Analisi della funzione cellulare satellitare durante la rigenerazione muscolare scheletrica mediante lesione cardiotossina e iniezione di siRNA auto-consegnante In Vivo

Questa tecnica consente la combinazione dell'iniezione intramuscolare della cardiotossina velenosa del serpente, l'iniezione intramuscolare di siRNA auto-erogante, consentendo così l'analisi della rigenerazione del muscolo scheletrico. L'applicazione del siRNA auto-erogato è un modo elegante per indagare la perdita funzionale di singoli geni durante la rigenerazione muscolare, evitando così gli animali transgenici. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piede, radere l'area di iniezione della parte inferiore della gamba cranico dal ginocchio alla zampa e rimuovere eventuali capelli sciolti.

Posizionare il mouse in condizioni supine su un cuscinetto di intestazione coperto da un panno chirurgico sterile e utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare l'area di iniezione della parte inferiore della gamba cranico. Successivamente, caricare una siringa per insulina dotata di un ago calibro 29, con 50 microlitri di 20 microtossine micromolari e perforare completamente la pelle nel muscolo, appena distale al ginocchio. Quando l'ago è in posizione, iniettare la cardiotossina per un periodo di consegna da 10 a 20 secondi lungo l'intera lunghezza del muscolo, mentre si sposta l'ago avanti e indietro, per consentire una distribuzione uniforme della cardiotossina, ferendo così l'intero muscolo anteriore del tibialis.

Quindi riportare il mouse nella sua gabbia su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino alla piena rimiglia. Tre giorni dopo l'intervento chirurgico, disinfettare l'area di iniezione come appena dimostrato. Iniettare fino a 50 microlitri di siRNA diretti contro il gene bersaglio di interesse nel muscolo anteriore tibiale del topo anestetizzato, come appena dimostrato.

Quindi riportare il topo nella sua gabbia, con monitoraggio fino alla piena reclinazione. Prima di raccogliere il tessuto muscolare ferito, avvolgere il foglio intorno a una matita e sigillare la matita con del nastro adesivo, in modo che il fondo dello stampo fornisca una superficie uniforme e chiusa. Quando lo stampo è pronto, disinfettare l'intero animale con il 70% di etanolo e utilizzare forbici affilate extra per rimuovere la pelle alla caviglia.

Prima di raccogliere il muscolo, utilizzare forcep fini per pizzicare le forcep chiuse attraverso la fascia accanto all'osso di tibia alla caviglia della gamba ferita e spostare le forcep verso il ginocchio per strappare la fascia, esponendo il muscolo anteriore tibiale. Per isolare il muscolo tibiale anteriore, esporre il tendine distale e afferrare il tendine con forcep fini. Usa le forbici primaverili per tagliare il tendine e afferra il muscolo al tendine per tirare il muscolo verso il ginocchio.

Per consentire l'analisi della regione del ventre medio, utilizzare forbici dritte per tagliare il muscolo anteriore tibiale nella regione del ventre intermedio in due metà di uguali dimensioni e riempire lo stampo a matita a metà strada con soluzione di congelamento. Inserire le due metà del muscolo tibiale anteriore nello stampo di congelamento in posizione verticale, con la regione del ventre medio rivolta verso il fondo dello stampo. Utilizzare le forcep per trasferire lo stampo di congelamento a metà strada in azoto liquido.

Quando il mezzo di congelamento passa dal trasparente al bianco e diventa solido, trasferire lo stampo di congelamento in un congelatore di 80 gradi Celsius o asciugare il ghiaccio per la lavorazione futura. Nei muscoli di controllo, l'architettura del tessuto rimane intatta, come osservato dalla localizzazione dei nuclei nella periferia delle miofibre e dalla mancanza di accumulo di cellule mononucleate all'interno dello spazio interstiziale. Sette giorni dopo la lesione mediata dalla cardiotossina, si formano nuove miofibre come marcate da nuclei situati in posizione centrale e un accumulo di cellule mononucleate costituite principalmente da cellule satellite, ma anche cellule non miogeniche come le cellule immunitarie.

In condizioni di riposo, le cellule satellitari contrassegnate dalla colorazione Pax7 in rosso, si trovano sotto la lamina basale, mostrata in verde qui. Tre giorni dopo l'infortunio, il numero di cellule satellitari aumenta e le cellule satellite non si trovano più sotto la lamina basale. Al giorno 10 dopo l'infortunio, il numero di satelliti è ancora aumentato.

Per analizzare ulteriormente il processo di rigenerazione, le miofibre appena formate possono essere macchiate con anticorpi diretti contro la miosina dello sviluppo. Due giorni dopo l'iniezione con siRNA, le cellule satellitari possono essere analizzate per la presenza del siRNA etichettato fluorescentmente. In questo esperimento rappresentativo, circa il 75% delle cellule satellitari nel muscolo rigenerante erano positive per il siRNA etichettato fluorescentmente.

Inoltre, circa il 74% di tutte le miofibre rigeneranti erano positive anche per il siRNA etichettato fluorescentmente, suggerendo che il 74% delle miofibre rigeneranti prendesse il siRNA, che le cellule satellitari siRNA-positive si fossero fuse insieme per formare nuove miofibre, o che si fosse verificata la fusione con miofibre rigeneranti già esistenti. Il passo più critico è quello di ottenere una lesione completa del muscolo anteriore della tibialis. Oltre all'analisi istologica, parametri come la forza generata possono essere registrati per analizzare la rigenerazione del muscolo scheletrico in modo funzionale.