Name: Un protocollo basato su FACS per isolare lRNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Impara un protocollo FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili di Drosophila. Questo metodo consente l'analisi trascrittomica di popolazioni cellulari rare essenziali per il successo riproduttivo.

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Siamo grati ai membri del laboratorio Karch, alla piastra di genomica iGE3, alla struttura centrale Flow Cytometry dell'Università di Ginevra e al Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye che ha stabilito il protocollo per FACS. Ringraziamo Luca Stickley per il suo aiuto nella visualizzazione delle letture su IGV. Ci ringraziamo per il gentile permesso di riutilizzare le figure, e gli editori per averci spinto ad essere creativi con la scrittura.
Questa ricerca è stata finanziata dallo Stato di Ginevra (CI, RKM, FK), dal Fondo nazionale svizzero per la ricerca (www.snf.ch) (FK e RKM) e dalle donazioni della Fondazione Claraz (FK).

1. Linee di Drosophila utilizzate e raccolta dei maschi
<ol><li>Per questo protocollo, utilizzare i maschi che esprimono GFP nelle SCs e non nelle cellule principali. In questo caso, viene utilizzato un driver AbdB-GAL4 (descritto nel riferimento18),ricombinato con UAS-GFP (sul cromosoma 2). Possono essere utilizzati anche altri driver appropriati. Per l'isolamento delle SC in diverse condizioni mutanti, attraversa la mutazione in linee contenenti la linea GFP specifica per SC.</li>
	<li>Raccogliere due lotti di circa 25 maschi sani e vergini per ogni genotipo e invecchiarli a 25 gradi centigradi per 3-4 giorni in fiale con cibo drosophila appena fatto. NOT:</</c4> Come età, stato di accoppiamento, nutrizione e ambiente sociale influenzano ciascuno la biologia riproduttiva, devono essere seguiti protocolli rigorosi per controllare questi parametri. I maschi vergine di età sono invecchiati per 3-4 giorni dopo l'eclosione pupina a 25 gradi centigradi con un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h, sul cibo standard del farina di mais-agar-lievito, in gruppi di 20-25 maschi per fiala.</li>
</ol>2. Soluzioni e preparazione dei materiali
<ol><li>
Preparare le soluzioni seguenti.
	<ol>
<li>Preparare il siero -minerato medio (SSM): il mezzo Drosophila di Schneider integrato con il 10% di calore inattivato dal siero bovino fetale e l'1% Penicillina-Streptomycin.</li>
		<li>Preparare l'enzima di 1x di trypsin (ad esempio, TrypLE Express Enzyme) e conservarli a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare le aliquote di papaina [50 U/mL] (conservate a -20 gradi centigradi e scongerate una sola volta).</li>
		<li>Preparare 1x salina buffer fosfato (PBS, conservato a temperatura ambiente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare più punte pipet a fiamma per la dissociazione fisica delle ghiandole accessorie. NOTA: Utilizzare punte di bassa ritenzione per la gestione delle ghiandole accessorie in quanto tendono ad aderire alla plastica non trattata. Il processo di arrotondamento della fiamma riduce l'apertura della punta e leviga i bordi della punta. Ciò garantisce un'efficiente dissociazione dopo la digestione dei peptidasi senza tosare le membrane cellulari.<ol>
<li>Tagliare una punta di 200 -L con una lama affilata e passarla delicatamente sopra una fiamma per arrotondare la sua punta in modo che l'apertura sia più ampia ma liscia per la maneggevolezza durante la fase 3.7.</li>
		<li>Restringere l'apertura di più punte di 1.000 punte passando la punta di apertura vicino a una fiamma per meno di un secondo. Ruotare leggermente la punta per evitare un'eccessiva fusione o intasamento. Ordinare le punte fatte da più stretto a più ampio. Questo può essere fatto cronometrando la velocità di aspirazione. Provare a dissociare un campione su piccola scala di ag per testare l'efficienza delle punte più strette. NOT:</</c5> Questi suggerimenti sono fondamentali per l'agitazione meccanica (passaggi 5.2 e 5.3). Le punte del tubo di fiamma di qualità consentono una completa dissociazione preservando la vitalità cellulare. Come tale, questi suggerimenti vengono lavati accuratamente con acqua alla fine della procedura per il riutilizzo. Questo permette dissociazione riproducibile giorno per giorno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissezione delle ghiandole accessorie
<ol><li>Mettere da 20 a 25 Maschi Drosophila in un piatto di vetro sul ghiaccio.</li>
	<li>Dissect 1 maschio in SSM. Togliere il suo tratto riproduttivo e cancellare la coppia di ghiandola accessoria da tutti gli altri tessuti a parte il condotto eiaculatorio. NOT:</</c1> Rimuovere i testicoli perché lo sperma rilasciato può creare grumi e disturbare il processo di dissociazione. Rimuovere la lampadina eiaculatoria, che rende difficile la manipolazione quando galleggia.</li>
	<li>Con pinze, trasferire le ghiandole accessorie in una lastra di vetro riempita con SSM a temperatura ambiente. Ripetere i passaggi 3.2-3.3 20 volte per ottenere un lotto di 20 coppie di ghiandole in SSM. NOT:</</c2> Questi passaggi saranno raggiunti in 15-20 min. GFP può essere monitorato utilizzando un microscopio fluorescente.</li>
	<li>Trasferire le ghiandole accessorie a 1x PBS per un lavaggio di 1-2 min a temperatura ambiente. NOT:</</c3> Per una migliore dissociazione, è imperativo sciacquare le ghiandole con PBS. La durata di questo passaggio, tuttavia, dovrebbe essere limitata in quanto le cellule mostrano segni di stress nella PBS; cellule secondarie dissociate in PBS si gonfiano rapidamente e muoiono.</li>
	<li>Diluire 20 papaina [50 U/mL] in 180 - L di 1x enzima trypsin per ottenere la soluzione di dissociazione (per scalare verso l'alto o verso il basso mantenere 9 L di enzima di metapina e 1 L di papaina per ogni maschio). Con pinze, trasferire le ghiandole accessorie a questa soluzione.</li>
	<li>Isolare la punta delle ghiandole accessorie (contenenti celle secondarie) dalla parte prossimale. Utilizzare pinze sottili per pizzicare saldamente il centro di un lobo ghiandolare e tagliare con la punta affilata di una seconda pinze. Rimuovere la parte prossimale delle ghiandole accessorie e il condotto eiaculatorio per migliorare la dissociazione e ridurre il tempo di smistamento cellulare. NOT:</</c4> Dissezione della parte dissale da 20 coppie di ghiandole avrà 15 a 20 min e la digestione da peptidasi inizierà quindi a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo che tutte le punte della ghiandola sono state sezionate, trasferirle in un tubo da 1,5 mL utilizzando una speciale punta di pipetta da 200 lun preparata al Passo 2.2.1. Dovrebbe essere largo, arrotondato e umido prima di maneggiare le ghiandole. NOT:</</c5> Per pipet tessuto ghiandola accessorio, le punte devono sempre essere pre-bagnate con soluzione appropriata (enzima trypsin o SSM, tenere un tubo di ciascuno per questo scopo). Risciacquare con attenzione le punte tra i campioni per evitare la contaminazione.</li>
</ol>4. Digestione dei tessuti
<ol><li>Mettere il microtubo in uno shaker da 37 gradi centigradi per 60 min, dondolando a 1.000 giri/mm. NOT:</</c0> Sia il tempo di agitazione che quello di digestione sono fondamentali per una dissociazione di successo. La digestione più breve o immobile darà scarsa dissociazione, probabilmente perché lo strato muscolare esterno e il liquido seminale viscoso interno proteggono le cellule della ghiandola accessoria dai peptidasi.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di SSM a temperatura ambiente per interrompere la digestione e procedere immediatamente al passaggio 5.</li>
</ol>5. Dissociazione meccanica delle cellule
<ol><li>Utilizzando una punta larga arrotondata di 1.000 gradi, pre-bagnata con SSM, trasferire il campione su una piastra di 24 pozzetti. Monitorare la fluorescenza GFP al microscopio: la maggior parte delle punte della ghiandola dovrebbe apparire intatta e alcune SC dovrebbero essere staccate.</li>
	<li>Utilizzando una punta a tubo stretto arrotondato generata al passo 2.2.2, pipet su e giù da 3 a 5 volte per interrompere il tessuto della ghiandola accessoria. NOT:</</c0> Monitorare la fluorescenza per assicurarsi che grandi macchie di tessuto sono stati rotti. Ripetere il passaggio 5.2 se questo non è il caso.</li>
	<li>Utilizzando una punta di tubo arrotondata molto stretta (generata al punto 2.2.2), pipet su e giù 1-2 volte. NOT:</</c1> Solo le singole celle devono essere visibili dopo il passaggio 5.3. Si consiglia di utilizzare piastre a 24 pozze perché consentono un facile monitoraggio del processo. Quando alcuni campioni sono stati elaborati e hanno dato risultati soddisfacenti (cellule secondarie dall'aspetto sano perfettamente dissociate), i passaggi di pipettaggio verranno eseguiti nel microtubo.</li>
	<li>Attendere almeno 15 min per lasciare che le cellule si stabilizzino nella parte inferiore del pozzo e rimuovere l'SSM in eccesso per ridurre il tempo di smistamento. NOT:</</c2> Lasciare che le cellule si depositino si sono dimostrate superiori a metodi alternativi come la centrifugazione e consente un'ultima ispezione visiva delle cellule poco prima del FACS.</li>
	<li>Convogliale alle cellule in un tubo pulito da 1,5 mL e piscina campioni identici (due lotti di 20 maschi per ogni condizione). Sciacquare i pozzi con SSM per recuperare le ultime cellule e convogliarle nel tubo (utilizzare un piccolo volume).</li>
	<li>In microtubi da 1,5 mL, aggiungere 300 l of Cell Lysis Solution e 1 ll di Proteinase K [50 g/l] (soluzioni fornite nel kit di purificazione dell'RNA, vedere il passaggio 7). Preparare due tubi per ogni campione (uno per gli MC e uno per gli SCs).</li>
</ol>6. FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting)
<ol><li>Aggiungere un marcatore di vitalità a ogni campione da ordinare pochi minuti prima dell'ordinamento (0,3 mM Draq7). ATTENZIONE: Draq7 deve essere gestito con cautela.</li>
	<li>
Ordinare una popolazione omogenea di cellule secondarie vive (cellule GFP-positive, Draq7-negative). In un altro microtubo, ordinare una popolazione di cellule principali (più piccole, GFP-negativo, Draq7-negativo). Utilizzare la seguente strategia di gating FACS: NOTA: Impostare la pressione della selezione celle a 25 PSI e passare le celle attraverso un ugello di 100 m. La velocità di smistamento è di circa 2.000 celle/s.<ol>
<li>Escludere i detriti e selezionare le celle totali in base a FSC-SSC(Figura 2E) per escludere i detriti.</li>
		<li>Escludere le cellule morte. Emoziono Draq7 con un laser da 640 nm e raccogli la fluorescenza emessa con un filtro passa-banda 795/70. Cancello Draq7-positivo cellule fuori (Figura 2F).</li>
		<li>Rimuovere i doppietti utilizzando un doppio gating su SSC-H vs SSC-W e FSC-A vs FSC-H (Figura 2H). NOT:</</c9> Escludere rigorosamente i doppi cellulari usando il doppio gating, per ridurre la contaminazione cellulare principale.</li>
		<li>Ordinare le cellule gFP-positive in un microtubo da 1,5 mL con buffer di lisni e Proteinase K. Questa popolazione è considerata cellule secondarie (SC, Figura 2G). Escite GFP a 488 nm e raccogli la fluorescenza emessa con un filtro passa-banda 526/52.</li>
		<li>Ordina 1.000 cellule GFP-negative, omogenee e di piccole dimensioni, in un microtubo da 1,5 mL con buffer di lysis e Proteinase K. Questa popolazione è considerata cellule principali (MC, Figura 2G).</li>
		<li>Vortice tutti i campioni. NOT:</</c14> Da 40 maschi (40 x 80 SC e 3.200 cellule secondarie), si ottengono da 600 a 800 cellule secondarie singlet vive (circa il 20-25% di recupero). Interrompere lo smistamento di circa 550 SC e 1.000 MC per normalizzare i campioni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Estrazione dell'RNA
 NOT:</</c0> Abbiamo usato il kit di purificazione dell'RNA Epicentre MasterPure per l'estrazione dell'RNA, con i seguenti adattamenti. Altri kit potrebbero essere utilizzati fino a quando il rendimento è abbastanza alto per preparare una libreria per la sequenziazione da 500 dollari (2 ng RNA è stato utilizzato qui).
<ol><li>Campioni di calore a 65 gradi centigradi per 15 min e vortice ogni 5 min per completare la lisi cellulare.</li>
	<li>Posizionare i campioni sul ghiaccio per 5 min. Seguire le raccomandazioni del produttore per le precipitazioni degli acidi nucleici (parti "Precipitazioni di acidi nucleici totali" e "Rimozione del DNA contaminato dai preparatia dell'acido nucleico totale").</li>
	<li>Sospendere l'RNA pellet in 10 -L di buffer TE senza RNase.</li>
	<li>Aggiungere l'inibitore rNase (opzionale).</li>
	<li>Conservare i campioni a -80 gradi centigradi.</li>
</ol>8. Controlli di qualità di quantità, qualità e specificità dell'RNA
<ol><li>Stimare la qualità e la concentrazione dell'RNA. A causa del piccolo volume e della concentrazione, usa i chip RNA 6000 Pico qui. L'RNA di buona qualità è definito come non degradato, visibile come una linea di base bassa con picchi taglienti corrispondenti ai rRNA.</li>
	<li>
RT-qPCR per controllare l'identità delle celle ordinate
	<ol>
<li>Eseguire la trascrizione inversa con 2 ng di RNA totali utilizzando hexamers casuali come primer. Eseguire RT sull'RNA della cellula secondaria e sull'RNA della cellula principale. NOTA: i cDNA possono essere diluiti, applicati e tenuti congelati per un uso successivo.</li>
		<li>Esegui la PCR quantitativa in tempo reale utilizzando le coppie di primer appropriate per quantificare i geni delle pulidi (alpha-Tubulin, 18S rRNA),i geni specifici delle cellule secondarie (MSA, Rab19, Abd-B) e il gene specifico della cellula principale (Sex peptide).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Sequenziamento (preparazione della libreria cDNA, sequenziamento e analisi dei dati)
<ol><li>Utilizzare 2 ng di RNA totali per sintetizzare i cDNA con i primer polidT. Utilizzare la tecnologia SMARTer per amplificarli per l'amplificazione.</li>
	<li>Utilizzare un kit Nextera XT per preparare la libreria.</li>
	<li>Sequenza che usa il sequenziamento multiplexed, 100 nucleotidi letture singole (anche se 50 letture nucleotidi sono appropriate per la maggior parte degli scopi) per produrre circa 30 milioni di letture per ogni campione.</li>
</ol>10. Analisi dei dati
<ol><li>Eseguire FastQC.</li>
	<li>Utilizzare l'allineatore STAR per mappare le letture sul genoma di riferimento di UCSC dm6 Drosophila e generare file .bam. Utilizzare Integrative Genomics Viewer (IGV) per visualizzare le letture sul browser del genoma.</li>
	<li>Utilizzare HTSeq per eseguire conteggi genici.</li>
	<li>Utilizzare il metodo Trimmed Mean of M-values (TMM) per normalizzare i conteggi genici22. Utilizzare edgeR per eseguire analisi statistiche di espressione differenziale, grafici MA e PCA.</li>
	<li>Per l'analisi e le statistiche dell'espressione genica, utilizzare Modello lineare generale, quasi-probabilità F-test con False Detection Rate (FDR) e Benjamini & Hochberg correzione (BH).</li>
</ol>

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<li>Leiblich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-+and+mating-dependent+secretory+cell+growth+and+migration+in+the+Drosophila+accessory+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).</li>
<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+conditions+sensed+by+the+reproductive+organ+during+development+optimize+male+fecundity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila.</a> Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).</li>
<li>Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-based+isolation+and+RNA+extraction+of+Secondary+Cells+from+the+Drosophila+male+Accessory+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland.</a> bioRxiv. , 630335(2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna divulgazione.

I metodi per la dissociazione cellulare dal tessuto della Drosophila come i dischi immaginari sono già descritti23. I nostri tentativi di utilizzare semplicemente queste procedure sulle ghiandole accessorie fallirono, incoraggiandoci a sviluppare questo nuovo protocollo. La digestione proteasi e la triturazione meccanica sono stati i passi critici che abbiamo colpito per il successo della procedura, e abbiamo quindi inserito molte note nelle sezioni da 2 a 5 per aiutare gli sperimentatori...

Gli organi sono costituiti da più tipi di cellule, ognuna con funzioni discrete e talvolta esprimi nobili di geni molto diversi. Per ottenere una comprensione precisa di come funziona un organo, è spesso fondamentale studiare ogni tipo di cellula distinta che costituisce questo organo. Uno dei metodi principali utilizzati per esplorare la possibile funzione è l'analisi del trascrittoma. Questo potente metodo fornisce un'istantanea dell'espressione genica in una cellula, per rivelare processi e percorsi attivi. Tuttavia, questo tipo di analisi è spesso difficile per le popolazioni di cellule rare che devono essere purificate da cellule vicine molto più abbondanti. Ad esempio, la ghiandola accessoria maschile della Drosophila è un organo composto principalmente da due tipi di cellule secretorie. Poiché il più raro dei due tipi di cellule comprende solo il 4% delle cellule di questa ghiandola, l'uso di un'analisi del trascrittoma specifico di tipo cella non era stato utilizzato per aiutare a determinare la funzione di queste cellule.
Le ghiandole accessorie (AG) sono organi del tratto riproduttivo maschile negli insetti. Sono responsabili della produzione della maggior parte delle proteine del liquido seminale (proteine del liquido seminale (SFP) e proteine accessorie della ghiandola (ACP)). Alcuni di questi SFP sono noti per indurre le risposte fisiologiche e comportamentali nelle femmine accoppiate, comunemente chiamate risposta post-accoppiamento (PMR). Alcuni dei PMR includono: un aumento dell'ovulazione e del tasso di deposizione delle uova, lo stoccaggio e il rilascio di spermatozoi, un cambiamento nella dieta femminile, e una diminuzione della ricettività femminile ai maschi corteggiati secondari1,2. Poiché gli insetti hanno un impatto su molti importanti problemi sociali dalla salute umana (come vettori per malattie mortali) all'agricoltura (gli insetti possono essere parassiti, ma sono fondamentali per l'impollinazione e la qualità del suolo), la comprensione della riproduzione degli insetti è un'importante area di ricerca. Lo studio di AG e ACP è stato avanzato in modo significativo con l'organismo modello Drosophila melanogaster. Questi studi hanno evidenziato il ruolo degli AG e di alcune delle singole proteine che producono nella creazione del PMR, influenzando il lavoro in altre specie come il vettore di malattia Aedes aegypti3,4, e altri insetti1 ,5. Inoltre, poiché gli AG secernono i costituenti del liquido seminale1,6 sono spesso considerati come l'analogo funzionale della ghiandola prostatica dei mammiferi e della vescica seminale. Questa somiglianza di funzione combinata con somiglianze molecolari tra i due tipi di tessuto, hanno reso il GS un modello per la ghiandola prostatica nelle mosche7.
All'interno del maschio della Drosophila, ci sono due lobi di ghiandole accessorie. Ogni lobo può essere visto come una struttura simile a un sacco costituita da un monostrato di cellule secretorie che circondano un lumari centrale, e avvolto da muscoli lisci. Come accennato in precedenza, esistono due tipi di cellule secretorie morfologicamente, dallo sviluppo e funzionalmente distinte che compongono questa ghiandola: le cellule principali a forma di poligono (che costituiscono il 96% delle cellule) e le celle secondarie più grandi e rotonde (SC) (che costituiscono il restante il 4% delle cellule, o circa 40 cellule per lobo). È stato dimostrato che entrambi i tipi di cellule producono insiemi distinti di ACP per indurre e mantenere il PMR. La maggior parte dei dati ottenuti fino ad oggi evidenzia il ruolo di una singola proteina nell'innescare la maggior parte dei comportamenti caratteristici del PMR. Questa proteina, il peptide sessuale, è un piccolo peptide aminoacido 36 che viene secreto dalle cellule principali8,9,10. Anche se il peptide sessuale sembra svolgere un ruolo importante nel PMR, altri ACP, prodotti da entrambe le cellule principali e secondarie, hanno anche dimostrato di influenzare vari aspetti del PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Ad esempio, sulla base delle nostre attuali conoscenze, le SC, attraverso le proteine che producono, sembrano essere necessarie per la perpetuazione della segnalazione SP dopo il primo giorno18.
Data la rarità delle SC (solo 80 cellule per maschio), tutte le nostre conoscenze su queste cellule e sulle proteine che producono provengono dalla genetica e dagli approcci candidati. Finora, solo un elenco relativamente piccolo di geni ha dimostrato di essere specifico SC. Questo elenco include la proteina dell'omeodominio Defective provenive (Dve)19, lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 e 1921, CG1656 e CG1757511, 15,21 e il fattore di trascrizione omeobox Abdominal-B (Abd-B)18. In precedenza, abbiamo dimostrato che un mutante carente sia per l'espressione di Abd-B che per l'MSA lncRNA nelle cellule secondarie(iab-6cocuD1 mutant) accorcia la lunghezza del PMR da 10 giorni a un solo giorno12 , 18 mi lato , 20.Questo fenotipo sembra essere causato dall'immagazzinamento improprio di SP nel tratto riproduttivo femminile12,18,20. A livello cellulare, le cellule secondarie di questo mutante mostrano una morfologia anormale, perdendo le loro caratteristiche strutture vacuole18,20,21. Utilizzando questa linea mutante, in precedenza abbiamo tentato di identificare i geni coinvolti nella funzione SC confrontando i profili trascrizionali di interi gruppi di disponibilità da ghiandole accessorie di tipo selvatico omutanti 12. Inoltre, altri laboratori hanno dimostrato che il numero SC, la morfologia e il contenuto vacuolare dipendono dalla dieta maschile, dallo stato di accoppiamento e dall'etàdi 21anni,25,26.
Anche se sono stati compiuti progressi positivi utilizzando questi approcci, un trascrittoma SC completo era ben lungi dall'essere raggiunto. La rarità di queste cellule in questo organo ha reso difficile progredire ulteriormente anche da cellule di tipo selvatico. Per testare l'espressione genica, i cambiamenti in queste cellule dopo particolari stimoli ambientali sarebbero ancora più difficili. Pertanto, era necessario un metodo per isolare e purificare l'RNA SC che fosse abbastanza veloce e semplice da funzionare in diversi contesti genetici e condizioni ambientali.
Entrambi i geni Abd-B e MSA richiedono un potenziatore specifico di 1,1 kb dal complesso Drosophila Bithorax (chiamato potenziatore D1) per la loro espressione in SCs18,20. Questo potenziatore è stato utilizzato in precedenza per creare un driver GAL4 che, se associato a un UAS-GFP,è in grado di guidare un'espressione GFP forte in particolare nei SCs. Così, abbiamo usato questa linea come base per un protocollo FACS per isolare queste cellule sia dal tipo selvaggio che dai cocuD1 aG iab-6). Poiché le SC mutate iab-6cocuD1 mostrano una morfologia cellulare diversa, mostriamo che questo protocollo può essere utilizzato per isolare le cellule per la determinazione del loro trascrittoma da questo raro tipo di cellula in condizioni molto diverse.

<table><tbody><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binoculare per dissezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binoculare con sorgente luminosa per GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Draq7 0,3 mM</td><td>BioStatus</td><td>DR71000</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette in plastica 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per dissezione fine Siero</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bovino fetale</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>inattivato a caldo prima dell'uso</td></tr><tr><td>Piatti di vetro per la dissezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secchiello</td><td></td><td></td><td></td></tr> per <tr><td>il ghiaccio Sistema di trascrizione inversa ImProm-II</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione dell'RNA MasterPure</td><td>Epicentro</td><td>MCR85102</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nextera XT</td><td>illumina</td><td></td><td><a href="https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html</a></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td></td><td></td><td>50U/mL stock</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>fatto in casa</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td></td><td></td><td></td>PolydT</tr><tr><td>Primer esamero casuale RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6000 Pico kit</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medium</td><td>Gibco</td><td>21720-001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi di cDNA SMARTer</td><td>Takara</td><td></td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits">https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits</a></td></tr><tr><td>SYBR select Master mix per CFX</td><td>applicato biosystems</td><td>4472942</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Hangzhou Allsheng strumenti</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 1250 &mu; Punta graduata a L</td><td>Starlab</td><td>S1161-1820</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 200 &mu; Punta smussata a L</td><td>Starlab</td><td>S1161-1800</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo basato su facs per isolare l'rna dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della drosophila

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Per comprendere la funzione di un organo, è spesso utile comprendere il ruolo delle sue popolazioni cellulari costituenti. Sfortunatamente, la rarità delle singole popolazioni di cellule spesso rende difficile ottenere materiale sufficiente per studi molecolari. Ad esempio, la ghiandola accessoria del sistema riproduttivo maschile della Drosophila contiene due tipi distinti di cellule secretory. Le cellule principali costituiscono il 96% delle cellule secretory della ghiandola, mentre le cellule secondarie (SC) costituiscono il restante 4% delle cellule (circa 80 cellule per maschio). Sebbene entrambi i tipi di cellule producano componenti importanti del liquido seminale, solo pochi geni sono noti per essere specifici per le SCs. La rarità delle SC ha, finora, ostacolato lo studio di analisi trascrittomica di questo importante tipo di cellula. Qui, viene presentato un metodo che consente la purificazione delle SCs per l'estrazione e il sequenziamento dell'RNA. Il protocollo consiste nel sezionare prima le ghiandole da mosche che esprimono un reporter GFP specifico scmedico e poi sottoponendo queste ghiandole alla digestione proteasi e alla dissociazione meccanica per ottenere singole cellule. Seguendo questi passi, le cellule individuali, viventi, marcate TBC vengono ordinate utilizzando un sorter cellulare attivato fluorescente (FACS) per la purificazione dell'RNA. Questa procedura produce RNA specifici di SC da 40 maschi per condizione per il sequenziamento a valle di RT-qPCR e/o RNA nel corso di un giorno. La rapidità e la semplicità della procedura consentono di determinare in un breve periodo di tempo i trascrittomi di molte mosche diverse, provenienti da genotipi o condizioni ambientali diverse.

Il protocollo qui presentato consente a uno sperimentatore di isolare le cellule secondarie dalle ghiandole accessorie maschili della Drosophila e di estrarre il loro RNA nel corso di un solo giorno (Figura 1).
Usiamo il costrutto Abd-B-GAL4 18 per etichettare le celle secondarie (SC) ma non le celle principali (MC) con GFP(Figura 2</str...

Qui, presentiamo un protocollo per dissociare e ordinare una popolazione cellulare specifica dalle ghiandole accessorie maschili della Drosophila (cellule secondarie) per il sequenziamento dell'RNA e RT-qPCR. L'isolamento cellulare si realizza attraverso la purificazione FACS delle cellule secondarie che esprime GFP dopo un processo di dissociazione multifase che richiede dissezione, proteasi di gestione e dispersione meccanica.

Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Questo metodo consente un'analisi trascritomica di una rara popolazione cellulare proveniente dalla ghiandola accessoria maschile drosofila, chiamata cellule secondarie, e scopre geni che li rendono fondamentali per il successo riproduttivo. Nel corso di un giorno, questa tecnica consente lo smistamento di cellule secondarie da diversi genotipi e l'estrazione dell'RNA totale per il successivo sequenziamento qPCR o RNA. A volte i progetti sono limitati dalla rarità della materia prima.Questo metodo può fornire la base per altri gruppi che affrontano la sfida di lavorare con una popolazione cellulare rara. Poiché la procedura deve accumulare 40 ghiandole, è importante praticare le dissezioni. Anche preparare le punte di pipetta fatte in casa è importante, quindi dovresti visualizzarlo sul video come farlo e prepararlo in anticipo.Prima di iniziare la procedura, tagliare e fiammare punte rotonde, larghe, da 200 microliter per la gestione delle ghiandole e passare l'apertura della punta di più punte di 1.000 microliter vicino a una fiamma per meno di un secondo per restringere le aperture. Quindi, ordina le punte modificate da più strette a più larghe in base alla loro velocità di aspirazione. Per la dissezione della ghiandola accessaria, mettere da 20 a 25 Drosophila maschi in un piatto di vetro sul ghiaccio e utilizzare le forcette e un microscopio a dissezione per rimuovere il tratto riproduttivo di una mosca maschile.Cancellare la coppia di ghiandole accessorie da tutti gli altri tessuti, compresi i tester e il bulbo eiaculatorio, e trasferire le ghiandole accessorie su una piastra di vetro contenente mezzo integrato nel siero a temperatura ambiente. Quando sono state raccolte 20 paia di ghiandole accessorie, lavare le ghiandole in un piatto di PBS per uno o due minuti a temperatura ambiente. Alla fine del lavaggio, trasferire le ghiandole in una soluzione di dissociazione preparata al momento e utilizzare forcep affilate sotto un microscopio sezionante per pizzicare saldamente il centro di un lobo ghiandolare.Usando una seconda coppia di forcelle, tagliare il tessuto con la punta affilata per separare la regione prossimale della ghiandola accessoria e il condotto eiaculatorio dalla porzione della ghiandola contenente cellule secondarie. Tagliare le ghiandole in modo che le peptidasi possano raggiungere le cellule che sono altrimenti protette dallo strato muscolare esterno e dal liquido seminale viscoso nel lume della ghiandola. Quindi, utilizzare una punta di pipetta pre-bagnata, arrotondata alla fiamma, larga, da 200 microlitri per trasferire le ghiandole in un tubo da 1,5 millilitri.Per la digestione dei tessuti, posizionare il tubo in uno shaker Celsius di 37 gradi per 60 minuti a 1.000 rotazioni al minuto. Alla fine dell'incubazione, interrompere la digestione con un millilitro di mezzo integrato nel siero e utilizzare una punta di pipetta pre-bagnata, arrotondata alla fiamma, larga, 1.000 microliter per trasferire i campioni su una piastra da 24 pozzetto. Controllare le cellule per la loro espressione GFP al microscopio fluorescente.La maggior parte delle punte della ghiandola dovrebbe sembrare intatta e alcune cellule secondarie dovrebbero essere staccate. Utilizzare una punta arrotondata, stretta, da 1.000 microliter per triturare delicatamente le cellule da tre a cinque volte per interrompere il tessuto della ghiandola accessoria. Quindi, utilizzare una punta di pipetta molto stretta, arrotondata, da 1.000 microliter una a due volte per personalizzare le cellule.Lasciare che le cellule si sistemino per 15 minuti. Verificare che le cellule appaiano sane al microscopio e rimuovere il mezzo in eccesso. Quindi, trasferire le cellule in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e risciacquare i pozzi con mezzo fresco per recuperare eventuali cellule rimanenti.Il costrutto Abd-B-GAL4 può essere usato in questi esperimenti per etichettare le cellule secondarie ma non principali con GFP. In questo studio, entrambi i tipi di cellule sono stati ordinati da ghiandole accessorie mutanti di tipo selvaggio e iab-6cocuD1. Questo mutante D1 manca dell'espressione delle trascrizioni Abd-B e MSA, che influenzano lo sviluppo, la morfologia e la funzione delle cellule secondarie.Dopo la dissociazione cellulare, facs viene utilizzato per selezionare cellule viventi basate su DRAQ7, e il livello di fluorescenza GFP viene utilizzato per isolare le cellule secondarie e le cellule principali. L'RNA viene estratto da ogni popolazione cellulare e adattato a due nanogrammi per campione per il successivo RT-qPCR e sequenziamento. La quantificazione dell'espressione di geni specifici mediante PCR quantitativa in tempo reale su estratti cellulari principali e secondari di tipo selvatico rivela che i geni delle cellule secondarie Rab19 e MSA sono rilevati solo da estratti di cellule secondarie, mentre il peptide sessuale del gene cellulare principale viene rilevato solo da campioni di cellule principali.L'analisi dei componenti principali sui dati di sequenziamento dell'RNA di tre tipi selvatici e tre repliche mutanti rivela che il tipo selvaggio replica entrambi gli ammassi vicini l'uno all'altro e lontano dai campioni mutanti. La visualizzazione di letture allineate a particolari geni mostra che i geni delle pulizie come l'actina 5C e i geni secondari specifici delle cellule Rab19 e Dve sono espressi in entrambi i genotipi. Per la MSA, tuttavia, la forte espressione del gene osservato nelle mosche di tipo selvatico si perde nei ceppi mutanti.Ottenere abbastanza cellule secondarie dissociate viventi è importante per una procedura di successo. Pertanto, verificare il protocollo di dissezione e dissociazione nell'esperimento su piccola scala. Questo metodo consente lo smistamento di entrambi i tipi cellulari di ghiandola accessoria da un piccolo numero di mosche, consentendo lo studio di come quelle cellule reagiscono trascrittamente a più condizioni genetiche o ambientali.Il successo riproduttivo maschile è noto per essere influenzato da molte cose, tra cui genotipo, età e stato di accoppiamento. La facilità di questo metodo dovrebbe consentirci di indagare come questi fattori influenzano la trascrizione della ghiandola accessoria.

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Drosophila melanogaster testicoli possono essere rapidamente ed efficacemente isolato da maschi adulti con aghi dissezione. Con la pratica, si può facilmente isolare in uno o due giorni una quantità di testicoli sufficiente per l'analisi del DNA o RNA mediante sequenziamento throughput elevato o più tradizionali metodi di biologia molecolare o di proteine ​​per i test degli anticorpi-o a base di enzimi.

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Stadio-specifica isolamento di medio-tardiva follicoli Drosophila è utile per una varietà di scopi. Tali follicoli si sviluppano nella cultura, che permette di manipolazioni genetiche e / o farmacologici per essere accoppiato con saggi in vitro di sviluppo e immagini dal vivo. Inoltre, follicoli possono essere usate per studi molecolari, come isolare mRNA e proteine.

L&#39;utilità della fase-specifici medio-tardiva<em&gt; Drosophila</em&gt; Follicolo isolamento

Metodi per isolare e preparare Drosophila testicoli campioni (vivere e fissa) per l'imaging dal contrasto di fase e microscopia a fluorescenza sono descritte qui.

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Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l'espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l'analisi dell'espressione genica e della cromatina.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

La purificazione dell'affinità ribosomiale traducente (TRAP) è in grado di catturare la traduzione specifica del tipo di cellula dell'mRNA. Qui riportiamo il primo protocollo TRAP dedicato all'isolamento dell'mRNA in rare popolazioni cellulari di embrioni di Drosophila.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un approccio semplice e poco costoso per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g) e la preparazione di estratti proteici che possono essere utilizzati nelle applicazioni proteomiche a valle, come la spettrometria di massa di purificazione-affinità (AP-MS ).

Preparazione su media scala di<em&gt; Drosophila</em&gt; Estratti di embrioni per esperimenti proteomici

Il protocollo descrive un metodo efficiente e affidabile per quantificare la lunghezza del poli(A) del gene di interesse dal sistema nervoso della Drosophila , che può essere facilmente adattato a tessuti o tipi cellulari di altre specie.

Misurazione della lunghezza della coda di Poly A dal cervello e dalla linea cellulare della larva di Drosophila

Impara un protocollo FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili di Drosophila. Questo metodo consente l'analisi trascrittomica di popolazioni cellulari rare essenziali per il successo riproduttivo.

Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila

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