Name: Un protocollo di criopulverizzazione per lelaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Impara un metodo di criopulverizzazione per elaborare zampe di topo e migliorare l'estrazione di RNA e proteine di alta qualità. Questa tecnica consente l'analisi dei profili molecolari associati alle risposte infiammatorie nell'artrite.

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Gli autori desiderano ringraziare Edith Janssen per la revisione critica del manoscritto e Navin Rao e Jennifer Towne per il loro sostegno alla pubblicazione di questo manoscritto.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le politiche del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della R&S di Janssen.
1. Metodo di pulverizzazione criogenico basato sul mulino congelatore
<ol><li>Al termine dello studio della CIA, sacrificare i topi con 1.5% isoflurane seguiti da lussazione cervicale.</li>
	<li>Il giorno della lavorazione dei tessuti, preraffreddare tutti gli strumenti (spatole, fiale di macinazione, ecc.) sul ghiaccio secco per un minimo di 10 min. Indossare guanti termici per evitare danni da congelamento.</li>
	<li>Tagliare le zampe posteriori con una forbice alla linea di pelliccia come raffigurato nella Figura 1A.</li>
	<li>Trasferire ogni zampa in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, congelare immediatamente in azoto liquido e conservare le zampe congelate a -80 gradi centigradi. Non tenere i campioni congelati per più di una settimana.</li>
	<li>Riempire il mulino congelatore con azoto liquido come mostrato nella Figura 1B e lasciare che sia equilibrato per almeno 10 min.</li>
	<li>Conservare il campione non lavorato sul ghiaccio secco ed evitare cicli di congelamento-scongelamento.</li>
	<li>Trasferire una zampa posteriore in una grande fiala di macinazione in policarbonato preraffreddata con una spina d'acciaio inferiore, inserire l'impattore in acciaio pre-raffreddato e chiudere la fiala di macinazione in policarbonato con la spina in acciaio superiore pre-raffreddato (Figura 1C).</li>
	<li>Trasferire grandi fiale di macinazione in policarbonato con i campioni nel congelatore pre-riempito con liquido e chiudere il coperchio con la chiusura di gomma trovata nella parte anteriore dello strumento.</li>
	<li>Lasciare raffreddare i campioni in azoto liquido per 1 minuto.</li>
	<li>Impostare il mulino del congelatore sul programma di 1 minuto con 10 cicli al secondo e premere il pulsante di avvio. Attendere che il congelatore completi il ciclo. NOT:</</c6> La macchina emette un suono di batteria mentre l'impatto in acciaio si muove avanti e indietro. Utilizzare tappi per le orecchie per evitare la perdita dell'udito.</li>
	<li>Aprire il coperchio del congelatore, estrarre la grande fiala di macinazione in policarbonato e metterla in un estrattore come raffigurato nella Figura 1D. Rimuovere la spina di acciaio superiore posizionando la pressione verso il basso sulla maniglia nera fino a quando il tappo in acciaio scivola fuori dal tubo in policarbonato.</li>
	<li>Trasferire la grande fiala di macinazione in policarbonato aperta sul ghiaccio secco. Rimuovere l'impatto dell'acciaio con pinze pre-raffreddamento.</li>
	<li>Trasferire la polvere congelata in un tubo conico pre-raffreddato da 50 mL.</li>
	<li>Peso 30-50 mg di polvere congelata in un tubo di microcentrifuga congelato in tarata da 1,5 mL per l'estrazione dell'RNA e 100-200 mg di polvere congelata per l'estrazione di proteine. NOT:</</c9> La polvere congelata dovrebbe apparire come sabbia fine bianco o rosa chiaro come raffigurato in Figura 1E.</li>
	<li>Conservare campioni polverizzati a -80 gradi centigradi e procedere all'isolamento di RNA e proteine entro 24 h.</li>
</ol>2. Estrazione dell'RNA
<ol><li>Aggiungere 10 L di mercaptoetanolo (z-ME) per 1 mL di buffer RLT.</li>
	<li>Calcolare il volume di RLT Buffer corrispondente a un rapporto di 23,3 mL/mg di tessuto e aggiungere il volume appropriato di RLT Buffer con z-ME al tubo con polvere congelata. Questo rapporto era empiricamente determinato per essere ideale per le zampe dei topi.</li>
	<li>Vorticare il campione a 3.000 RPM per 10 s.</li>
	<li>Mescolare bene conilare su e giù 10 volte vigorosamente con un pipettor 1 mL.</li>
	<li>Vorticare il campione di nuovo a 3.000 RPM per 20 s.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 13.000 x g per 2 min.</li>
	<li>Trasferire 700 l di z L dei supernatanti in un tubo fresco e aggiungere 700 lun del 70% di etanolo. NOT:</</c1> Se nel tubo è presente <700 , è accettabile procedere, aggiungendo comunque un volume equivalente del 70% di etanolo.</li>
	<li>Caricare 700 -L del campione su una colonna di purificazione dell'RNA.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 10.000 dollari x g per 30 s.</li>
	<li>Eliminare il flow-through e caricare la parte rimanente del campione nella colonna RNeasy.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 10.000 dollari x g per 30 s.</li>
	<li>Scartare il flusso e lavare la colonna aggiungendo 700 luna di tampone RW1 con centrifugazione di 10.000 x g per 30 s. Se si esegue l'opzione di digestione DNASE, viene aggiunto 350 L di RW1 prima del trattamento DNASE.  E dopo il trattamento DNASE vengono aggiunti altri 350 luna di RW1.</li>
	<li>Facoltativo) Eseguire un passaggio di digestione DNase seguire le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Lavare il tubo due volte aggiungendo 500 L di tampone RPE seguito da centrifugazione a 10.000 dollari x g per 30 s. Scartare il flusso attraverso ogni volta.</li>
	<li>Asciugare la colonna per centrifugazione a 10.000 dollari x g per 2 min.</li>
	<li>Elute RNA aggiungendo 50 o più acqua con centrifugazione a 10.000 dollari x g per 2 min. Raccogliere il flusso attraverso e trasferire in un nuovo tubo da 1,5 mL.</li>
	<li>Determinare la quantità di RNA utilizzando il metodo di scelta del ricercatore e conservare a -80 gradi centigradi prima di ulteriori analisi.</li>
</ol>3. Estrazione di proteine
<ol><li>Diluire la soluzione di stock di lisi 10x cellule in 1x soluzione di stock di lisi 1x cella utilizzando acqua di grado coltura cellulare.</li>
	<li>Ricostituire il Protease Inhibitor Cocktail Set I con 1 mL di acqua per fare uno stock di inibitori proteasi 100x.</li>
	<li>Aggiungere 100 l di inibitore della proteasi a 9,9 mL di lisi 1x Cell per fare una soluzione di stock finale 1x.</li>
	<li>Aggiungere 4 - L di ghiaccio freddo 1x Cell Lysis Buffer per mg tessuto in polvere (ad esempio, 800 L di lisi tampone a 200 mg di polvere di tessuto).</li>
	<li>Aggiungere una perlina in acciaio inossidabile di 5 mm al tubo.</li>
	<li>Vorticare il tubo a 3.000 giri/min per 60 s. Trasferire il tubo sul ghiaccio bagnato e continuare fino al campione successivo.</li>
	<li>Mettere tutti i tubi campione in una scatola e agitare la scatola di centrifuga su un rocker a 1.000 giri/ hanno 1,000 giri/min, 4 gradi centigradi per 1 h. NOT:</</c0> I ricercatori possono scoprire che il posizionamento della scatola verticale può facilitare una migliore miscelazione con il tallone.</li>
	<li>Centrifugare i tubi a 10.000 x g e 4 gradi centigradi per 15 min.</li>
	<li>Trasferire i supernatanti in un tubo fresco ed evitare lo strato di grasso sulla parte superiore.</li>
	<li>Determinare la concentrazione totale di proteine. Da 10 a 30 volte diluizioni di proteine lisate sono ideali per un test BCA.</li>
	<li>Aliquota il campione in tubi di microcentrismo da 1,5 ml e conservatelo a -80 gradi centigradi prima di ulteriori analisi.</li>
</ol>

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li>
<li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226(2009).</li>
<li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis%3A+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li>
<li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+factors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+Allergy%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li>
<li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis%3A+focus+on+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+%26+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li>
<li>Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticytokine+treatment+of+established+type+II+collagen-induced+arthritis+in+DBA%2F1+mice.+A+comparative+study+using+anti-TNF+alpha+anti-IL-1+alpha%2Fbeta%2C+and+IL-1Ra%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra.</a> Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).</li>
<li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li>
<li>Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+a+model+for+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis.</a> Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).</li>
<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li>
</ol>

Gli autori BJ, SH, ML, RM, ML, TO e FS sono dipendenti di Janssen Research & Development Inc e sono azionisti della società madre, Johnson & Johnson, Inc.

Anche se c'è una forte logica scientifica per valutare le vie molecolari nei tessuti sinoviali, molte segnalazioni sulla profilazione immunitaria del modello della CIA murina erano focalizzate sul sangue periferico, mentre i dati di analisi delle proteine e dell'RNA delle zampe infiammate sono piuttosto limitati. Ci sono diverse possibili ragioni per questo pregiudizio: le articolazioni della caviglia murina non sono più grandi di 2 cm; le aree colpite sono costituite da tessuti cutanei, ossei e connettivi che sono spess...

L'artrite reumatoide (RA) è una malattia infiammatoria sistemica cronica con sinovite simmetriche persistenti nelle articolazioni e coinvolgimento extra articolare di organi come la pelle, il cuore, i polmoni e gli occhi1. Anche se le manifestazioni sistemiche della risposta immunitaria sono evidenti nei pazienti umani, uno dei segni distintivi della patologia RA è l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel tessuto sinoviale e la proliferazione delle cellule fibroblaste sinoviali2.
Simile all'AR umana, il modello di artrite indotta dal collagene di topo (CIA) suscita una forte infiammazione tissutale con risposte immunitarie attive nei tessuti sinoviali e nei compartimenti sistemici. La suscettibilità di diversi ceppi di mouse al modello CIA si collega all'aplotipo del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) e alle interazioni specifiche delle cellule T e delle cellule B3,4. Inoltre, molte vie patogene nell'AR umana, tra cui la produzione di autoanticorpi, deposizione del complesso immunitario, attivazione delle cellule mieloidi, manifestazioni poliuacolari e formazione di pannus con infiltrazione immunitaria sinoviale, sono anche evidenti in questo modello 5,6. Gli investigatori hanno impiegato questo modello ben consolidato CIA per studiare gli effetti dei trattamenti citochini antinfiammatori7. Molti biologici omologati per le malattie autoimmuni o infiammatorie, come anti-TNF e anti-IL-6, sono trovati per essere efficace nel modello CIA8,9.
Profilare le interazioni del sistema immunitario nel tessuto sinoviale è fondamentale per chiarire i meccanismi molecolari associati alla patogenesi dell'AR. Nell'ambiente clinico umano, una pratica comune è quella di eseguire biopsie sinoviali dell'ago sotto la guida dell'imaging a ultrasuoni. Negli ambienti preclinici, l'architettura più piccola delle articolazioni murine rende le procedure di biopsia molto più difficili se non impossibili. Recentemente, abbiamo dimostrato l'utilizzo del modello murine CIA per valutare combinazioni di farmaci per influenzare diversi endpoint e risolvere la malattia in un approccio combinatorio10. È stato utilizzato un metodo di polverizzazione criogenico basato sul mulino a congelatore per elaborare le zampe murine infiammate in polveri fini omogenee e stabilire processi a valle per estrarre RNA e proteine. Questo metodo protegge l'RNA e le proteine dai processi degrativi enzimatici e chimici e ci consente di applicare più metodi analitici a una singola fonte di campione omogenea.

<table><tbody><tr><td>Perlina in acciaio inossidabile da 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Agente riducente del campione che inibisce gli enzimi RNASE</td></tr><tr><td>Kit bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Kit di qualificazione RNA</td></tr><tr><td>b-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Grado di coltura cellulare Acqua</td><td>Corning</td><td>25-055-CI</td><td>Soluzione</td></tr><tr><td>madre per lisi cellulare</td> ad acqua <td>Segnalazione cellulare</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>Provette per microfuge</td></tr><tr><td>Eppendorf Eppendorf tube centrifuge Box</td><td>Nalgene</td><td>5055</td><td>Scatola per contenere le provette Eppendorf in una disposizione orizzontale delle provette</td></tr><tr><td>Everlast 247 Rocker a velocità variabile</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td></td></tr><tr><td>Freezer Mill</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6875</td><td>Congelatore/Mulino per la lavorazione delle zampe in polvere polverizzata</td></tr><tr><td>Fiala di macinazione</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6801</td><td>Fiala in policarbonato per la trasformazione delle zampe in polvere polverizzata</td></tr><tr><td>Kit Pierce BCA Kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>per la quantificazione totale delle proteine</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi Cocktail set 1</td><td>Calbiochem</td><td>539131</td><td>Inibitori della</td></tr> <tr><td>proteasiKit BCA proteico</td><td>Kit Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Quantigene</td> Kit per <td>l'analisi del bDNA</td><td>Thermofisher</td><td>QP1013</td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Tampone per centrifugazione</td></tr><tr><td>RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Tampone per estrazione RNA</td></tr><tr><td>Mini kit RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>con colonna RNeasy, tampone RLT e tampone RW1</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td>Rocker/</td></tr><tr><td>Shaker Spatola</td><td>VWR</td><td>10806-412</td><td>Spatola per il trasferimento della polvere</td></tr><tr><td>Perlina in acciaio inossidabile</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>Perlina per la miscelazione durante l'estrazione delle proteine</td></tr><tr><td>Estrattore di provette</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6884</td><td>Estrattore per la rimozione della parte superiore della fiala di macinazione</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>Miscelazione dei campioni</td></tr></tbody></table>

un protocollo di criopulverizzazione per l'elaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

Profilare i cambiamenti molecolari nei tessuti locali è fondamentale per comprendere i meccanismi di azione dei candidati terapeutici in vivo. Nel campo della ricerca sull'artrite, molti studi si concentrano sulle articolazioni infiammate che sono composte da una complessa miscela di ossa, cartilagine, muscoli, cellule stromali e cellule immunitarie. Qui, abbiamo stabilito un metodo meccanico affidabile e robusto per interrompere le zampe di topo infiammate in campioni polverizzati omogenei in un ambiente controllato criogenicamente. Le proteine e i lysati di RNA sono stati elaborati per consentire gli endpoint proteomici e trascrittivi e la caratterizzazione molecolare delle vie di malattia rilevanti nel tessuto locale.

Qui, mostriamo una visualizzazione dell'immagine gel rappresentativa dell'RNA estratta dalle zampe anteriori dei topi della CIA in Figura 2A. Il rRNA 28S e la banda 18S di rRNA indicano che tutti i campioni hanno una quantità sufficiente di RNA intatto. Successivamente, mostriamo un grafico a dispersione rappresentativa delle concentrazioni totali di proteine sulla base dell'analisi della proteina BCA nella figura 2</stro...

È stato sviluppato un metodo criogenico di polverizzazione per la trattamento delle zampe murine utilizzando un congelatore liquido congelatore di azoto per migliorare la resa e la qualità dell'RNA o delle proteine estratte dai tessuti e consentire l'analisi dei profili molecolari associati agli infiammatori Risposte.

Un protocollo di criopulverizzazione per l'elaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

La valutazione dei profili molecolari nei tessuti locali è un passo fondamentale per comprendere il meccanismo d'azione dei farmaci attivi in quanto vengono valutati in modelli preclinici rilevanti per la malattia. Nel campo della ricerca sull'artrite, l'ambiente tissutale locale di interesse sono le piccole articolazioni portanti di peso che sono composte da una complessa miscela di ossa, cartilagine, muscoli e cellule immunitarie. Qui descriviamo un metodo affidabile e robusto per l'interruzione meccanica e/o la polverizzazione di questo complesso ambiente tissutale in un ambiente criogenicamente controllato.Questo metodo può quindi essere utilizzato per generare sforzi di profilazione proteomica e trascrizionale a valle per stabilire firme molecolari della malattia da un'unica fonte di campione uniforme. Questo metodo genera una polvere omogenea a differenza di molte altre vecchie tecniche. Inoltre, la vecchia procedura di isolamento della temperatura consente l'isolamento dell'RNA di alta qualità.Questo metodo può quindi essere utilizzato per generare un profilo proteomico e trascrizionale a valle che consenta la caratterizzazione molecolare delle vie di interesse della malattia pertinenti. Questo metodo può fornire approfondimenti a qualsiasi campo di ricerca che deriva firme molecolari dai tessuti. Il metodo potrebbe essere esteso a qualsiasi sistema tissutale complesso che abbia costituenti densi e difficili da dissociare.Anche se non abbiamo valutato fino a questo punto, potremmo vedere una potenziale applicazione a tessuti cartilaginei densi come orecchie o ossa. La natura critica per il tempo del trasferimento della polvere in tubi per la pesatura è qualcosa che richiede pratica. Se viene preso troppo tempo, la polvere inizierà a scongelarsi e diventerà amorfa.È importante limitare il numero di campioni a 10 a 15 fino a quando non ci si trova a proprio agio con la procedura. Il giorno della lavorazione dei tessuti, prechill tutti gli strumenti necessari sul ghiaccio secco per un minimo di 10 minuti. Indossare guanti termici per evitare di essere danneggiati dal freddo estremo.Successivamente, trasferire ciascuna zampa di topo preparata in un tubo di microcentrifugo separato da 1,5 millilitri e scattare immediatamente il congelamento in azoto liquido. Conservare le zampe congelate a -80 gradi Celsius. Quando è pronto per continuare, riempire un congelatore con azoto liquido e lasciarlo equilibrare per almeno 10 minuti.Posizionare il campione non lavorato sul ghiaccio secco e tenerlo lì per evitare cicli di congelamento / disgelo. Quindi trasferire una zampa posteriore in una fiala di macinazione in policarbonato di grandi dimensioni pre-refrigerata con un tappo in acciaio inferiore. Inserire il tappo in acciaio prerimortato e chiudere il flaconcino di rettifica in policarbonato con il tappo in acciaio superiore prerimortato.Trasferire le grandi fiale di rettifica in policarbonato con i campioni nel congelatore precompilato e chiudere il coperchio con la chiusura in gomma trovata nella parte anteriore dello strumento. Lasciare raffreddare i campioni nell'azoto liquido per un minuto. Quindi, impostare il congelatore sul programma di un minuto con 10 cicli al secondo.Premere il pulsante esegui e attendere che il congelatore completi il ciclo. Successivamente, aprire il coperchio del congelatore ed esegnare il grande flaconcino di macinazione in policarbonato. Posizionare il flaconcino di rettifica in un estrattore e rimuovere il tappo superiore in acciaio posizionando la pressione verso il basso sulla maniglia nera fino a quando il tappo d'acciaio non scivola fuori dal tubo di policarbonato.Trasferire il flaconcino di macinazione aperto sul ghiaccio secco e utilizzare forcette pre-refrigerate per rimuovere il riflettore in acciaio. Trasferire la polvere congelata in un tubo conico pre-refrigerato da 50 millilitri. Pesare tra i 30 e i 50 milligrammi della polvere congelata in un tubo di microcentrifugo a più livelli da 1,5 millilitri per l'estrazione dell'RNA e tra 100 e 200 milligrammi per l'estrazione di proteine.Conservare i campioni polverizzati a -80 gradi Celsius e procedere agli isolamenti di RNA e proteine entro 24 ore. In primo luogo, aggiungere 10 microlitri di beta-mercaptoetanolo per ogni millilitro di tampone RLT. Calcolare il volume del tampone RLT corrispondente a un rapporto di 23,3 millilitri per milligrammo di tessuto e aggiungere il volume appropriato di tampone RLT con beta-mercaptoetanolo al tubo con polvere congelata.Vortice il campione a 3.000 giri/min per 10 secondi. Utilizzare un pipetter da un millilitro per pipettare vigorosamente su e giù 10 volte e vorticere nuovamente il campione a 3.000 giri/min per 20 secondi. Centrifugare a 13.000 volte g per due minuti e trasferire 700 microlitri del supernatante in un tubo fresco.Aggiungere 700 microlitri di 70%etanolo a questo tubo e caricare 700 microlitri del campione su una colonna di purificazione dell'RNA. Centrifugare il tubo ad una velocità di almeno 10.000 volte g per 30 secondi. Scartare il flusso e caricare la parte rimanente del campione sulla colonna RNeasy e centrifugare nuovamente il tubo ad una velocità di almeno 10.000 volte g per 30 secondi.Scartare il flusso e lavare la colonna aggiungendo 700 microlitri di tampone RW1 e centrifugando almeno la velocità di 10.000 volte g per 30 secondi. Se si esegue la digestione DNAsi a opzione, 350 microlitri di RW1 vengono aggiunti prima del trattamento con DNAsi. E dopo il trattamento con DNAsi, vengono aggiunti altri 350 microlitri di RW1.Quindi lavare la colonna due volte aggiungendo 500 microlitri di tampone RPE e centrifuga ad una velocità di almeno 10.000 volte g per 30 secondi assicurandosi di scartare il flusso ogni volta. Successivamente, asciugare la colonna centrifugandola ad una velocità di almeno 10.000 volte g per due minuti. Elute l'RNA aggiungendo 50 microlitri di acqua e centrifugando ad una velocità di almeno 10.000 volte g per due minuti.Raccogliere il flusso e trasferirlo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Determinare la quantità di RNA utilizzando il metodo di scelta del ricercatore e memorizzare a -80 gradi Celsius prima di ulteriori analisi. Diluire la soluzione stock di lysis cellulare 10X alla soluzione stock di lysis cellulare 1X con acqua di coltura cellulare.Ricostituire il cocktail inibitore della proteasi impostato uno con un millilitro di acqua per fare un stock di inibitore della proteasi 100X. Aggiungere 100 millilitri di inibitore della proteasi a 9,9 millilitri di tampone di llisi cellulare 1X per ottenere una soluzione di stock finale 1X. Aggiungere quattro microlitri di tampone di lysis a celle fredde ghiacciate per ogni milligrammo di polvere di tessuto e aggiungere un tallone di acciaio inossidabile di cinque millimetri al tubo.Vortice il tubo a 3.000 giri/min per 60 secondi. Trasferire il tubo sul ghiaccio bagnato e continuare al campione successivo. Inoltre, i ricercatori possono scoprire che posizionare la scatola verticale può facilitare una migliore miscelazione con il tallone.Dopo un'ora, centrifuga i tubi a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire i supernatanti in un tubo fresco assicurandosi di evitare lo strato di grasso sulla parte superiore. Determinare la concentrazione totale di proteine.Aliquota ogni campione in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri e conservali a -80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per eseguire ulteriori analisi. In questo studio, un metodo di polverizzazione criogenica viene utilizzato per elaborare le zampe murine al fine di migliorare la resa e la qualità dell'RNA o della proteina estratta dai tessuti e consentire l'analisi dei profili molecolari associati alle risposte infiammatorie. Una visualizzazione rappresentativa dell'immagine in gel mostra l'RNA estratto dalle zampe anteriori dei topi della CIA.L'rRNA 28S e le bande di rRNA 18S indicano che tutti i campioni hanno una quantità sufficiente di RNA intatto. Qui viene mostrato un grafico rappresentativo della dispersione delle concentrazioni proteiche totali sulla base dell'analisi BCA delle proteine. Le concentrazioni totali di proteine da topi ingenui, topi della CIA o topi della CIA sotto vari trattamenti sono comparabili tra i gruppi.Le analisi luminex vengono quindi condotte per determinare le concentrazioni di citochine infiammatorie e chemiochine nell'estratto proteico. Un grafico rappresentativo delle concentrazioni di citochine e chemiochine normalizzate rivela che rispetto ai topi ingenui, diverse citochine sono elevate nei topi della CIA e il trattamento con anticorpo anti-IL17A inibisce significativamente la produzione di diverse citochine. L'analisi microarray viene eseguita per valutare i cambiamenti del trascritoma nella CIA e gli effetti correlati al trattamento.Qui viene mostrato un grafico rappresentativo della mappa termica dei geni significativamente aumentato nei topi della CIA rispetto ai topi ingenui. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale per i ricercatori ridurre al minimo il tempo in cui il tubo e la polvere sono tenuti fuori dal ghiaccio secco. Questo aiuta a prevenire lo scongelamento della polvere e i conseguenti problemi all'RNA degradato e alle proteine.L'alta qualità delle firme molecolari generate da questa tecnica consente ai ricercatori di interrogare il profilo unico che una terapia impartirà e consente ulteriormente la differenziazione dei meccanismi che possono essere utilizzati per trattare le condizioni artritiche. Questa tecnica potrebbe essere utilizzata per estrarre un certo numero di tessuti densi come orecchie e ossa per valutare ulteriormente le firme molecolari in questi tessuti di interesse. Comprendere come le terapie modulano le firme molecolari della malattia ci consente di valutare meglio quali percorsi di segnalazione specifici sono modulati.E forse ancora più importante, quali percorsi non sono regolati con il meccanismo terapeutico in fase di valutazione. Quando si lavora con azoto liquido e ghiaccio secco, è imperativo utilizzare dispositivi di protezione individuale tra cui guanti adeguatamente classificati e scudi facciali. L'esposizione della pelle per più di alcuni secondi può causare gravi ustioni.Quando si lavora con grandi quantità di ghiaccio secco, è importante lavorare in un'area ben ventilata poiché il ghiaccio secco rilascia anidride carbonica.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra una terapia cellulare per l'artrite autoimmune nei topi. Le cellule T regolatorie derivate da iPSC che esprimono recettori specifici per l'ovoalbumina vengono iniettate con albumina sierica bovina metilata (mBSA) emulsionata in un adiuvante. Le cellule presentanti l'antigene (APC) murino elaborano e presentano l'mBSA alle cellule T, provocando l'attivazione e la migrazione delle cellule T verso la membrana sinoviale dell'articolazione del ginocchio. Le iniezioni successive...

Una terapia cellulare per l'artrite autoimmune in un modello murino

Abbiamo sviluppato una misura evocata dolore di artrite e abbinato un metodo standardizzato per misurare il dolore spontaneo nei diversi modelli murini di artrite indotta chimicamente. Queste misure sono sensibili e riproducibili per diversi tipi di dolori articolari.

Spontanee ed evocate misure di dolore in modelli murini di dolore del ginocchio Monoarticular

Qui, presentiamo tre metodi per valutare la migrazione e l'infiltrazione dei neutrofili sia in vivo che in vitro. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire promettenti terapie mirate alla migrazione dei neutrofili.

Rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione dei neutrofili nei topi

Il presente protocollo descrive i graffi controllati della microlama sulla superficie della cartilagine articolare dopo aver destabilizzato il ginocchio del topo tagliando il legamento miniscotibiale mediale. Questo modello animale presenta una forma accelerata di osteoartrite (OA) adatta allo studio della formazione di osteofiti, dell'osteosclerosi e del dolore in fase iniziale.

Destabilizzazione del menisco mediale e del modello murino di graffio cartilagineo di osteoartrite accelerata

Il presente studio fornisce un protocollo modificato per isolare i macrofagi sinoviali e i fibroblasti dal tessuto dell'artrite infiammatoria murina.

Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina

Presentiamo un protocollo per la manipolazione del Tuina eseguito su ratti affetti da osteoartrite del ginocchio indotta da gesso. Sulla base dei risultati preliminari, ha suggerito che l'efficacia del metodo si basava sulla riduzione dell'infiammazione e della perdita di cartilagine.

Manipolazione del tuina per ridurre l'infiammazione e la perdita di cartilagine nei ratti affetti da osteoartrite del ginocchio

Lo studio dimostra il ruolo della pelle nella modulazione delle risposte immunitarie nei topi attraverso l'immunizzazione epicutanea (EC). L'immunizzazione EC con un antigene proteico può sopprimere le risposte immunitarie nell'ipersensibilità da contatto o invertire la soppressione indotta dalla pelle se combinata con modelli molecolari associati a patogeni. L'immunizzazione EC si dimostra promettente come approccio efficace e senza ago all'immunoterapia.

Modello murino di immunomodulazione indotta per via epicutanea

L'imaging in vivo delle articolazioni è una tecnica preziosa per scoprire il comportamento migratorio dei leucociti e la dinamica molecolare all'interno delle articolazioni infiammate. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'imaging in vivo delle articolazioni utilizzando un modello murino di artrite indotta dal collagene di tipo II (CIA).

In vivo L'imaging rivela il comportamento migratorio dei leucociti all'interno delle articolazioni

Qui, riportiamo un protocollo che stabilisce un modello murino di artrite reumatoide (RA) attraverso il trasferimento adottivo di cellule T CD4+ da topi SKG, fornendo uno strumento sperimentale rapido e affidabile per studiare i meccanismi immunologici, la progressione patologica e lo sviluppo di nuovi trattamenti per l'artrite reumatoide.

Un modello di trasferimento adottivo dell'artrite reumatoide nei topi

Cellule M specializzato in un follicolo-associato epitelio che copre le placche di Peyer svolgono un ruolo importante per la immunosorveglianza mucosa intestinale in tessuto linfoide associato. Qui abbiamo descritto il metodo di valutazione per transcitosi batterica da parte delle cellule...

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

Impara un metodo di criopulverizzazione per elaborare zampe di topo e migliorare l'estrazione di RNA e proteine di alta qualità. Questa tecnica consente l'analisi dei profili molecolari associati alle risposte infiammatorie nell'artrite.

Un protocollo di criopulverizzazione per lelaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene (Video) | JoVE Journal

Un protocollo di criopulverizzazione per l'elaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene

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