Name: Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Scopri come stabilire coculture basate su una singola cellula con un chip microfluidico per analizzare le interazioni cellulari in tempo reale. Questo metodo offre alta efficienza di cattura e tracciamento dinamico.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Ministero della Scienza e della Tecnologia (105-2628-E-400-001-MY2), e dal Ph.D. Program in Ingegneria dei Tessuti e Medicina Rigenerativa, dalla National Chung Hsing University e dagli Istituti nazionali di ricerca sulla salute.

1. Fabbricazione di uno stampo di wafer mediante litografia morbida
NOTA: i dati del modello maschera sono disponibili nella pubblicazione precedente14.
<ol><li>Disidratare un wafer di silicio da 4 pollici in un forno a 120 gradi per 15 min.</li>
	<li>Cappotto di rotazione 4 g di SU-8 2 fotoresist negativo su un wafer di silicio da 4 pollici a 1.000 giri/m per 30 s per creare uno strato di 5 m di spessore (strato #1).</li>
	<li>Cuocere lo strato morbido #1 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min e poi trasferire lo strato #1 a una piastra calda di 95 gradi per 3 min.</li>
	<li>Strato freddo #1 a temperatura ambiente, posizionarlo sul supporto dell'allineatore maschera semi-automatico e allineare con il livello #1 fotomaschera cromata (strato di sito di cattura).</li>
	<li>Esponi lo strato #1 con una luce UV a 365 nm a una dose di 150 mJ/cm2.</li>
	<li>Togliere lo strato #1 dall'allineatore e post-cuocere su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min #1.</li>
	<li>Strato fresco #1 a temperatura ambiente. Immergere in una soluzione di eteato monomeil del glicole propilene per lavare via il fotoresist non collegato per 2 min #1.</li>
	<li>Coprire lo strato #1 segno di allineamento con un nastro adesivo, ruotare il cappotto 4 g di SU-8 10 fotoresist negativo sullo strato #1 a 1.230 giri per 30 s per creare uno strato di 25 m di spessore #2.</li>
	<li>Togliere il nastro, strato di cuocere morbido #2 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 3 min, quindi trasferire lo strato #2 a una piastra calda di 95 gradi per 7 min.</li>
	<li>Strato freddo #2 alla temperatura ambiente, posizionate il livello #2 sul supporto dell'allineatore semiautomatico della maschera e allineate il livello #2 fotomaschera placcata in cromo (strato di canale di bypass) al livello #1 segno di allineamento.</li>
	<li>Esponi lo strato #2 con una luce UV a 365 nm a una dose di 200 mJ/cm2.</li>
	<li>Togliere lo strato #2 dall'allineatore e post-cuocere su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min e trasferire lo strato #2 a una piastra calda di 95 gradi per 3 min.</li>
	<li>Strato fresco #2 a temperatura ambiente e coprire lo strato #1 segno di allineamento con nastro adesivo. Cappotto di rotazione 4 g di SU-8 2050 fotoresist negativo su #2 a 1.630 rpm per 30 s per creare uno strato di 100 m di spessore #3.</li>
	<li>Togliere il nastro, strato di cuocere morbido #3 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 5 min, quindi trasferire lo strato #3 a una piastra calda di 95 gradi per 20 min.</li>
	<li>Strato freddo #3 alla temperatura ambiente, posizionate il livello #3 sul supporto dell'allineatore semiautomatico della maschera e allineate il livello #3 fotomaschera placcata in cromo (strato della camera di coltura) al livello #1 segno di allineamento.</li>
	<li>Esporre i #3 di strati con luce UV a 365 nm a una dose di 240 mJ/cm2.</li>
	<li>Togliere lo strato #3 dall'allineatore e post-cuocere su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 5 min #3.</li>
	<li>Strato fresco #3 a temperatura ambiente. Immergere in una soluzione di eteato monomeil di glicole propilene per lavare via il fotoresist non collegato per 10 minuti e asciugare delicatamente con gas di azoto.</li>
</ol>2. Preparazione del dispositivo PDMS per l'acquisizione di più celle
<ol><li>Mettere lo stampo del wafer e la teglia contenente 100 -L di triclorosilalla in un desiccatore (solo per insilanizzazione) e applicare un vuoto (-85 kPa) per 15 min. NOTA: Silanizzare la superficie del wafer con trichlorosilane per creare proprietà di superficie idrofobiche prima della colata PDMS in modo che possa essere staccata senza sforzo dallo stampo wafer PDMS.</li>
	<li>Fermare il vuoto, quindi insidiare lo stampo del wafer nel desiccatore (solo per la silanizzazione) a 37 gradi centigradi per almeno 1 h.</li>
	<li>Mescolare la base PDMS e l'agente di polimerità PDMS in un rapporto di 10:1. Versare un totale di 20 g di PDMS mista sullo stampo del wafer in un piatto di 15 cm.</li>
	<li>Mettere il piatto di 15 cm in un desiccatore e applicare il vuoto (-85 kPa) per 1,5 min. Quindi rimuovere il piatto di 15 cm dal desiccatore. Conservare per 20 min a temperatura ambiente. Infine, rimuovere le bolle d'aria residue nel PDMS con gas di azoto.</li>
	<li>Mettere il piatto di 15 cm in forno a 65 gradi centigradi per 2-4 h per curare la PDMS.</li>
	<li>Rimuovere la replica PDMS dallo stampo del wafer, quindi eseguire un'uscita da 1,5 mm e una presa di 0,5 mm sul PDMS utilizzando un diametro interno di 1,5 mm e un perforatore di diametro interno di 0,5 mm (Figura 1C).</li>
	<li>Pulire la replica PDMS e la superficie di scorrimento con nastro rimovibile e quindi trattare la superficie con plasma di ossigeno (100 W per 14 s).</li>
	<li>Allineare manualmente le repliche PDMS con la diapositiva e metterle in contatto tra loro.</li>
	<li>Mettere la vetritta PDMS in un forno a 65 gradi centigradi per 1 giorno. NOTA: L'incollaggio permanente tra la diapositiva e la replica PDMS si ottiene per formare il dispositivo.</li>
	<li>Immergere il dispositivo PDMS in un contenitore pieno di fosfato tampone salina e metterlo in un desiccatore. Quindi applicare il vuoto (-85 kPa) per 15 min per rimuovere le bolle d'aria.</li>
	<li>Posizionare il dispositivo PDMS in una cappa di coltura cellulare e sterilizzare il dispositivo con luce UV (lunghezza d'onda luminosa: 254 nm) per 30 min.</li>
	<li>Sostituire il buffer del dispositivo PDMS con un supporto medio (supporto basale DMEM-F12 contenente 1% di antibiotici e 10% siero bovino fetale) e incubare il dispositivo PDMS a 4 gradi centigradi per 1 giorno. Ciò impedisce alle cellule di aderire alla superficie PDMS.</li>
</ol>3. Preparazione di una sospensione a cella singola
NOTA: I tipi di cellule cellulari includono cellule endotiliali linfatiche umane (LEC), cellule OSCC TW2.6 umane che esprimono shRNA specifico wnT5B (WNT5B sh4) e controllo vettoriale (pLKO-GFP) che sono state ottenute dal nostro studio precedente15. Si prega di fare riferimento alla nostra pubblicazione precedente per le fasi di coltivazione dettagliate.
<ol><li>Rimuovere il mezzo di coltura quando le cellule raggiungono 70-80% confluenza. Quindi lavare delicatamente le cellule con 5 mL di PBS sterile tre volte.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di mezzo DMEM-F12 contenente 1 colorante fluorescente in celle WNT5B sh4 e pLKO-GFP (utilizzare il mezzo MV2 per i LEC) e quindi incubare le cellule per 30 min a temperatura ambiente. NOTA: le cellule leC sono state macchiate con colorana diaceta cloromemetilofluoresceina verde (CMFDA), le cellule sh4 WNT5B sono state macchiate con colorante fluorescente blu 7-amino-4-chloromethylcouin (CMAC) e cellule pLKO-GFP sono state macchiate con colorante fluorescente Dil rosso.</li>
	<li>Lavare delicatamente le celle con 5 mL di PBS sterile tre volte.</li>
	<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 2 mL di 0.25% Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin-EDTA per LEC).</li>
	<li>Incubare le cellule per 4 min a temperatura ambiente e quindi toccare delicatamente il piatto di coltura del tessuto per promuovere il distacco delle cellule.</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di cellule medie DMEM-F12 per disperdere le celle WNT5B sh4 e pLKO-GFP (per i LEC utilizzare 3 mL di MV2 medio e 1 mL di soluzione di ritorizzante). Quindi trasferire le cellule in un tubo da 15 mL, e centrifugare a 300 x g per 3 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di Mezzo DMEM-F12. Contare il numero di celle vive in un emocitometro utilizzando il metodo di esclusione Trypan Blue standard16. Preparare 1 mL di sospensione cellulare a 3 x 105 celle/mL di concentrazione nel mezzo DMEM-F12, quindi mantenere le celle sul ghiaccio per impedire l'aggregazione delle cellule. NOTA: Per migliorare l'efficienza di acquisizione a una singola cella, è necessaria un'attenta preparazione della sospensione a cella singola con una sospensione ben dissociata.</li>
</ol>4. Cattura multipla a cella singola e tripla coltura a cella singola
<ol><li>Collegare un tubo poli-tetrafluoroethene (PTFE) tra la presa del dispositivo e la pompa della siringa. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 lofde di sospensione cellulare ad una concentrazione di 3 x 105 celle/mL nell'ingresso del dispositivo PDMS.</li>
	<li>Caricare la sospensione cellulare nel dispositivo con una pompa di siringa ad una velocità di flusso di 0,3 l/min (Figura 2A). La direzione del flusso va dall'ingresso alla presa. NOTA: Caricare immediatamente dopo aver aggiunto la sospensione cellulare nell'ingresso per evitare la sedimentazione cellulare.</li>
	<li>Aggiungete 1 -L di Mezzo DMEM-F12 nell'ingresso del dispositivo PDMS dopo il passaggio 4.2.Caricare il supporto DMEM-F12 nel dispositivo con una pompa di siringa a una velocità di flusso di 0,3 l/min (Figura 2B). La direzione del flusso scorreva dall'ingresso alla presa.</li>
	<li>Caricare 0,3 L di DMEM-F12 medio nel dispositivo da una pompa di siringa ad una velocità di flusso di 10 L/min (Figura 2C). La direzione di flusso scorreva dalla presa all'ingresso.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.4 per caricare altri tipi di cella nel dispositivo.</li>
	<li>Dopo aver completato la cattura cellulare, utilizzare un microscopio con lente 4x per visualizzare ogni camera di coltura. NOTA: Le emissioni di fluorescenza delle cellule sono state utilizzate per identificare e contare il numero di singole cellule in ogni camera di coltura.</li>
	<li>Rimuovere il tubo PTFE e sigillare l'uscita e la presa con nastro adesivo per creare un sistema di coltura chiuso.</li>
	<li>Spostare il dispositivo PDMS in un piatto di coltura di 10 cm e aggiungere 10 mL di PBS sterile intorno al dispositivo PDMS per evitare l'evaporazione del mezzo dal dispositivo.</li>
	<li>Trasferire il piatto di coltura in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% di CO2 e 95% di umidità) per una coltura a tripla cellula.</li>
	<li>Osservare e fotografare la crescita delle cellule ogni 12 ore.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le interazioni intercellulari di varie cellule nel microambiente tumorale svolgono un ruolo importante nella progressione del tumore17. Per comprendere il meccanismo delle interazioni cellula-cellula, i sistemi di cocoltura vengono utilizzati come metodo analitico comune. Tuttavia, più tipi di cellule e l'eterogeneità delle cellule stesse hanno portato a complessità sperimentale e difficoltà analitiche.
Il chip di chiusura idrodinamico consente il caricamento di più cel...

L'acquisizione efficiente di diversi tipi di celle singole e la fornitura di spazio di coltura sufficiente sono necessari per esperimenti di cocoltura a cella singola di più tipi di celle singole1. Limitare la diluizione è il metodo più comunemente usato per preparare le singole cellule per tali esperimenti, a causa del basso costo delle attrezzature necessarie. Tuttavia, a causa della limitazione della distribuzione di Poisson, la probabilità massima di acquisizione di una singola cellula è solo del 37%, rendendo l'operazione sperimentale laboriosa e dispendiosa in termini di tempo2. Al contrario, l'utilizzo dello smistamento delle celle attivate a fluorescenza (FACS) può superare la limitazione della distribuzione di Poisson per preparare in modo elevato le singole celle3. Tuttavia, FACS potrebbe non essere accessibile ad alcuni laboratori a causa di costosi costi di strumentazione e manutenzione. I dispositivi microfabbricati sono stati recentemente sviluppati per l'intrappolamento a cella singoladi 4, l'abbinamento a cella singola5e le applicazioni di coltura a cella singola. Questi dispositivi sono vantaggiosi in base alla loro capacità di manipolare con precisione singole celle6, eseguire esperimenti ad alto rendimento o ridurre il consumo di campioni e reagenti. Tuttavia, l'esecuzione di esperimenti di cocoltura a cella singola con più tipi di cellule con gli attuali dispositivi microfluidici è ancora difficile a causa della limitazione della distribuzione di Poisson1,7,8, o l'incapacità di i dispositivi per catturare più di due tipi di celle singole4,5,6,9,10.
Per esempio, Yoon et al. ha segnalato un dispositivo microfluidico per lo studio di interazione cellulare-cellula11. Questo dispositivo utilizza il metodo probabilistico per accoppiare le celle in una camera. Tuttavia, può ottenere solo l'associazione di due diversi tipi di cella a causa di restrizioni geometriche nella struttura del dispositivo. Un altro rapporto di Lee et al. ha dimostrato un metodo deterministico per catturare e accoppiare singole celle12. Questo dispositivo aumenta l'efficienza di accoppiamento con il metodo deterministico, ma è limitato dal tempo di funzionamento prolungato richiesto per accoppiare le celle. In particolare, l'acquisizione della seconda cella può essere eseguita solo dopo che la prima cella catturata è stata attaccata alla superficie dopo che24 h. Possiamo riscontrare che il dispositivo microfluidico a base di gocciolamento è ancora limitato alla distribuzione di Poisson e può essere utilizzato solo su cellule non collegate, e non è possibile modificare la soluzione di coltura durante il processo di coltivazione.
In precedenza, abbiamo sviluppato un "chip di chiusura idrodinamico" microfluidico che utilizza forze idrodinamiche deterministiche per catturare più tipi di cellule singole nella camera di coltura e successivamente può eseguire esperimenti di cocoltura cellulare per analizzare comportamento di migrazione delle singole cellule nelle interazioni cellula-cellula14. Il chip di chiusura idrodinamico comprende un array di unità che contengono ciascuno un canale di passaggio serpentino, un sito di cattura e una camera di coltura. Utilizzando la differenza di resistenza al flusso tra il canale di passaggio serpentino e la camera di coltura, e una procedura operativa appositamente progettata, diversi tipi di singole cellule possono essere ripetutamente catturati nella camera di coltura. In particolare, l'ampio spazio della camera di coltura può non solo impedire che la cellula venga arrossata durante la cattura delle cellule, ma anche fornire spazio sufficiente per le cellule per diffondersi, proliferare e migrare, consentendo l'osservazione di interazioni vive a singola cellula. In questo articolo, ci concentriamo sulla produzione di questo dispositivo e passaggi di protocollo dettagliati.

<table><tbody><tr><td>Nastro medico microfluidico diagnostico poliolefinico avanzato 3M</td><td>Company</td><td>9795R</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutammina-Penicillina-Streptomicina</td></tr><tr><td>Software AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Codice 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Colorante CellTracke CMAC blu</td><td>Invitrogen</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Colorante CMFDA verde</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Forno convenzionale</td><td>YEONG-SHIN azienda</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Essiccatore sottovuoto salvaspazio 190 mm base bianca</td></tr><tr><td>DiIC12 (3) colorante a membrana cellulare BD</td><td>Biosciences</td><td>354218</td><td>Utilizzato come tracker cellulare</td></tr><tr><td>DMEM-F12 medio</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali MV 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino Hyclone</td><td>Thermo</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton serie 700 Siringa di vetro ( 0,1 ml )</td><td>Hamilton</td><td>80630</td><td>100 &; L, modello 710 RN SYR, piccolo NDL rimovibile, 22s ga, 2 pollici, stile punta 2</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core perforatore</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15075</td><td>con</td></tr><tr><td>perforatore Harris Uni-Core</td> da 1,5 mm di diametro interno <td>Ted Pella Inc.</td><td>15071</td><td>con diametro interno di 0,5 mm</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>YOTEC azienda</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak allineatore</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>Plasma di ossigeno</td><td>NORDSON MARCH</td><td>AP-300</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Sistema di trattamento al plasma da banco</td></tr><tr><td>Kit di polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Poli-tetrafluoroetilene (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>diametro interno, 0,51 mm; diametro esterno, 0,82 mm</td></tr><tr><td>Nastro rimovibile</td><td>3M Company</td><td>Scotch Nastro rimovibile 811</td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicone</td><td>Eltech corperazione</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2" ~ 6"</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 10 fotoresist negativi</td><td>MicroChem</td><td>Y131259</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2 fotoresist negativi</td><td>MicroChem</td><td>Y131240</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050 fotoresist negativo</td><td>MicroChem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>sviluppatore SU-8</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td> Pompa a siringa con <td>acetato di glicole propilenico monometilico</td></tr><tr><td></td><td>Apparecchio Harvard</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Triclorosilano</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil. Rischioso. Corrosivo per le vie respiratorie, reagisce violentemente con l'acqua.</td></tr><tr><td>Soluzione neutralizzante della tripsina</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

I saggi di cocoltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule per comprendere meglio la biologia delle malattie tra cui il cancro. Tuttavia, è difficile chiarire il complesso meccanismo delle interazioni intercellulari in popolazioni cellulari altamente eterogenee che utilizzano sistemi di cocoltura convenzionali perché l'eterogeneità della sottopopolazione cellulare è oscurata dai valori medi; i sistemi di cocoltura convenzionali possono essere utilizzati solo per descrivere il segnale della popolazione, ma non sono in grado di monitorare il comportamento delle singole cellule. Inoltre, i metodi sperimentali convenzionali a cella singola hanno una bassa efficienza nella manipolazione cellulare a causa della distribuzione di Poisson. I dispositivi microfabbricati sono una tecnologia emergente per gli studi a cella singola perché possono manipolare con precisione singole cellule ad alta produttività e possono ridurre il consumo di campioni e reagenti. Qui, descriviamo il concetto e l'applicazione di un chip microfluidico per più cocolture unicellulari. Il chip è in grado di catturare in modo efficiente più tipi di singole cellule in una camera di coltura (46%) e dispone di uno spazio di coltura sufficiente utile per studiare il comportamento delle cellule (ad esempio, migrazione, proliferazione, ecc.) sotto l'interazione cellula-cellula a livello di cellula singola. Le cellule endotiliche linfotiche e il carcinoma a cellule squamose orali sono stati utilizzati per eseguire un esperimento di cocoltura a cellule singole sulla piattaforma microfluidica per studi di interazione tra le singole imcellere dal vivo.

Il dispositivo ha una struttura a tre strati come mostrato dalla fotografia trasversale di un dispositivo PDMS tagliato (Figura 1A). Il primo strato contiene un sito di cattura (6,0 m di larghezza e 4,6 m di altezza) che collega la camera di coltura e il canale di passaggio. La differenza di resistenza al flusso tra la camera di coltura e il canale by-pass fa sì che le cellule scorra nella posizione di cattura e riempiono l'ingresso del picco...

Questo rapporto descrive un metodo microfluidico basato su chip per impostare un esperimento di coltura a cella singola in cui è possibile ottenere l'abbinamento ad alta efficienza e l'analisi microscopica di più cellule singole.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

È fondamentale combinare efficacemente l'efficienza di acquisizione con l'osservazione dinamica dell'immagine delle cellule vive per comprendere l'effetto dell'interazione cellula-cellula sui comportamenti delle cellule. Questo tubo può catturare in modo altamente efficiente più celle singole in una camera più grande e fornire una base di colture sufficiente, per il tracciamento dinamico di più comportamenti di interazione a cella singola. Iniziare preparando il dispositivo PDMS.Mettere uno stampo wafer nella piastra di pesatura con 100 microlitri di triclorosilano in un essiccatore e applicare un vuoto per 15 minuti. Fermare il vuoto e salinizzare lo stampo del wafer nell'essiccatore a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Mescolare la base PDMS e l'agente di polimerizzazione PDMS con un rapporto di dieci a uno, quindi versare un totale di 20 grammi della miscela sullo stampo del wafer in un piatto di 15 centimetri.Mettere il piatto di 15 centimetri in un essiccatore e applicare un vuoto per un minuto e mezzo. Quindi rimuovere il piatto dall'essiccatore ed eliminare le bolle d'aria residue nel PDMS con gas azoto. Curare il PDMS mettendo il piatto in forno a 65 gradi celsius per due o quattro ore.Al termine, rimuovere la replica PDMS dallo stampo del wafer e perforare un ingresso di 1,5 millimetri e una presa di 0,5 millimetri sul PDMS. Pulire la replica PDMS e la superficie di scorrimento con nastro rimovibile. Trattare la superficie con plasma di ossigeno.Quindi, allineare manualmente la replica PDMS con la diapositiva e metterli in contatto tra loro. Lasciare la diapositiva PDMS nel forno a 65 gradi Celsius per un giorno. Il giorno successivo, immergere il dispositivo PDMS in un contenitore pieno di PBS.Posizionarlo nell'essiccatore e applicare il vuoto per 15 minuti. Spostare il dispositivo su un cappuccio di coltura cellulare e sterilizzarlo con luce UV per 30 minuti. Sostituire il buffer del dispositivo PDMS con il mezzo e incubarlo a quattro gradi Celsius per un giorno.Quando le cellule raggiungono una confluenza dal 70 all'80%, rimuovere il mezzo di coltura e lavarle delicatamente tre volte con cinque millilitri di PBS. Aggiungere un millilitro di mezzo DMEM/F-12 contenente un colorante fluorescente micromolare alle celle WNT5B sh4 e pLKO-GFP e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con cinque millilitri di PBS sterile, rimuovere il PBS e aggiungere due millilitri dello 0,25% di tripside-EDTA.Incubare le cellule per quattro minuti a temperatura ambiente, quindi toccare delicatamente il piatto di coltura per promuovere il distacco cellulare. Aggiungere quattro millilitri di mezzo DMEM/F-12 per disperdere le cellule WNT5B sh4 e pLKO-GFP, trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugarle a 300 xg per tre minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere delicatamente il pellet cellulare in un millilitro di mezzo DMEM/F-12.Preparare un millilitro di sospensione cellulare a una concentrazione di tre per dieci-quinta cella per millilitro e tenerlo sul ghiaccio per evitare l'aggregazione cellulare. Collegare il tubo di politetrafluoroetilene tra l'uscita del dispositivo e la pompa della siringa. Rimuovere il supporto e aggiungere un microlitro della sospensione cellulare preparata nell'ingresso del dispositivo PDMS.Quindi, caricare la sospensione cellulare nel dispositivo utilizzando una pompa per siringhe a una portata di 0,3 microlitri al minuto. Aggiungere un microlitro di mezzo DMEM/F-12 nell'ingresso del dispositivo, quindi caricare il mezzo nel dispositivo utilizzando una pompa per siringhe. Caricare 0,3 microlitri di mezzo DMEM/F12 nel dispositivo con la pompa della siringa a una portata di 10 microlitri al minuto.Dopo aver caricato le celle, rimuovere il tubo e sigillare l'ingresso e l'uscita con nastro poliolefine per creare un sistema di coltura chiuso. Spostare il dispositivo PDMS su un piatto di coltura di 10 centimetri e aggiungere 10 millilitri di PBS sterile intorno al dispositivo per evitare l'evaporazione del mezzo. Trasferire il piatto di coltura in un incubatore per la tripla coltura uni-cella.Il dispositivo PDMS ha una struttura a tre livelli con un sito di acquisizione che si collega alla camera di coltura e al canale di bypass. La differenza nella resistenza al flusso tra la camera di coltura e il canale di bypass consente alla cella di fluire nella posizione di acquisizione, il che fa sì che la cella seguente attraversa il canale di bypass fino al sito di acquisizione successivo. Il passo di reflusso viene utilizzato per rilasciare la cella dal sito di acquisizione e inviarla nella camera di coltura.L'efficienza di acquisizione delle celle di questo protocollo è stata valutata su tre diversi tipi di celle. Cellule endoteliali linfatiche umane, o LEC, cellule del carcinoma a cellule squamose orali umane T2.6 che esprimono RNA a forcina corta specifico per WNT5B e cellule di controllo vettoriale pLKO-GFP. L'efficienza di acquisizione a cella singola delle tre celle dimostrate era di circa il 71% per i LED, del 74% per le celle sh4 WNT5B e del 78% per le celle pLKO-GFP.La tripla efficienza di cattura a singola cellula è stata del 48%Questo metodo può essere utilizzato per più co-colture unicellari di cellule endoteliali linfatiche e cellule tumorali squamose, e la proliferazione e la morfologia della cellula possono essere osservate al microscopio. È importante assicurarsi che le sospensioni cellulari preparate abbiano aggregati cellulari minimi, perché gli aggregati cellulari non solo riducono l'efficienza di associazione singola, ma possono anche ostruire i micro canali. L'interazione cellula-cella tra le singole cellule svolge un ruolo importante nel controllo dei comportamenti delle cellule.Il nostro metodo può fornire uno strumento efficace per aiutare i ricercatori a studiare l'interazione cellula-cellula a un singolo livello cellulare, il che può portare alla scoperta di nuovi meccanismi che non possono essere facilmente ottenuti da studi basati sulla popolazione.

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Generazione di gradienti di farmaci eterogenei in tutte le popolazioni di cancro su un acceleratore evoluzione microfluidico per l'osservazione in tempo reale

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