Name: Obsistenza di Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri la misura delle proprietà meccaniche delle membrane di vescicole lipidiche polimeriche sintetiche mediante aspirazione con micropipetta. Questa tecnica consente di valutare flessibilità e instabilità in esperimenti singoli.

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1. Fabbricazione di micropipette
NOTA: Qui sono necessarie micropipette con un diametro interno compreso tra 6 e 12 m e una lunghezza di conia intorno ai 3-4 mm. Un metodo dettagliato di produzione micropipetta è descritto di seguito.
<ol><li>Posizionare il vetro borosilicate capillare nella barra di traino dell'estraente e fissare una delle estremità stringendo la manopola.</li>
	<li>Far scorrere con attenzione il vetro attraverso i fori sul lato della camera riscaldatrice.</li>
	<li>Stringere la manopola di bloccaggio all'altra estremità.</li>
	<li>Controllare le dimensioni della punta e la lunghezza del cono per ottenere le specifiche desiderate. Per questo, ottimizzare i parametri tecnici come la temperatura di riscaldamento, tirare, velocità, ritardo e pressione. Di seguito è riportato un esempio di un programma utilizzato:Here is an example of a program used: Calore: 550 gradi centigradi Tirare: 10 (Gamma della macchina: 0-255 in unità arbitrarie) Velocità: 30 (Intervallo: 0-255 in unità arbitrarie) Ritardo: 1 (Intervallo: 0-255 in unità arbitrarie) Pressione: 500 (Intervallo: 0-999 in unità arbitrarie)</li>
	<li>Fare clic su PULL per eseguire gli eventi definiti dal programma. Il capillare viene quindi separato in due micropipette, le cui dimensioni devono essere regolate utilizzando una microforforgia.</li>
	<li>Inserire la micropipetta nel porta tubi metallici della microforforgia (vedere la figura 1). Utilizzando l'obiettivo 10x, regolare lo stadio del microscopio e il manipolatore pipette (movimento verticale e orizzontale) fino a quando la punta della pipetta non è vicina alla superficie del tallone di vetro.</li>
	<li>Premere l'interruttore del piede per sciogliere il tallone di vetro. Abbassare la punta e metterla a contatto con il tallone di vetro fuso. Il vetro fuso fluirà nella pipetta per azione capillare. Attendere alcuni secondi fino a quando il livello del vetro fuso raggiunge una certa altezza, come mostrato nell'inserto della Figura 1.</li>
	<li>Interrompere il riscaldamento rimuovendo la pressione sull'interruttore del piede e tirare rapidamente la punta via utilizzando il manipolatore pipetta verticale per causare una rottura brusca.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.7 e 1.8 fino a ottenere il diametro desiderato (da 6 a 12 m). NOTA: Per migliorare la precisione della misurazione del diametro, durante l'ultima fase, utilizzare un obiettivo 32x dotato di un reticle.</li>
</ol>2. Suggerimenti pipette coating con BSA (albumina del siero bovino)
<ol><li>Per preparare una soluzione di 0,1 M di glucosio contenente 1% wt. BSA in acqua pura.<ol>
<li>Pesare 180 mg di polvere di glucosio, mettere in un tubo conico di polipropilene 15 mL e completare con 10 mL di acqua pura.</li>
		<li>Aggiungere 0,1 g di polvere di BSA e agitare delicatamente con un miscelatore rotativo della provetta fino alla completa dissoluzione (circa 4 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prendere la soluzione con una siringa Luer usa e getta da 10 mL dotata di ago. Una volta riempito, rimuovere l'ago e installare un filtro di cellulosa in acetato da 0,22 m. Riempire diversi tubi di microcentrismo di polipropilene (1,5 mL) che verranno utilizzati per immergere la punta.</li>
	<li>Posizionare i capillari verticalmente in supporti. Abbassare il supporto e immergere la punta nella soluzione glucosio/BSA durante la notte. La soluzione dovrebbe salire di circa 1 cm di altezza per azione capillare.</li>
	<li>Rimuovere la punta della pipetta dalla soluzione glucosio/BSA. Preparare 5 mL di 0,1 M di soluzione di glucosio (diluire 90 mg di polvere di glucosio in 5 mL di acqua pura) e filtrare attraverso un filtro di cellulosa in acetato da 0,22 m.</li>
	<li>Riempire la pipetta con la soluzione di glucosio utilizzando una siringa di vetro da 500 o L dotata di un capillare di silice fusa flessibile. Quindi, rimuovere tutta la soluzione di glucosio succhiandoindietrolo e scartarlo (Figura 2). Ripetere questo passaggio più volte per rimuovere il BSA senza limiti.</li>
</ol>3. Formazione di GUV e GHUV mediante elettroformazione
NOTA: L'elettroformazione è una tecnica di uso comune sviluppata da Angelova9. Le procedure per ottenere una camera di elettroformazione, depositare una pellicola lipidica o polimerica (o entrambe per GHUV (Giant Hybrid Unilamellar Vesicles)) e idratare la pellicola sotto un campo elettrico alternativo sono descritte di seguito. Viene descritta anche la procedura per raccogliere il GUV ottenuto.
<ol><li>Preparazione di soluzioni anfifile, saccarosio e glucosio<ol>
<li>Preparare una soluzione anfifila ad una concentrazione di 1 mg/mL. Pesare 10 mg di anfifilo e sciogliere in 10 mL di cloroformio. Mantenere la soluzione in fiale sigillate per evitare l'evaporazione del solvente.</li>
		<li>Preparare una soluzione di riserva di 1,2 dioleoyl-sn-glicero-3-phoseothanolamine-N-(lissamina rhodamine B sulfonyl) (DOPE-Rhod) a 1 mg/mL in cloroformio.</li>
		<li>Aggiungere 10 ll di lipidico fluorescente alla soluzione anfifilo. Conservare le soluzioni in fiale sigillate per evitare l'evaporazione del solvente.</li>
		<li>Preparare soluzioni di saccarosio e glucosio ad una concentrazione di 0,1 M. Pesare 342 mg e 180 mg di saccarosio e glucosio, rispettivamente, e scioglierli in 10 mL di acqua pura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della camera di elettroformazione NOTA: Diversi materiali conduttivi possono essere utilizzati per creare un dispositivo di elettroformazione (ad esempio, fili di platino10, aghi inossidabili11). La camera di elettroformazione è composta da due diapositive ITO separate da un distanziale in gomma O-ring che è stato tagliato su un lato per creare un'apertura. I vetrini sono collegati a un generatore di tensione tramite due fili elettrici (Figura 3 e Figura 4A).<ol>
<li>Pulire i vetrini ITO con solvente organico (ad esempio, cloroformio). Identificare la superficie conduttiva utilizzando un ohmmeter.</li>
		<li>Fissare i fili elettrici sul lato conduttivo utilizzando nastro adesivo.</li>
		<li>Deposizione di soluzioni anfifili<ol>
<li>Immergere un capillare nella soluzione fino a quando il livello aumenta per azione capillare e raccogliere circa 5 ll della soluzione.</li>
			<li>Mettere il capillare a contatto con il centro della lastra di vetro ITO e stendere delicatamente la soluzione. Attendere 10 secondi per garantire l'evaporazione completa del solvente (Figura 4A).</li>
			<li>Ripetere questa procedura 3 volte per ogni lato.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere uno strato di grasso privo di silicio su entrambi i lati del distanziale O-anello aperto. Mettilo intorno all'area di deposizione. Posizionare la faccia conduttiva della seconda lastra di vetro ITO sulla parte superiore del distanziale.</li>
		<li>Posizionare la camera di elettroformazione sotto vuoto per 3 ore per rimuovere eventuali tracce di solvente organico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedura di elettroformazione<ol>
<li>Collegare i fili elettrici al generatore.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti impostazioni per il generatore: Tensione sinusoidale alternativa Frequenza: 10 Hz Ampiezza: 2 Vpicco-picco NOTA: per ogni sistema è necessario trovare la frequenza e la durata di tensione ottimali.</li>
		<li>Assicurarsi che la tensione venga applicata prima dell'iniezione della soluzione nella camera.</li>
		<li>Iniettare 1 mL di soluzione utilizzando una siringa con ago di diametro interno da 0,8 mm per riempire la camera. Rimuovere eventuali bolle.</li>
		<li>Lasciare che la camera sotto la tensione/frequenza applicata per 75 min (Figura 4B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccolto DI ILVI<ol>
<li>Spegnere il generatore.</li>
		<li>Utilizzando 1 mL di siringa con ago di diametro interno di 0,8 mm, aspirare una piccola parte della soluzione per produrre una bolla d'aria all'interno della camera. Inclinare leggermente la camera per far muovere questa bolla all'interno della camera. Questo può aiutare i GUV a staccarsi dalla superficie ITO (Figura 4C).</li>
		<li>Succhiare tutta la soluzione e trasferirla in un tubo di plastica da 1 mL.</li>
		<li>Rimuovere i fili e pulire i vetrini ITO con solventi organici (toluene poi cloroformio).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Micromanipolazione allestita
NOTA: Il principio dell'aspirazione delle micropipette è quello di succhiare una singola vescica attraverso una micropipetta di vetro applicando una depressione. La lunghezza della lingua all'interno della pipetta viene misurata in funzione della pressione di aspirazione. Il rivestimento pipetta con BSA, descritto in precedenza, è essenziale per prevenire o ridurre al minimo qualsiasi adesione tra le membrane vescicli e la pipetta.
Il protocollo è illustrato di seguito.
<ol><li>Collegamento del serbatoio con pipetta e pieno d'acqua NOTA: Il serbatoio pieno d'acqua e il micrometro sono fissati a una piastra scorrevole. Un contatore digitale con testa di micrometro consente uno spostamento verticale del dispositivo in un intervallo compreso tra 0 e 2,5 cm e una precisione di 1 m. Spostamento lungo un rallo ottico in alluminio è possibile fino a 1 metro di lunghezza. Un tubo di silicio collega il serbatoio e il supporto capillare (Figura 5A).<ol>
<li>Riempire il serbatoio con acqua pura. Collegare una siringa usa e getta da 5 mL al supporto metallico capillare tramite tubi in silicone e aspirare per creare un flusso d'acqua dal serbatoio al supporto.</li>
		<li>Toccare leggermente il tubo per eliminare le bolle d'aria. Contemporaneamente, sollevare il serbatoio dell'acqua per creare una pressione positiva. La siringa da 5 mL è ancora attaccata al supporto.</li>
		<li>Dopo il rivestimento e le fasi di pulizia descritte in precedenza (vedi passo 2), riempire un capillare con soluzione di glucosio fino a quando una goccia si forma alla fine. Rimuovere il tubo della siringa dal supporto metallico per creare un leggero flusso d'acqua alla sua estremità.</li>
		<li>Ruotare il capillare a testa in giù e collegare la goccia di glucosio con il flusso d'acqua dal supporto. Fissare il capillare e il supporto avvitandoli insieme.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionare una pipetta NOTA: Durante questa operazione, il serbatoio dell'acqua è ancora posizionato sulla rotaia di alluminio per mantenere una pressione positiva.<ol>
<li>Prendere il palco in alluminio fatto in casa dotato di due vetrini di vetro (precedentemente puliti con etanolo) e incollarli con grasso sottovuoto su ogni lato. Installarlo sullo stadio del microscopio e formare un menisco tra i due vetrini utilizzando una siringa da 1 mL contenente 0,1 M di glucosio, come mostrato nella Figura 5B,C.</li>
		<li>Posizionare la pipetta e il suo supporto sull'unità motore del micromanipolatore e stringere la manopola di bloccaggio.</li>
		<li>Utilizzare il joystick del pannello di controllo in modalità grossolana per abbassare la micropipetta vicino al menisco di glucosio. Regolare la posizione della punta al centro del menisco utilizzando la modalità fine.</li>
		<li>Tenere la punta immersa nel glucosio per alcuni minuti per pulire la sua superficie esterna ed interna (come una pressione positiva viene mantenuta, il flusso d'acqua risciacquare la superficie interna della pipetta per rimuovere LA BSA non rivestita).</li>
		<li>Conservare la posizione della punta sulla tastiera del micromanipolatore e ritirarla dal menisco.</li>
		<li>Rimuovere il menisco di glucosio e sostituirlo con uno nuovo. Succhiare 2 L di GUV in 0,1 M di saccarosio utilizzando una micropipetta da 20 l e metterla nel menisco di glucosio fresco. Osservare in modalità DIC (contrasto di interferenza differenziale) i GUV situati nella parte inferiore a causa della differenza di densità tra saccarosio (principalmente all'interno dei GUV) e glucosio (principalmente al di fuori dei GUV).</li>
		<li>Quando le vesciche sono leggermente sgonfie, reinserire la pipetta di aspirazione e concentrarsi sulla punta. Impostare l'altezza H0 del serbatoio dell'acqua per il quale la pressione è quasi 0. Per questo, approfittare di piccole vesciche o particelle che sono naturalmente presenti in soluzione e regolare l'altezza del serbatoio dell'acqua fino a quando il movimento di queste particelle è fermato.</li>
		<li>A questo punto, circondare il menisco con olio minerale per evitare l'evaporazione dell'acqua, vedere Figura 5D. NOTA: La temperatura ambiente deve essere controllata tra i 20 e i 22 gradi centigradi utilizzando l'aria condizionata.</li>
	</ol></li>
	<li>Esperimento di aspirazione micropipette<ol>
<li>Abbassare la punta della pipetta (6-12 m di diametro) e creare una piccola aspirazione (-1 cm) per aspirare una vescica (15-30 m di diametro). La membrana della vescica selezionata dovrebbe leggermente fluttuare e non deve presentare difetti visibili (nessun bocciolo o filamento) (Figura 6).</li>
		<li>Sollevare la pipetta ad un livello superiore per isolare la vescica aspirata dalle altre vesciche, utilizzando il micromanipolatore e mantenere questa posizione durante l'intero esperimento.</li>
		<li>Pre-stressare la vescica abbassando il serbatoio pieno d'acqua a circa -10 cm, quindi diminuire la pressione per tornare al suo valore iniziale (-1 cm). Ripetere questo passaggio più volte per rimuovere l'eccesso di membrana e piccoli difetti dalla membrana.</li>
		<li>Da un'altezza di -0,5 cm definita dalla posizione del serbatoio dell'acqua, diminuire lentamente la pressione di aspirazione con il micrometro per raggiungere un regime in cui la membrana fluttua. Quindi aumentare la pressione per visualizzare chiaramente una lingua nella punta con una lunghezza di proiezione significativa (pochi micron). NOTA: la pressione applicata più bassa (P0) che consente di aspirare la lunghezza di proiezione della membrana più piccola (L0) definirà il punto di riferimento :0 (Figura 7A). Tutti i punti della curva saranno misurati in base a questo riferimento (zl - L-L0 e P - P-P0).</li>
		<li>Aumentare la pressione di aspirazione con il micrometro in modo graduale fino a raggiungere 0,5 -0,8 mN/m. Ad ogni passo, attendere 5 s e scattare un'istantanea della lingua. Questa procedura a bassa tensione consente la determinazione del modulo di piegatura.</li>
		<li>Continuare ad aumentare la pressione di aspirazione da 0,5 mN/m alla tensione di rottura regolando l'altezza dell'acqua riempita scivolando sulla rotaia (che va da -2 a -50 cm) (Figura 7B-D). Da questo esperimento a regime ad alta tensione, saranno misurati il modulo di comprimibilità dell'area, la tensione di lisi e il ceppo di lisi.</li>
		<li>Allungare circa 15-20 vesciche per acquisire statistiche significative. Ogni esperimento di aspirazione delle micropipette dura da 7 a 10 minuti. Eseguire l'analisi delle immagini utilizzando il software LASAF per misurare la lunghezza di proiezione della lingua, il diametro delle vesciche e il raggio del capillare.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurazione del modulo di flessione, modulo di comprimibilità dell'area, tensione del lisi e deformazione di lisi<ol>
<li>Per accedere a questi parametri, utilizzare il formalismo stabilito da E. Evans12. Calcolare la pressione di aspirazione applicata sulla membrana dall'equazione 1: P (h-h0) (1) dove g è l'accelerazione gravitazionale (9,8 m ss s 2),w è la densità dell'acqua (1 g dicm) h è la posizione del serbatoio dell'acqua e h0 è la posizione iniziale in cui la pressione è uguale a zero.</li>
		<li>Calcolare la tensione della membrana dall'equazione di Laplace: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq1.jpg">(2) dove la pressione di aspirazione sulla micropipetta, Rp e Rv sono rispettivamente i raggi micropipette e vescicolari (al di fuori della micropipetta). La deformazione della superficie (z) della membrana è definita come: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq2.jpg">(3) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq3.jpg">essere l'area della membrana della vescica alla pressione di aspirazione più bassa.</li>
		<li>Calcolare il valore di z dall'aumento della lunghezza di proiezione, l of vescicolo all'interno della punta capillare secondo l'equazione 412: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq4.jpg">(4)</li>
		<li>Sotto un regime di tensione molto bassa, l'arrotondamento delle ondulazioni termiche di piegatura domina l'apparente espansione. Traccia ln(' ) vs. A valori bassi (in genere 0,001-0,5 mN.m113), si ottiene una linea retta la cui pendenza è collegata al modulo di piegatura, Kb (primo termine dell'equazione 5)14: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq5.jpg">(5) NOTA: In alta tensione (&gt; 0,5 mN.m), le ondulazioni a membrana sono completamente soppresse e l'area della membrana aumenta a causa di una maggiore spaziatura tra le molecole. In questo regime, il secondo termine dell'equazione 5 domina e dà accesso al modulo di comprimibilità dell'area Ka (Figura 8 e Figura 9).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il rivestimento della micropipetta è uno dei punti chiave per ottenere misurazioni affidabili. L'adesione della vescica alla micropipetta deve essere prevenuta, e un rivestimento è comunemente usato nella letteratura17,18,19,20,21, con BSA, zo-casein o surfasil. I dettagli della procedura di rivestimento sono raramente menzionati.
L...

Le vesciche giganti ottenute dai fosfolipidi (liposomi) sono state ampiamente utilizzate fin dagli anni '70 come modello di membrana cellulare di base1. Alla fine degli anni '90, le morfologie vescicolari ottenute dall'auto-assemblaggio dei polimeri, chiamati polimeriini in riferimento ai loro analoghi lipidi2,3, sono apparse rapidamente come un'interessante alternativa ai liposomi che possiedono una debole stabilità meccanica e scarsa funzionalità chimica modulare. Tuttavia, il loro carattere biomimetico cellulare è piuttosto limitato rispetto ai liposomi poiché questi ultimi sono composti da fosfolipidi, il componente principale della membrana cellulare. Inoltre, la loro bassa permeabilità della membrana può essere un problema in alcune applicazioni come la somministrazione di farmaci in cui è necessaria la diffusione controllata delle specie attraverso la membrana. Recentemente, l'associazione dei fosfolipidi con i copomeri a blocchi per progettare vescicoli polimerici e membrane ibride è stata oggetto di un numero crescente di studi4,5. L'idea principale è quella di progettare entità che combininino in modo sinergico i benefici di ogni componente (bio-funzionalità e permeabilità dei bistrati lipidi con la stabilità meccanica e la versatilità chimica delle membrane polimeriche), che possono essere sfruttate in diverse applicazioni: somministrazione controllata e mirata di farmaci, riconoscimento biomolecolare all'interno di biosensori per la diagnosi, membrane funzionali per le cellule artificiali, sviluppo di microreattori bio-ispirati.
Al giorno d'oggi, diverse comunità scientifiche (biochimici, chimici, biofisici, fisici chimici, biologi) hanno crescente interesse per lo sviluppo di un modello di membrana cellulare più avanzato. Qui, il nostro obiettivo è quello di presentare, nel modo più dettagliato possibile, metodologie esistenti (elettroformazione, aspirazione micropipette) per ottenere e caratterizzare le proprietà meccaniche delle vescicoli giganti e i recenti modelli a membrana cellulare "avanzati" che sono vescicoli giganti lipidi polimeriici ibridi4,5.
Lo scopo di questi metodi è quello di ottenere una misurazione affidabile della comprimibilità dell'area e della moduli di flessione della membrana, nonché il loro stress e tensione di lisi. Una delle tecniche più comuni esistenti per misurare la rigidità di piegatura di una vescica gigante è l'analisi della fluttuazione6,7, basata sull'osservazione diretta del microscopio video; ma questo richiede una grande fluttuazione visibile della membrana, e non è sistematicamente ottenuto su membrane spesse (ad esempio polimero). Il modulo di comprimibilità dell'area può essere determinato sperimentalmente utilizzando la tecnica Langmuir Blodgett, ma il più delle volte su un monostrato8. La tecnica di aspirazione delle micropipette consente la misurazione di entrambi i moduli su un bistrato che formano la vescicle unilamellar gigante (GUV) in un esperimento.
Il seguente metodo è appropriato per tutte le molecole di anfifianco o macromolecole in grado di formare bistrati e, di conseguenza, vescicoli per elettroformazione. Ciò richiede un carattere fluido del biostrato alla temperatura dell'elettroformazione.

<table><tbody><tr><td>Attrezzatura e materiali necessari per la progettazione di micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td>diametro esterno e interno rispettivamente di 1 mm e 0,58 mm.</td></tr><tr><td>Filamento installato</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>FB255B</td><td>2,5 mm * 2,5 mm scatola filamento</td></tr><tr><td>fiammante / marrone estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modello P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>NARISHGE Co.</td><td>MF-900</td><td>dotato di due obiettivi (10x e 32x)</td></tr><tr><td>Materiali per il rivestimento di puntali per pipette con BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso da 1 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso da 10 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>626616</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso da 5 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td></td></tr><tr><td>Filtro monouso in acetato di cellulosa</td><td>Cluzeau Info Labo</td><td>L5003SPA</td><td>Dimensione dei pori: 0,22&micro; m, diametro: 25 mm</td></tr><tr><td>Tubo capillare flessibile in silice fusa Polymicro</td><td>Technologies.</td><td>TSP530660</td><td>Diametro interno 536&micro; m, Diametro esterno 660&micro; m,Glucosio</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 500 &micro; L luer Lock GASTIGHT</td><td>Hamilton Syringe Company</td><td>1750</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore rotativo per provette</td><td>Labinco</td><td>28210109</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolazione Configurazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guida ottica in alluminio, lunghezza 1000 mm, filettature M4, serie X48</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavolo ottico smorzato</td><td>Newport</td><td></td><td>utilizzato come supporto del microscopio per prevenire le vibrazioni esterne.</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP 2</td><td>L'unità modulo (unità motore per il movimento X, Y e Z) è montata sul microscopio invertito tramite un adattatore.</td></tr><tr><td>Micrometro</td><td>Mitutoyo Corporation</td><td>350-354-10</td><td>Digimatic LCD Testina micrometrica 25,4 mm Portata 0,001 mm</td></tr><tr><td>Serbatoio acqua in plexiglass (100 ml)</td><td>Microscopio</td> confocale invertito TCS SP5 (<td></td><td></td></tr><tr><td>DMI6000) fatto in casa dotato di scanner risonante e obiettivo ad immersione in acqua (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X48 Rail Carrier 80 mm Lunghezza, con filettatura 1/4-20, 8-32 e 4-40</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiali per la preparazione di soluzioni di saccarosio e anfifili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank"> 2-Oleoil-1-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina</a></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR</td><td>22711.244</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatidiletanolammina-N-(lissamina rodamina B sulfonil)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810146C</td><td>Rodamina taggato lipidi</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Elettroformazione configurazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L tappi capillari in vetro</td><td>Hirschmann</td><td>9600110</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso da 1 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>H Grease</td><td>Apiezon</td><td>Apiezon H Grease</td><td>Grasso senza silicone</td></tr><tr><td>Vetrini rivestiti in ossido di indio e stagno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>703184</td><td></td></tr><tr><td>Needle</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td>0,8 x 38 mm</td></tr><tr><td>Ohmmetro (multimetro)</td><td>Voltcraft</td><td>VC140</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>VWR</td><td>28676.297</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di tensione</td><td>Keysight</td><td>33210A</td><td></td></tr></tbody></table>

obsistenza di giant unilamellar hybrid vesicles by electroformation and measurement of their mechanical properties by micropipette aspiration

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Le vesciche giganti ottenute da fosfolipidi e copolimeri possono essere sfruttate in diverse applicazioni: somministrazione controllata e mirata di farmaci, riconoscimento biomolecolare all'interno di biosensori per la diagnosi, membrane funzionali per cellule artificiali e sviluppo di micro/nanoreattori bioispirati. In tutte queste applicazioni, la caratterizzazione delle loro proprietà della membrana è di fondamentale importanza. Tra le tecniche di caratterizzazione esistenti, l'aspirazione di micropipette, introdotta da E. Evans, consente la misurazione delle proprietà meccaniche della membrana come il modulo di comprimibilità dell'area, la piegatura del modulo e lo stress e la deformazione della lisi. Qui, presentiamo tutte le metodologie e le procedure dettagliate per ottenere vesciche giganti dalla pellicola sottile di un lipidico o un polimero (o entrambi), la produzione e il trattamento superficiale delle micropipette, e la procedura di aspirazione che porta alla misurazione di tutti i parametri sopra menzionati.

Con il protocollo di cui sopra, abbiamo studiato diversi vescicoli di unilamellar sintetico sintetico (GUV), ottenuti da un fosfolipidide: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), un copolimero di triblocco: Poly(ethyleneoxide)-b-Poly(dimetilsiloxane) -b-Poly(etileneossido) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12)sintetizzato in uno studio precedente13, e un copolimero disblocco Poly(dime...

L'obiettivo del protocollo è quello di misurare in modo affidabile le proprietà meccaniche della membrana delle vesciche giganti mediante aspirazione alla micropipetta.

Obsistenza di Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Questo protocollo facilita una misurazione affidabile delle proprietà meccaniche della membrana della vescicola lipidica polimerica sintetica e reale utilizzando una tecnica di aspirazione di micropipette. Questa è l'unica tecnica che consente di allungare la flessibilità e l'instabilità della membrana in singoli esperimenti. Questo protocollo prevede una serie di procedure, dalla preparazione della vescicola alla valutazione meccanica.È molto importante essere pazienti e risolvere eventuali problemi tecnici man mano che si presentano. La visualizzazione su queste tecniche è fondamentale per capire come trattare correttamente la superficie capillare e come eseguire la fase di precompresso obbligatoria. Mostrando la vescicola senza difetti.A dimostrare la procedura sarà Martin Fauquignon, dottorando del laboratorio che lavora allo sviluppo di vescicole lipidiche polimeriche ibride. Prima di iniziare la procedura posizionare i capillari di micropipette di vetro freddo verticalmente nei supporti. E abbassare i supporti fino a quando le punte sono immerse nella soluzione di albumina di siero bovino di glucosio appena preparata durante la notte.Entro la mattina successiva la soluzione dovrebbe essere salita di circa un centimetro nelle punte per azione capillare. Utilizzando una siringa in vetro da 500 microliter, dotata di un capillare flessibile di silice fusa, riempire ogni pipetta con la soluzione di glucosio. Quindi aspirare la soluzione da ogni pipetta, prima di riempire le pipette con soluzione di glucosio fresco più volte fino a quando tutto il siero non è stato rimosso.Per preparare una camera di elettroformazione, pulire prima le diapositive ITO con un solvente organico appropriato e identificare la superficie conduttiva con un Ohmeter. Attaccare fili elettrici sul lato conduttivo di ogni diapositiva con nastro adesivo. Immergere un capillare in soluzione ampiviale fino a quando circa 5 microlitri della soluzione sono stati raccolti per azione capillare.Posizionare il capillare caricato a contatto con il centro di una piastra ITO in vetro e stendere delicatamente la soluzione attraverso lo scivolo. Quando il solvente è completamente evaporato, applicare la soluzione altre due volte come appena dimostrato. prima di aggiungere uno strato di grasso privo di silicio su entrambi i lati del distanziale O-ring aperto intorno all'area di deposizione.Quindi, posizionare la faccia conduttiva di una seconda lastra di vetro ITO sulla parte superiore del distanziale e posizionare la camera di elettroformazione sotto vuoto per 3 ore per rimuovere eventuali tracce di solvente organico. Per l'elettroformazione delle vescicole unilamellari giganti, collegare i fili elettrici al generatore. Impostare la frequenza del generatore su 10 Hertz, e l'ampiezza su 2 Volt, picco al picco.Una volta impostata la tensione, utilizzare una siringa dotata di un ago di diametro interno di 0,8 millimetri per iniettare un millilitro di soluzione di saccarosio molare 0,1 nella camera e lasciare la camera sotto la tensione e la frequenza applicate per 75 minuti. Al termine dell'elettroformazione, spegnere il generatore. E utilizzare la siringa da un millilitro per aspirare un piccolo volume di soluzione fino a quando non viene prodotta una bolla d'aria all'interno della camera.Inclinare leggermente la camera per spostare la bolla nella camera e per aiutare le vescicole a staccarsi dalla superficie di scorrimento. E aspirare l'intero volume di soluzione nella siringa. Quindi, trasferire la soluzione di vescicola in un tubo di plastica da un millilitro.Per impostare i materiali per la micromanipolazione, aspirare a creare un flusso d'acqua, un serbatoio di acqua pura, a un supporto. E toccare leggermente mentre si solleva il serbatoio per eliminare eventuali bolle d'aria e creare pressione positiva. Riempire un capillare rivestito di siero con soluzione di glucosio fresco fino a quando non si forma una goccia sulla punta.Rimuovere i tubi della siringa dal supporto metallico per creare un leggero flusso d'acqua all'estremità del supporto e capovolgere il capillare per collegare la goccia di glucosio al flusso d'acqua. Quindi, avvitare il capillare e il supporto insieme. Per posizionare la pipetta, incollare due vetrini da uno stadio di alluminio su misura insieme al grasso sottovuoto.E installare le diapositive su una fase di microscopio. Usando una pipetta millilitro, formare un menisco tra le due diapositive con 0,1 glucosio molare. Posizionare la pipetta e il suo supporto sull'unità motore del micromanipolatore.Stringere la manopola di bloccaggio e utilizzare il joystick del pannello di controllo in modalità grossolana. Abbassare la micropipetta vicino al menisco di glucosio. Utilizzare la modalità fine per regolare la posizione della punta al centro del menisco.Immergere la punta nel glucosio per pulirne le superfici esterne ed interne. Dopo alcuni minuti, ritirare il capillare dal menisco e sostituire il glucosio con un menisco fresco. Aspirare due microlitri di vescicole unilamellari giganti in saccarosio molare 0,1, in una punta di micropipetta da 20 millilitri.Introdurre le vescicole nel menisco. Utilizzare il microscopio per osservare le vescicole nella parte inferiore della camera scorrevole. Quando le vescicole sono leggermente sgonfie, reinserire la pipetta di aspirazione e concentrarsi sulla punta della pipetta.Quindi impostare l'altezza di base del serbatoio dell'acqua sulla pressione alla quale viene fermato il movimento delle particelle. Circondare il menisco con olio minerale per evitare l'evaporazione. Per eseguire un esperimento di aspirazione della micropipetta, abbassare la punta della pipetta nel menisco.Creare una piccola quantità di pressione di aspirazione per aspirare una vescicola. La membrana della vescicola selezionata dovrebbe fluttuare leggermente e non presentare difetti visibili. Utilizzare il micromanipolatore per alzare la pipetta a un livello superiore per isolare la vescicola aspirata da altre vescicole.Abbassare il serbatoio dell'acqua a circa 10 centimetri per precompressire la vescicola prima di sollevare il serbatoio per riportare la pressione al valore iniziale. Da un'altezza di 0,5 centimetri, diminuire lentamente la pressione di aspirazione fino a raggiungere una pressione alla quale la membrana fluttua. Quindi aumentare la pressione per visualizzare chiaramente una lingua nella punta, la lunghezza di proiezione di alcuni micron.Per determinare il modulo di piegatura, aumentare la pressione di aspirazione, un micrometro alla volta in modo graduale. Fino a quando non viene raggiunto da 0,5 a 0,8 milliNewton per metro. Attendere cinque secondi e scattare un'istantanea della lingua dopo ogni passaggio.Per determinare il modulo di comprimibilità dell'area e la tensione e la tensione dellalisi continuano ad aumentare la pressione di aspirazione da 0,5 milliNewton per metro fino a raggiungere la tensione di rottura. In questo esperimento rappresentativo il modulo di comprimibilità dell'area e il ceppo di lysis per POPC erano in perfetto accordo con quello previsto dalla letteratura. In questa tabella si possono osservare valori tipici per i polimeri ottenuti.Si noti che la tenacità della membrana ottenuta dai copolimeri di blocco è di gran lunga maggiore di quelle ottenute dal copolimero triblocco. È interessante notare che, utilizzando il copolimero di blocco, è possibile ottenere vescicole polimeriche lipidiche unilamilari ibride giganti che dimostrano una tenacità più robusta di quella misurata per i liposomi. Questo protocollo può essere utile per misurare la vescicola con una pipetta, ad esempio, per misurare la permeabilità della membrana attraverso uno shock asmatico.Assicurati di completare ogni passaggio con rigore e precisione, specialmente quando si imposta la connessione della tribuna. Questa tecnica è stata sfruttata per comprendere l'origine fisica della fissione a membrana, attraverso la misurazione della tensione della linea ai confini principali nelle vescicole modificate.

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Chimica

Ricostituzione di proteine ​​di membrana funzionale in liposomi giganti di composizione definita è un approccio efficace quando combinato con elettrofisiologia patch-clamp. Tuttavia, la produzione convenzionale di liposomi gigante può essere incompatibile con la stabilità della proteina. Descriviamo i protocolli per la produzione di liposomi giganti di lipidi puri o piccoli liposomi contenenti canali ionici.

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

Getto microfluidica contro un doppio strato lipidico interfaccia gocciolina fornisce un modo affidabile per generare vescicole con controllo sulla asimmetria membrana, incorporazione di proteine ​​transmembrana, e incapsulamento del materiale. Questa tecnica può essere applicata a studiare una varietà di sistemi biologici in cui sono determinanti biomolecole compartimenti.

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

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Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

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Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

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Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Questo articolo presenta un metodo per la preparazione di vescicole unilamellari giganti composte (cGUV) con una struttura vescicola nella vescicola, con conducibilità elettrica personalizzata nelle regioni interne, anulari ed esterne. L'elettroformazione sintetizza semplici GUV, che vengono trasformati in stomatociti e cGUV tramite shock osmotico, fornendo un modello prezioso per lo studio della biofisica delle cellule nucleate.

Sintesi di vescicole unilamellari giganti composte: un modello biomimetico di cellule nucleate

Questa guida per principianti presenta un protocollo generale per la preparazione di vescicole unilamellari giganti (GUV) tramite il metodo del trasferimento di goccioline, discutendo i passaggi critici e fornendo approfondimenti per aiutare le possibili regolazioni necessarie per diverse applicazioni, tra cui la biologia sintetica e la microrobotica.

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Scopri la misura delle proprietà meccaniche delle membrane di vescicole lipidiche polimeriche sintetiche mediante aspirazione con micropipetta. Questa tecnica consente di valutare flessibilità e instabilità in esperimenti singoli.

Obsistenza di Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration (Video) | JoVE Journal

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