Caratterizzazione della falciatura durante la deossigenazione automatizzata controllata con Ektacytometria gradiente di ossigeno

L'ettacitometria del gradiente di ossigeno è un saggio funzionale che valuta la tendenza all'ammalamento individuale. Ad oggi, non sono disponibili o utilizzati altri test funzionali. L'ettacitometria del gradiente di ossigeno è in grado di determinare la tensione dell'ossigeno in cui le cellule del sangue del paziente con malattia falciabile iniziano a falce.

Questa tensione di ossigeno è specifica del paziente e può servire come biomarcatore per la gravità della malattia. Nella malattia falciabile, questa tecnica può essere utilizzata per monitorare l'efficacia del trattamento e può essere utilizzata per lo sviluppo di nuovi trattamenti. La dimostrazione visiva di questa tecnica è importante perché è molto sensibile.

Ci sono numerosi fattori che influenzeranno la misurazione che non sai quando inizi a lavorare con questa tecnica. Qualcuno che prova questo per la prima volta può sperimentare che la tecnica è molto sensibile per la preparazione del campione e la gestione dei campioni. Il mio consiglio è di lavorare il più standardizzato possibile e di sviluppare una routine.

Per iniziare questa procedura, accendere il computer e l'ektacytometro e aprire il software sul computer. Aprire il cilindro di azoto per assicurarsi che l'azoto sia disponibile per deossigenare il campione. Abbassare il bob nella tazza e assicurarsi che la tazza possa girare liberamente.

Quando il software è in esecuzione, verificare che il messaggio sia aperto e fare clic su OK. Assicurarsi che l'ektacytometro inizi il processo di autocontrollo e selezionare avvia. Se l'autocontrollo ha esito negativo, eseguirlo di nuovo facendo clic su controllo hardware, pO2, autocontrollo. Scegliere la scansione pO2 tra i diversi test elencati a sinistra.

Scegliere le impostazioni a destra dello schermo e assicurarsi che siano impostate in base ai parametri elencati nella tabella uno del protocollo di testo assicurandosi di mantenere le stesse impostazioni per ogni misurazione. Salvare queste impostazioni facendo clic su OK e quindi di nuovo su OK. In primo luogo, raccogliere campioni di sangue per impiallacciatura in un tubo contenente EDTA e conservare il sangue a quattro gradi Celsius per un minimo di 30 minuti ma non più di 24 ore.

Successivamente, mescolare delicatamente i campioni per inversione per omogeneizzare. Lasciare riscaldare i campioni a temperatura ambiente su un banco a rulli prima della misurazione. Utilizzare un analizzatore di ematologia per misurare l'intero numero di sangue posizionando l'aspirazione necessaria nel tubo e premendo il pulsante dietro l'ago dell'analizzatore ematologia per iniziare la misurazione e l'analizzatore utilizzerà tra 20 e 200 microlitri di sangue intero.

Quindi standardizzare il campione di sangue intero in un conteggio RBC di 200 milioni di globuli rossi in cinque millilitri di PVP calcolando il volume del campione che verrà aggiunto. Per iniziare, tagliare una punta di pipetta e pre-bagnarla rimospensendo il sangue tre volte. Quindi pipettare il volume del campione calcolato in una fiala PVP.

Mescolare delicatamente il campione manualmente per inversione fino a quando non è omogeneo. Disegnare lentamente due millilitri del sangue e miscela PVP in una siringa da tre millilitri senza l'ago. Spingere lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria visibili e soluzione di campione in eccesso fino a quando non vengono lasciati tra 1,5 e 1,8 millilitri nella siringa.

Iniettare il volume totale del campione lentamente e uniformemente nel bob attraverso il connettore. Assicurarsi che il livello del campione sia superiore al sensore di ossigeno e al piccolo foro di aspirazione. Nel software, fai clic su nuovo e compila l'identificatore del campione, le osservazioni, la data di donazione e la viscosità del PVP.

Fare clic su OK e aspirare. Dopo 60 secondi di aspirazione, la tazza gira e aspira di nuovo per 15 secondi. Quando la rotazione si interrompe, fare clic su OK. Chiudere il coperchio della macchina.

Fare clic su continua e iniziare ora poiché l'ektacytometria del gradiente di ossigeno viene eseguita con un guadagno fisso. Dopo la misurazione, stampare il report che mostra la curva e i parametri calcolati automaticamente dal software. Assicurarsi che i dati non elaborati vengano archiviati automaticamente nella cartella designata nelle impostazioni.

In primo luogo, rimuovere la siringa campione e sostituirla con una siringa riempita con acqua distillata o acqua deionizzata. Premere pulire e sciacquare lentamente il connettore durante il risciacquo assicurandosi di sciacquare in entrambe le direzioni. Quindi, rimuovere la siringa e sollevare il bob.

Utilizzare un panno morbido per asciugare accuratamente il bob e il connettore. Quindi utilizzare una siringa di grandi dimensioni per scaricare il connettore per rimuovere l'acqua rimanente nel tubo e nel bob. Tenere la siringa all'ingresso e bloccare l'uscita del bob per ottenere la contro pressione nei tubi rimuovendo così l'acqua rimanente.

Quindi asciugare la tazza evitando di toccare la macchia di ossigeno. Abbassare il bob e la tazza preparando la macchina per la misurazione successiva. Dopo aver assicurato che la macchina sia correttamente risciacquata, verificare che i tubi adeguati siano correlati alla soluzione di pulizia.

Chiudere il software, premere chiudi e premere start per iniziare il programma di pulizia di fine giornata. Quindi svuotare la bottiglia di scarto e utilizzare un panno morbido per asciugare il bob e la tazza. Chiudere il coperchio della macchina.

Chiudere il cilindro di azoto e spegnere il computer e la macchina. L'ettacitometria del gradiente di ossigeno può essere utilizzata per studiare il comportamento malato dei globuli rossi sotto una serie di concentrazioni di ossigeno. Nell'ettacitometria del gradiente di ossigeno, la deossigenazione continua del campione da parte del gas azoto è seguita da una rapida riossigenazione da parte dell'aria ambiente.

In queste condizioni, il malato di globuli rossi può essere osservato in deossigenazione. Ciò causerà una distorsione del modello di diffrazione perché i globuli rossi malati non si allineeranno correttamente sotto la sollecitazione di taglio applicata. I globuli rossi falciformi mostrano un cambiamento di forma durante la deossigenazione che imita le condizioni durante l'ettacitometria del gradiente di ossigeno, ma non mostrano alcun cambiamento di forma quando ossigenati.

Questo processo si traduce in una distorsione del modello di diffrazione durante l'ettacitometria del gradiente di ossigeno e quindi in una diminuzione dell'indice di allungamento. Una curva rappresentativa ottenuta dall'ektacytometro mostra i sei parametri che riflettono le diverse caratteristiche del comportamento malato: l'indice di allungamento massimo, l'indice di allungamento minimo, il delta EI, il punto di malato, l'area sotto la curva e il recupero. Qui vengono mostrate curve rappresentative dei globuli rossi da controlli sani, pazienti con tratti HbS e un paziente omozigoto con malattia falciabile.

Le chiare differenze nelle curve rappresentative dei pazienti con falce omozigoti trattati con urea idrossile e trasfusione evidenziano l'utilità di questo saggio. Ci sono numerosi fattori che influenzano l'ettacitometria del gradiente di ossigeno come temperatura, pH e osmolarità del PVP, ma anche i resti di acqua e il grado di miscelazione della soluzione del campione di sangue possono influenzare le misurazioni. Pertanto, la gestione standardizzata dei campioni è essenziale.

Il risultato dell'ektacitometria del gradiente di ossigeno può essere implementato direttamente nella pratica clinica, contribuendo così alla medicina personalizzata. Questa tecnica consente di studiare il comportamento malato per indagare il potenziale di nuovi trattamenti per la malattia falciabile e può servire come biomarcatore clinicamente rilevante per la gravità della malattia.