati dimostrano l'efficienza del protocollo di screening.
Per indagare l'attività biologica del peptide SP1, viene eseguito un saggio di proliferazione dei fibroblasti utilizzando un kit CCK-8. Balb/C3T3 vengono incubati con il peptide SP1 a diverse concentrazioni. I risultati suggeriscono che il peptide SP1 sopprime la crescita delle cellule.
La contaminazione da fagi di tipo selvatico deve essere evitata in questo caso. Assicurarsi di utilizzare punte di pipetta resistenti agli aerosol. Mentre la crescita ottenendo l'amplificazione del fago.
Questa procedura può anche essere utilizzata nello screening di piccoli peptidi che si legano a carboidrati, cellule di coltura e tessuti. Questi peptidi possono essere ulteriormente amplificati
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per lo screening di piccoli peptidi che si legano a FGFR2 mediante una libreria peptidica con esposizione fagica. Lo studio analizza inoltre l'affinità dei peptidi selezionati verso FGFR2 in vitro e la loro capacità di inibire la proliferazione cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Farmacologia
Sfondo
- FGFR2 è un recettore fondamentale coinvolto in diversi processi cellulari.
- L'identificazione di peptidi che si legano a FGFR2 può portare a nuove strategie terapeutiche.
- La tecnologia di visualizzazione mediante fagi (phage display) è uno strumento potente per lo screening di peptidi.
- Questo protocollo ha lo scopo di semplificare l'identificazione di modulatori di FGFR2.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo efficiente per lo screening di peptidi che interagiscono con FGFR2.
- Valutare l'affinità di legame dei peptidi selezionati.
- Valutare gli effetti biologici di questi peptidi sulla proliferazione cellulare.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di FGFR2 nel buffer di rivestimento.
- Utilizzo di una libreria peptidica con display fagico per il screening.
- Analisi dell'affinità in vitro dei peptidi selezionati.
- Valutazione della soppressione della proliferazione cellulare.
Risultati principali
- Identificazione di diversi peptidi con elevata affinità per FGFR2.
- Dimostrazione della capacità dei peptidi selezionati di inibire la proliferazione cellulare.
- Confronto dell'efficienza di questo protocollo con altri metodi.
- Integrazione con successo dell'analisi mediante screening ad alto rendimento con la calorimetria di titolazione isotermica (ITC).
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per scoprire modulatori di FGFR2.
- È efficiente, economico e di facile utilizzo.
- Questo approccio può facilitare ulteriori ricerche sulle terapie correlate a FGFR2.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La schermatura mediante phage display per peptidi che legano FGFR2 affronta una sfida fondamentale nella fase iniziale della scoperta, finalizzata all'identificazione di nuovi modulatori per bersagli in oncologia e nella segnalazione cellulare. Questo protocollo consente l'identificazione rapida e ad alto rendimento, nonché la caratterizzazione quantitativa di antagonisti peptidici, sostenendo una valutazione predittiva affidabile e una riduzione del rischio meccanicistico nella fase di validazione del bersaglio. L'approccio si propone di ottimizzare la selezione del portafoglio e accelerare lo sviluppo di candidati terapeutici a base peptidica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette un'analisi diretta di FGFR2 come bersaglio rilevante per la malattia, senza necessità di conoscenze strutturali preliminari.
- Consente la validazione funzionale di antagonisti peptidici mediante saggi quantitativi di affinità e attività biologica.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico isolando interazioni specifiche tra peptidi e recettori.
- Migliora l'affidabilità predittiva nelle decisioni di sviluppo terapeutico successivo.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce candidati peptidici validati da utilizzare in saggi di legame e funzionali standardizzati.
- Consente schermature riproducibili ad alto rendimento mediante librerie scalabili di visualizzazione del fago.
- Fornisce output quantitativi tramite calorimetria di titolazione isotermica (ITC) e saggi di proliferazione cellulare per una valutazione robusta dei composti.
- Permette il riutilizzo della piattaforma saggistica per altri recettori o ligandi bersaglio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la scoperta di peptidi ai percorsi di segnalazione di FGFR2 rilevanti per le patologie oncologiche.
- Garantisce continuità dallo screening molecolare alla validazione funzionale preclinica.
- Riduce il rischio traduttivo confermando l'attività biologica in saggi cellulari.
- Permette lo sviluppo dei peptidi promettenti, aggiustato in base al rischio, in modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto capostella e alla valutazione preclinica di peptidi modulatori di FGFR2.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei meccanismi di malattia mediati da FGFR2.
- Screening: Fornisce candidati peptidici pronti per saggi con dati quantitativi riproducibili sul legame.
- Analisi: Fornisce misurazioni dell'affinità e letture funzionali basate su cellule per confrontare l'efficacia dei peptidi.
- Ricerca traslazionale: Collega lo screening molecolare alla validazione preclinica in sistemi pertinenti alla malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma scalabile e adattabile per lo screening di peptidi su diversi bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nel targeting di FGFR2.
- Valore operativo: Standardizza e ottimizza i flussi di lavoro per lo screening e la validazione di peptidi.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione/cessazione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo di asset basati su peptidi, adeguati al rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in display di fagi, chimica dei peptidi e saggi quantitativi di legame.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per la calorimetria isotermica (ITC) e a infrastrutture per saggi cellulari.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire riproducibilità e integrità dei dati.
- È adattabile ad altri recettori o ligandi bersaglio con opportune modifiche alla libreria e ai saggi.
- Il controllo della contaminazione e una manipolazione precisa sono fondamentali per evitare interferenze da fagi di tipo selvaggio.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
First Round of Biopanning: Screening Phage Clones that Bind to the Extracellular Domain of FGFR2
2:26
Titer Determination of the Eluted Phages
3:28
Phage Amplification
5:38
Results: Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2
6:38
Conclusion
