Name: Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri come modulare simultaneamente molti microRNA in cellule eucariotiche utilizzando cluster artificiali. Questo metodo flessibile minimizza i passaggi di clonazione molecolare e offre una piattaforma per applicazioni terapeutiche nel glioblastoma.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del Laboratorio di Oncologia Neuro Harvey Cushing per il sostegno e la critica costruttiva. Questo lavoro è stato supportato da NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.

1. Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente in Glioblastoma
<ol><li>Analisi dell'espressione di miRNA differenziale ampia nel glioblastoma rispetto al cervello
	<ol>
<li>In primo luogo, determinare i miRNA più significativamente deregolamentati nel tumore. Ciò può essere ottenuto utilizzando almeno tre diversi metodi:<ol>
<li>Estrarre l'Atlante del Genoma del Cancro, trovato a https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, per i dati di sequenziamento11.</li>
			<li>Eseguire l'analisi microarray da un nuovo campione operativo12.</li>
			<li>Utilizzare i set di dati pubblicati in precedenza13. NOT:</</c6> Qualunque sia il metodo scelto, l'output fornisce un insieme di massa di miRNA la cui espressione è statisticamente correlata (direttamente o inversamente) con la biologia del tumore. Questo gruppo iniziale costituisce il pool di miRNA che vengono ulteriormente analizzati per l'identificazione di un sottoinsieme di miRNA che mostra l'associazione funzionale più rigorosa eseguendo un'analisi più dinamica delle modifiche di espressione, come descritto di seguito.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dell'espressione miRNA specifica della condizione
	<ol>
<li>Induzione della differenziazione cellulare:<ol>
<li>Utilizzare piatti di plastica poli-D-lysina (PDL) pre-rivestiti per favorire la formazione di una coltura monostrato. Per il rivestimento dei piatti, sciogliere la PDL in acqua a una concentrazione di 100 g/mL. Utilizzare 1 mL di soluzione per 25 cm2 superficie. Risciacquare 2x con PBS 6 h dopo l'applicazione della soluzione PDL.</li>
			<li>Piastra di cellule staminali neurali umane in quantità uguali (100.000 cellule/5 mL) o nel mezzo di cellule staminali (mezzo neurobasale , integratore B27 , 20 ng/mL EGF/FGF), mezzo di differenziazione astrocitica (DMEM - 10% FBS), o mezzo di differenziazione neuronale (mezzo neurobasale 2 - acido retinoico M)14. Il protocollo per la differenziazione oligodendrociti richiede l'aggiunta di IGF-1 (200 ng/mL) dopo la rimozione EGF/FGF14,15.</li>
			<li>Dopo la placcatura cellulare, inserire in incubatrice per 1 settimana a 37 gradi centigradi, 5% di CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Estrazione dell'RNA:<ol>
<li>Dopo 7 giorni, rimuovere le cellule dall'incubatrice e rimuovere il mezzo.</li>
			<li>Lavare le cellule con PBS (5 mL). Quindi, aggiungere 1 mL di reagente di lisi (vedi Tabella dei materiali) per lesiare le cellule e raschiare le cellule nel tubo di microfuge da 1,5 mL utilizzando un raschietto cellulare. Conservare i tubi contenenti le cellule lismi a temperatura ambiente (RT) per 5 min.</li>
			<li>Procedere all'isolamento totale dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analisi dell'espressione miRNA:<ol>
<li>Quantificare l'espressione differenziale di miRNA specifici identificati nel passaggio 1.1 tra i tre modelli di differenziazione da PCR in tempo reale, utilizzando sonde TaqMan e seguendo i protocolli del produttore per la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR ( Figura 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Convalida dei cluster di miRNA per difficoltà specifiche dello stress
	<ol>
<li>Coltura G34 glioblastoma cellule staminali nel mezzo neurobasale - supplemento B27 - 20 ng/mL EGF/FGF. Iniziare con 1 x 106 celle in 5 mL in un fiaschetta di fissaggio basso di 25 cm2.</li>
		<li>A partire da 48 h dopo la placcatura, aggiungere le concentrazioni di raddoppio del DNA di alchilante agente temozolomide (TM) ogni 5 giorni, come segue:<ol>
<li>Iniziare con 5 M per 5 giorni. Dopo 5 giorni, rimuovere il mezzo e sostituire con un mezzo fresco senza temolomide, per consentire alle cellule sopravvissute di recuperare. Dopo 48 h, aggiungere 10 M TM e incubare per altri 5 giorni.</li>
			<li>Ripetere ogni volta il passo 1.3.2.1, raddoppiando la concentrazione di TM, fino a quando non viene raggiunta una concentrazione di almeno 100 M e le cellule diventano resistenti al farmaco10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>In un esperimento parallelo, irradiare le cellule G34 come segue:<ol>
<li>A partire da 48 h dopo la placcatura di 1 x 106 cellule in 5 mL in un fiascheta a basso attaccamento di 25 cm2, è accettabile irradiare le cellule con 2 Gy di energia (qualsiasi irradiatore che fornisce emissione di fotoni è accettabile). Riportare le cellule all'incubatrice e non disturbare. Dopo 48 h, irradiare nuovamente le cellule con ulteriori 2 Gy di energia.</li>
			<li>Ripetere il passaggio 1.3.3.1 4x fino a somministrare un totale di 10 Gy di energia.</li>
			<li>Riportare le cellule all'incubatrice e lasciarle recuperare in mezzo fresco per almeno 5 giorni prima dell'analisi a valle.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dopo l'induzione della resistenza, le cellule di lisi che utilizzano il reagente di lisi ed estrarre l'RNA totale secondo il protocollo del produttore.</li>
		<li>Analizzare l'espressione dei miRNA specifici identificati nelle sezioni 1.1-1.2 come descritto nel passaggio 1.2.1 (Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Caratterizzazione della convergenza funzionale dei miRNA raggruppati
	<ol>
<li>Ottenere il targetoma previsto di ogni miRNA definito nelle sezioni 1.2-1.3 ottenuto utilizzando gli strumenti di previsione del targeting miRNA. NOT:</</c2> Generalmente ricorriamo a TargetScan, come il suo algoritmo viene periodicamente aggiornato16. Gli strumenti di stima aggiuntivi sono miRanda17, miRDB18e DIANA-miRPath19. Tutti questi programmi sono applicazioni gratuite basate sul web.<ol>
<li>Dalla prima pagina di Targetscan, selezionare il miRNA di interesse dal menu a discesa pre-popolato. Fare clic sul pulsante Invia.</li>
			<li>Scaricare l'elenco risultante delle destinazioni come foglio di calcolo utilizzando il collegamento Scarica tabella (Supplementary Figure 1).</li>
			<li>Per ridurre le possibilità di previsioni di falsi positivi, includere solo gli obiettivi all'interno della colonna siti conservati nelle analisi a valle. Inoltre, è possibile ottenere ulteriore rigore utilizzando ulteriori programmi di previsione del miRNA (vedi sopra) e includendo solo gli obiettivi comuni a tutti gli algoritmi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Classificare i targetomi risultanti in base alle categorie di Ontologia genica utilizzando ToppGene Suite20 per valutare l'arricchimento dei percorsi comuni a ciascun miRNA.<ol>
<li>Incollare l'elenco degli obiettivi ottenuti dal passaggio 1.4.1 nella finestra "Set di geni di formazione", utilizzando il simbolo HGNC come tipo di voce. Fare clic su Invia > Avvia. Il programma fornirà una tabella di output che mostra le categorie "Go" più significative per l'elenco di geni inserito (Figura supplementare 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per stabilire infine il contributo di ciascun miRNA alla regolazione di un percorso comune o di un processo cellulare (in questo caso, regolazione della cromatina), controllare ogni targetoma ottenuto nel passaggio 1.4.1 rispetto all'elenco completo dei geni coinvolti nel processo cellulare specifico ( regola della cromatina), utilizzando la funzione diagramma di Venn fornita nel sito web Bioinformatics and Evolutionary Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn. NOT:</</c16> Questo programma consente l'intersezione di più gruppi contemporaneamente (Figura 3). Gli obiettivi unici specifici forniti da ogni miRNA vengono quindi annotati e selezionati per esperimenti funzionali a valle.<ol>
<li>Nella prima pagina del programma, caricare o copiare/incollare l'elenco se i mRNA di destinazione per ogni miRNA o interesse nelle rispettive finestre. Assegnare un nome a ogni elenco con un identificatore univoco.</li>
			<li>Fare clic su Invia. Il programma fornirà un output visivo di un diagramma di Venn con un numero di geni in ogni settore, nonché un elenco completo di mRNA per ogni subset e combinazioni di intersezioni.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Assemblaggio di moduli miRNA in un cluster transgenico policistronico
<ol><li>
Preparazione dello scaffold transgenico a base di locus a grappolo miR-17-92
	<ol>
<li>Ottenere la sequenza nucleotidica dell'ammasso miR-17-92 dal browser genoma Ensembl21. Selezionare la sequenza "core" della coppia di basi da 800 dollari che comprende tutte e sei forcine miRNA codificate del locus e almeno 200-nucleotide flanking sequenze sia a monte (5') che a valle (3') della sequenza di core.</li>
		<li>Incollare la sequenza precedente in qualsiasi programma di modifica delle parole.</li>
		<li>Definire la sequenza di ciascuna delle sei forcine native recuperandole in miRBase22. Contrassegnare ciascuna di queste sequenze nell'intervallo della sequenza "core" identificata in precedenza. Tutte le sequenze tra ogni tornante rappresentano sequenze distanziali, che sono importanti per la corretta elaborazione del transgene.</li>
		<li>Rimuovere le sequenze di tornanti nativi dalla sequenza "core", con l'eccezione di 3-5 nucleotidi a entrambe le estremità 5' e 3' di ogni forcina, che servirà come accettatore per le nuove forcine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Costruire un nuovo transgene che codifica più miRNA di scelta
	<ol>
<li>Ottenere sequenze fornacchia di miRNA destinati ad essere sovraespressi nel transgene da miRBase. Notare attentamente i nucleotidi specifici che sono i siti di scissione microprocessore.</li>
		<li>Sostituire le forcine rimosse (passaggio 2.1.4) con le sequenze di tornanti dei miRNA desiderati ottenute nel passaggio 2.2.1.</li>
		<li>Aggiungere le sequenze di restrizione desiderate in entrambe le regioni di fianco del transgene per facilitare la subclonazione nei vettori di consegna di scelta. Verificare che le sequenze di restrizione scelte non siano presenti all'interno della sequenza stessa.</li>
		<li>Per i controlli negativi, utilizzare sequenze criptato a 20 nucleotidi per sostituire la sequenza naturale di 20 nucleotidi di ogni miRNA maturo. Generare queste sequenze criptate utilizzando uno strumento online come https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verifica della struttura bidimensionale del transgene
	<ol>
<li>Copiare la sequenza transgenica completa nel programma software di previsione della struttura dell'RNA RNAweb Fold23.</li>
		<li>Utilizzando le impostazioni standard del programma, fare clic su Procedi.</li>
		<li>Analizzare l'output grafico, in particolare per la presenza di forcine ben definite e la presenza di strutture staminali a doppio filamento almeno 11 nucleotidi proximali al sito di scissione microprocessore. Inoltre, cercare l'assenza di punti di diramazione all'interno delle sequenze di tornanti (Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ottenere i Transgeni mediante sintesi del DNA
<ol><li>Dopo la progettazione e la convalida in silico dell'ammasso di miRNA chimerico, ottenere la sequenza di lavoro utilizzando la sintesi del DNA da fornitori commerciali24 e procedere con la clonazione a valle in vettori e consegna transgenica. Abbiamo usato vettori lentivirali per la consegna in vitro10 e virus adeno-associati (AAV) per la consegna invivo intracranica25.</li>
</ol>

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<li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+Meta-Analysis+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767(2018).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciencesof+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li>
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<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs%3A+tiny+regulators+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li>
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<li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442(2019).</li>
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</ol>

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Questo protocollo si basa sulla nozione che, invece di funzionare in isolamento, i miRNA sono biologicamente rilevanti lavorando in gruppi, e questi gruppi sono stabiliti trascrizionalmente da contesti cellulari specifici26. Per giustificare questo approccio da una prospettiva traslazionale, viene introdotto un protocollo di follow-up che consente la ricreazione di questo modello multi-miRNA nelle cellule/tessuti. Ciò è possibile sfruttando la biogenesi relativamente semplice dei miRNA, per cui il...

I miRNA offrono un'opportunità ineguagliabile per lo sviluppo di un ampio approccio di terapia genica a molte malattie1,2,3, compreso il cancro4,5. Questo si basa su diverse caratteristiche uniche di queste molecole biologiche, tra cui la loro piccola dimensione6, semplice biogenesi7, e la tendenza naturale a funzionare in associazione8. Molte malattie sono caratterizzate da specifici modelli di espressione del miRNA, che spesso convergono sulla regolazione di funzioni biologiche complesse9. Lo scopo di questo metodo è innanzitutto quello di definire una strategia per identificare gruppi di miRNA che sono sinergicamente rilevanti per funzioni cellulari specifiche. Di conseguenza, fornisce una strategia per il ripristino di tali combinazioni di miRNA in studi e applicazioni a valle.
Questo metodo consente l'analisi funzionale di più miRNA contemporaneamente, sfruttando il loro targeting simultaneo di un gran numero di mRNA, ricapitolando così i complessi paesaggi delle malattie. Questo approccio è stato recentemente impiegato per definire un gruppo di tre miRNA che 1) sono contemporaneamente downregolati nel cancro al cervello e 2) mostrano un forte modello di co-espressione durante la differenziazione neurale, nonché in risposta allo stress genotossico da radiazioni o un Agente alchiante del DNA. La riequivocazione combinatoria di questo modulo di tre miRNA con il metodo di clustering descritto di seguito si traduce in una profonda interferenza con la biologia delle cellule tumorali e può essere facilmente utilizzata come strategia di terapia genica per studi preclinici10. Questo protocollo può essere di particolare interesse per coloro che sono coinvolti nella ricerca sui miRNA e sulle sue applicazioni traslazionali.

<table><tbody><tr><td>0,4% agarosio a bassa temperatura di fusione&nbsp;</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; Unità filtrante sterile M</td><td>Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 6 pozzetti&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Topi atimici (FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplemento&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare, 16cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Cesio 137 irradiatore&nbsp;</td><td>JL Sheperd and Associates</td><td>Core Facility (Harvard Medical School)</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio, piruvato&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfati&nbsp;</td><td>Soluzione Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Soluzione di formalina Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>Cellule staminali primarie di glioma umano (GBM62)</td><td></td><td></td><td>Fornito dal Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Cellule staminali primarie umane di glioma (MGG4)</td><td></td><td></td><td>Fornito dal Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Vettore lentivirale pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>modello n. 5424 R, n. cat. 5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Provette per centrifuga a fondo tondo in policarbonato ad alta velocità&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Cellule progenitrici neurali (NPC)</td><td></td><td></td><td>Fornito dal Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Terreno neurobasale&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon eclipse Ti sistema di microscopio a fluorescenza motorizzato</td><td>Nikon, Giappone</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific 31985088</td><td></td><td></td></tr><tr><td>provette per PCR&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 94/16&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FGF umano ricombinante-basic&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit di miniprep RNA</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Termociclatore</td><td>Bio-RAD</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Micro Irradiatore Guidato da Immagini per Piccoli Animali&nbsp;</td><td>Xstrahal Life Sciences, Regno Unito</td><td>Stabilimento principale (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75000100</tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Biosistemi applicati&nbsp;</td><td></td><td></td>4376357</tr><tr><td>Cabina di biosicurezza SterilGARD&nbsp;</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td> Saccarosio Sigma-Aldrich <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>Cultura di tipo americano Collecti</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Kit di trascrizione inversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomide</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek temperatura di taglio ottimale&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9636948</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Reagente per lisi</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>Coltura di tipo americano Collecti</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp;</td>Sistema di espressione lentivettoriale <td>ViraPower Collecti</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>ViraPower</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, grado HPLC</td><td>Fisher</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>Xilene&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione dei mirna associati funzionalmente nel glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

La rilevanza biologica dei microRNA (miRNA) nella salute e nella malattia si basa in modo significativo su combinazioni specifiche di molti miRNA contemporaneamente deregolamentati piuttosto che sull'azione di un singolo miRNA. La caratterizzazione di questi moduli specifici di miRNA è un passo fondamentale per massimizzare il loro uso in terapia. Questo è estremamente rilevante perché i loro attributi combinatori possono essere praticamente sfruttati. Descritto qui è un metodo per definire una firma miRNA specifica rilevante per il controllo dei repressori di cromatina oncogenia nel glioblastoma. L'approccio definisce prima un gruppo generale di miRNA che sono deregolati nei tumori rispetto al tessuto normale. L'analisi viene ulteriormente perfezionata dalle condizioni di coltura differenziali, sottolineando un sottogruppo di miRNA che vengono co-espressi contemporaneamente durante specifici stati cellulari. Infine, i miRNA che soddisfano questi filtri sono combinati in un transgene policistronico artificiale, che si basa su uno scaffolding di geni di cluster miRNA naturalmente esistenti, quindi utilizzati per la sovraespressione di questi moduli miRNA nelle cellule riceventi.

Questo metodo ha permesso la caratterizzazione di un modulo di tre miRNA che sono costantemente downregolati nei tumori cerebrali, che sono co-espressi specificamente durante la differenziazione neuronale (Figura 1) e coinvolti nella risposta di sopravvivenza del tumore dopo terapia (Figura 2). Ciò si ottiene regolando un complesso percorso repressivo della cromatina oncogenica. Questo modello di co-espressione ha suggerito una f...

Descritto qui è un protocollo per caratterizzare i moduli di miRNA biologicamente sinergici e il loro assemblaggio in transgeni brevi, che consente la sovraespressione simultanea per applicazioni di terapia genica.

Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Questo protocollo consente la modulazione simultanea di molti microRNA nelle cellule eucariotiche e si basa su un metodo molto semplice e flessibile che riduce al minimo i passaggi di clonazione molecolare. Questa tecnica ha implicazioni per lo studio delle interazioni funzionali del micro RNA in vitro, ma soprattutto fornisce una piattaforma per un uso più efficace dei microRNA in terapia. Lo abbiamo sviluppato e utilizzato principalmente nel contesto del cancro al cervello, ma si applica a tutte le malattie in cui sono coinvolte molteplici alterazioni dell'espressione genica.Abbiamo testato i nostri geni trans artificiali in altri modelli come le linee di cancro al seno e alla tiroide che mostrano la riproducibilità di questa tecnica. Le conoscenze di base della bioinformatica e della biologia dei microRNA sono utili per questo protocollo, ma non indispensabili. Un approccio bioinformatico è importante per definire combinazioni di microRNA rilevanti e il TRK-11, mentre la familiarità con l'elaborazione del micro RNA misurabile è importante per capire come questi diversi microRNA possano essere assemblati in cluster di DNA artificiali che possono essere elaborati con successo una volta stabili alle cellule specifiche.Per rivestire il piatto, sciogliere prima la poli-D-lisina in acqua a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro. Versare la soluzione nel piatto alla quantità di un millilitro di soluzione per 25 centimetri quadrati di superficie. Ruotare il piatto per assicurarsi di copertura di tutto il piatto.Dopo sei ore aspirare la soluzione di poli-D-lsina e risciacquare due volte con PBS. Placcare le cellule staminali neurali umane nella quantità di 100.000 cellule per cinque millilitri del mezzo, sia nel mezzo delle cellule staminali, nel mezzo di differenziazione astrocitica o nel mezzo di differenziazione neuronale. Dopo la placcatura cellulare, posizionare il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per una settimana e procedere all'analisi dell'espressione del micro RNA secondo il manoscritto.Per coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma GBM-34, iniziare con una per dieci alla quinta cellula e cinque millilitri di mezzo neurobasale in un pallone ad attacco basso 25 centimetri quadrati. Posizionare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. 48 ore dopo la placcatura, aggiungere concentrazioni raddoppiate di agente alchilante di DNA temozolomide ogni sette giorni.Iniziare con l'aggiunta di cinque micromolari TMZ integrati in cinque millilitri medi per cinque giorni. Dopo cinque giorni, rimuovere il mezzo e sostituirlo con mezzo fresco senza temozolomide per consentire alle cellule sopravvissute di riprendersi. Dopo 48 ore, aggiungere 10 temozolomide micromolare e incubare per altri cinque giorni.Ripetere il trattamento del raddoppio temozolomide fino a raggiungere la concentrazione di almeno 100 micromolari e le cellule diventano resistenti al farmaco. Dopo l'induzione della resistenza, mentire le cellule usando 1 millilitro di reagente di lisi. Estrarre l'RNA totale e analizzare l'espressione dei microRNA specifici in base al manoscritto.Per ottenere il targetome previsto di ogni micro RNA precedentemente definito, utilizzare strumenti di previsione del targeting per micro RNA. Dalla prima pagina di TargetScan, selezionare il micro RNA di interesse dal menu a discesa prepopolato. Fare clic sul pulsante invia.Scaricare l'elenco di destinazioni risultante come foglio di calcolo utilizzando il collegamento alla tabella di download. Per ridurre le possibilità di previsioni false positive, includere solo le destinazioni all'interno della colonna siti conservati e dell'analisi downstream. Ulteriori programmi di previsione del micro RNA ottengono ulteriore rigore e includono solo destinazioni comuni a tutti gli algoritmi.Quindi, apri la suite ToppGene 20. Per valutare l'arricchimento di percorsi comuni a ciascun micro RNA, incollare l'elenco degli obiettivi ottenuti nella finestra dei set di geni di training. Fate clic su Simbolo HGNC (HGNC Symbol) come tipo di voce.Fare clic su Invia e inizia. Il programma fornisce una tabella di output che mostra le categorie GO più significative per l'elenco inserito dei geni. Per stabilire infine il contributo di ogni micro RNA alla regolazione di un percorso comune o di un processo cellulare, aprire la funzione venn-diagramma fornita nel sito web bioinformatica e genomica evolutiva.Controllare ogni targetome ottenuto rispetto all'elenco completo dei geni coinvolti nello specifico processo cellulare. Se gli RNA di messaggistica di destinazione per ogni microRNA di interesse si trovano nelle rispettive finestre, caricare copia-incolla l'elenco. Assegnare un nome a ogni elenco con un identificatore univoco.Fare clic su Invia. Il programma fornisce un output visivo di un diagramma venn con numeri di geni in ogni settore e un elenco completo di RNA messaggero per ogni sottoinsieme e combinazioni di intersezioni. Per raggruppare i micro RNA selezionati in un gene trans funzionale, ottenere un'impalcatura transgenica basata sul locus a grappolo miR-17-92.Ottenere la sequenza nucleotidica dal browser del genoma ensemble. Selezionare la sequenza di nucleo di circa 800 coppie di basi che comprende tutti e sei i forcine a micro RNA codificati del locus e almeno 200 sequenze di fianco nucleotidici sia a monte che a valle della sequenza del nucleo. Incollare la sequenza in qualsiasi programma di modifica delle parole.Definire la sequenza di ciascuno dei sei perni di capelli nativi recuperandoli in base miR. Contrassegnare ognuna di queste sequenze entro l'intervallo della sequenza di base precedentemente identificata. Tutte le sequenze tra ogni tornante rappresentano sequenze distanziale.Successivamente, ottenere le sequenze di forcine di microRNA destinate ad essere sovraes espresse nel gene trans dalla base miR. Si notano con attenzione i nucleotidi specifici che si trovano nei siti di scissione del microprocessore. Elimina le sequenze di forcine native dalla sequenza centrale ad eccezione di tre o cinque nucleotidi alle estremità a cinque e te di ogni tornante che fungerà da accettore per i nuovi tornanti.Incollare le sequenze di forcine dei microRNA desiderati per sostituire le forcine precedentemente eliminate. Aggiungere le sequenze di restrizione desiderate in entrambe le regioni di fianco del gene trans per facilitare la sottoclonazione in vettori di distribuzione di scelta. Verificare che le sequenze di restrizione scelte non siano presenti all'interno della sequenza stessa.Per verificare la struttura bidimensionale del gene trans, copiare l'intera sequenza transgenica nel programma software di previsione della struttura dell'RNA RNA Webfold. Selezionare le impostazioni standard del programma e fare clic su Procedi. Analizzare l'uscita grafica, in particolare per la presenza di forcine ben definite in presenza di strutture staminali a doppio filamento che sono almeno 11 nucleotidi prossimali al sito di scissione del microprocessore.Inoltre, cerca l'assenza di punti di ramificazione all'interno delle sequenze di forcine. A questo punto, il gene trans è pronto per essere prodotto dalla sintesi genica e clonato nei vettori di somministrazione desiderati. Questo metodo ha permesso la caratterizzazione di un modulo di tre micro RNA che sono costantemente regolati nei tumori cerebrali, che sono co-espressi specificamente durante la differenziazione neuronale.I modelli di co-espressione dei moduli di micro RNA durante lo stress genotossico sono stati confermati e hanno suggerito una forte attività sinergica tra questi tre microRNA. Il gene trans progettato potrebbe contemporaneamente riassumere l'espressione dei tre microRNA nelle cellule del glioblastoma, sia in vitro che in vivo, con interferenze significative nella biologia tumorale e promettente applicabilità traslazionale. Inoltre, l'ammasso transgenico era funzionale anche in un modello di cancro al seno.I requisiti cruciali di questo protocollo sono il mantenimento delle dimensioni originali della scissione del processore nel gene trans. E assicurarsi che la struttura ad anello del gambo dei forcine chimeriche micro RNA sia preservata. Con questo metodo, possiamo concentrare più geni di microRNA biologicamente attivi in sequenze di DNA molto brevi che possono letteralmente essere inserite in vitro in qualsiasi vettore di somministrazione per uso di terapia genica.Questo metodo è ideale per studiare l'interazione funzionale tra diversi microRNA e per interferire con percorsi cellulari multifattoriali complessi che altrimenti richiederanno più combinazioni di farmaci.

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Qui descriviamo un protocollo efficiente e versatile per indurre, monitorare e analizzare nuovi glioblastomi (GBM) utilizzando DNA trasposone iniettato nei ventricoli di topi neonatali. Le cellule della zona subventricolare, che assorbono il plasmide, trasformano, proliferano e generano tumori con caratteristiche isto-patologiche del GBM umano.

Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma

I microRNA svolgono ruoli cruciali nel cervello e sono potenziali bersagli per la modellazione della neurodegenerazione. Tuttavia, perturbare i livelli di miRNA è difficile a causa della breve lunghezza dei miRNA e dell'inaccessibilità del tessuto cerebrale. Questo video presenta un metodo per la progettazione di antagomir e la somministrazione di antagomir specifici per il cervello utilizzando un neuropeptide nei topi.

Una alternativa semplice per iniezione stereotassica per Brain Knockdown specifico miRNA

Neurosfere coltivate come 3D culture costituiscono un potente strumento per studiare la biologia di glioma. Qui presentiamo un protocollo per eseguire esame immuno-istochimico pur mantenendo la struttura 3D di glioma neurosfere mediante inclusione in paraffina. Questo metodo consente la caratterizzazione delle proprietà neurosphere glioma ad esempio di staminalità e del differenziamento neurale.

Valutazione di biomarcatori in Glioma mediante immunoistochimica su paraffina 3D Glioma Neurosphere culture

terapeutica di miRNA hanno un potenziale significativo nella regolazione della progressione del cancro. Ha dimostrato qui approcci analitici utilizzati per l'identificazione dell'attività di un trattamento di combinatoria miRNA nell'arrestare il ciclo cellulare e l'angiogenesi.

Analisi di miRNA combinatoria trattamenti per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi

Questo protocollo utilizza una reazione a catena di polimerasi in tempo reale basata su sonda (PCR), un saggio SRB (sulforhodamine B), una clonazione di 3 regioni non tradotte (3' UTR) e un analisi luciferasi per verificare i geni bersaglio di un miRNA di interesse e per comprendere le funzioni dei miRNA.

Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali

La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.

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La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L'elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l'espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all'invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.

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Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.

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Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica (Video) | JoVE Journal

Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica

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