Un protocollo di criopulverizzazione per l'elaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene

La valutazione dei profili molecolari nei tessuti locali è un passo fondamentale per comprendere il meccanismo d'azione dei farmaci attivi in quanto vengono valutati in modelli preclinici rilevanti per la malattia. Nel campo della ricerca sull'artrite, l'ambiente tissutale locale di interesse sono le piccole articolazioni portanti di peso che sono composte da una complessa miscela di ossa, cartilagine, muscoli e cellule immunitarie. Qui descriviamo un metodo affidabile e robusto per l'interruzione meccanica e/o la polverizzazione di questo complesso ambiente tissutale in un ambiente criogenicamente controllato.

Questo metodo può quindi essere utilizzato per generare sforzi di profilazione proteomica e trascrizionale a valle per stabilire firme molecolari della malattia da un'unica fonte di campione uniforme. Questo metodo genera una polvere omogenea a differenza di molte altre vecchie tecniche. Inoltre, la vecchia procedura di isolamento della temperatura consente l'isolamento dell'RNA di alta qualità.

Questo metodo può quindi essere utilizzato per generare un profilo proteomico e trascrizionale a valle che consenta la caratterizzazione molecolare delle vie di interesse della malattia pertinenti. Questo metodo può fornire approfondimenti a qualsiasi campo di ricerca che deriva firme molecolari dai tessuti. Il metodo potrebbe essere esteso a qualsiasi sistema tissutale complesso che abbia costituenti densi e difficili da dissociare.

Anche se non abbiamo valutato fino a questo punto, potremmo vedere una potenziale applicazione a tessuti cartilaginei densi come orecchie o ossa. La natura critica per il tempo del trasferimento della polvere in tubi per la pesatura è qualcosa che richiede pratica. Se viene preso troppo tempo, la polvere inizierà a scongelarsi e diventerà amorfa.

È importante limitare il numero di campioni a 10 a 15 fino a quando non ci si trova a proprio agio con la procedura. Il giorno della lavorazione dei tessuti, prechill tutti gli strumenti necessari sul ghiaccio secco per un minimo di 10 minuti. Indossare guanti termici per evitare di essere danneggiati dal freddo estremo.

Successivamente, trasferire ciascuna zampa di topo preparata in un tubo di microcentrifugo separato da 1,5 millilitri e scattare immediatamente il congelamento in azoto liquido. Conservare le zampe congelate a -80 gradi Celsius. Quando è pronto per continuare, riempire un congelatore con azoto liquido e lasciarlo equilibrare per almeno 10 minuti.

Posizionare il campione non lavorato sul ghiaccio secco e tenerlo lì per evitare cicli di congelamento / disgelo. Quindi trasferire una zampa posteriore in una fiala di macinazione in policarbonato di grandi dimensioni pre-refrigerata con un tappo in acciaio inferiore. Inserire il tappo in acciaio prerimortato e chiudere il flaconcino di rettifica in policarbonato con il tappo in acciaio superiore prerimortato.

Trasferire le grandi fiale di rettifica in policarbonato con i campioni nel congelatore precompilato e chiudere il coperchio con la chiusura in gomma trovata nella parte anteriore dello strumento. Lasciare raffreddare i campioni nell'azoto liquido per un minuto. Quindi, impostare il congelatore sul programma di un minuto con 10 cicli al secondo.

Premere il pulsante esegui e attendere che il congelatore completi il ciclo. Successivamente, aprire il coperchio del congelatore ed esegnare il grande flaconcino di macinazione in policarbonato. Posizionare il flaconcino di rettifica in un estrattore e rimuovere il tappo superiore in acciaio posizionando la pressione verso il basso sulla maniglia nera fino a quando il tappo d'acciaio non scivola fuori dal tubo di policarbonato.

Trasferire il flaconcino di macinazione aperto sul ghiaccio secco e utilizzare forcette pre-refrigerate per rimuovere il riflettore in acciaio. Trasferire la polvere congelata in un tubo conico pre-refrigerato da 50 millilitri. Pesare tra i 30 e i 50 milligrammi della polvere congelata in un tubo di microcentrifugo a più livelli da 1,5 millilitri per l'estrazione dell'RNA e tra 100 e 200 milligrammi per l'estrazione di proteine.

Conservare i campioni polverizzati a -80 gradi Celsius e procedere agli isolamenti di RNA e proteine entro 24 ore. In primo luogo, aggiungere 10 microlitri di beta-mercaptoetanolo per ogni millilitro di tampone RLT. Calcolare il volume del tampone RLT corrispondente a un rapporto di 23,3 millilitri per milligrammo di tessuto e aggiungere il volume appropriato di tampone RLT con beta-mercaptoetanolo al tubo con polvere congelata.

Vortice il campione a 3.000 giri/min per 10 secondi. Utilizzare un pipetter da un millilitro per pipettare vigorosamente su e giù 10 volte e vorticere nuovamente il campione a 3.000 giri/min per 20 secondi. Centrifugare a 13.000 volte g per due minuti e trasferire 700 microlitri del supernatante in un tubo fresco.

Aggiungere 700 microlitri di 70%etanolo a questo tubo e caricare 700 microlitri del campione su una colonna di purificazione dell'RNA. Centrifugare il tubo ad una velocità di almeno 10.000 volte g per 30 secondi. Scartare il flusso e caricare la parte rimanente del campione sulla colonna RNeasy e centrifugare nuovamente il tubo ad una velocità di almeno 10.000 volte g per 30 secondi.

Scartare il flusso e lavare la colonna aggiungendo 700 microlitri di tampone RW1 e centrifugando almeno la velocità di 10.000 volte g per 30 secondi. Se si esegue la digestione DNAsi a opzione, 350 microlitri di RW1 vengono aggiunti prima del trattamento con DNAsi. E dopo il trattamento con DNAsi, vengono aggiunti altri 350 microlitri di RW1.

Quindi lavare la colonna due volte aggiungendo 500 microlitri di tampone RPE e centrifuga ad una velocità di almeno 10.000 volte g per 30 secondi assicurandosi di scartare il flusso ogni volta. Successivamente, asciugare la colonna centrifugandola ad una velocità di almeno 10.000 volte g per due minuti. Elute l'RNA aggiungendo 50 microlitri di acqua e centrifugando ad una velocità di almeno 10.000 volte g per due minuti.

Raccogliere il flusso e trasferirlo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Determinare la quantità di RNA utilizzando il metodo di scelta del ricercatore e memorizzare a -80 gradi Celsius prima di ulteriori analisi. Diluire la soluzione stock di lysis cellulare 10X alla soluzione stock di lysis cellulare 1X con acqua di coltura cellulare.

Ricostituire il cocktail inibitore della proteasi impostato uno con un millilitro di acqua per fare un stock di inibitore della proteasi 100X. Aggiungere 100 millilitri di inibitore della proteasi a 9,9 millilitri di tampone di llisi cellulare 1X per ottenere una soluzione di stock finale 1X. Aggiungere quattro microlitri di tampone di lysis a celle fredde ghiacciate per ogni milligrammo di polvere di tessuto e aggiungere un tallone di acciaio inossidabile di cinque millimetri al tubo.

Vortice il tubo a 3.000 giri/min per 60 secondi. Trasferire il tubo sul ghiaccio bagnato e continuare al campione successivo. Inoltre, i ricercatori possono scoprire che posizionare la scatola verticale può facilitare una migliore miscelazione con il tallone.

Dopo un'ora, centrifuga i tubi a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire i supernatanti in un tubo fresco assicurandosi di evitare lo strato di grasso sulla parte superiore. Determinare la concentrazione totale di proteine.

Aliquota ogni campione in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri e conservali a -80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per eseguire ulteriori analisi. In questo studio, un metodo di polverizzazione criogenica viene utilizzato per elaborare le zampe murine al fine di migliorare la resa e la qualità dell'RNA o della proteina estratta dai tessuti e consentire l'analisi dei profili molecolari associati alle risposte infiammatorie. Una visualizzazione rappresentativa dell'immagine in gel mostra l'RNA estratto dalle zampe anteriori dei topi della CIA.

L'rRNA 28S e le bande di rRNA 18S indicano che tutti i campioni hanno una quantità sufficiente di RNA intatto. Qui viene mostrato un grafico rappresentativo della dispersione delle concentrazioni proteiche totali sulla base dell'analisi BCA delle proteine. Le concentrazioni totali di proteine da topi ingenui, topi della CIA o topi della CIA sotto vari trattamenti sono comparabili tra i gruppi.

Le analisi luminex vengono quindi condotte per determinare le concentrazioni di citochine infiammatorie e chemiochine nell'estratto proteico. Un grafico rappresentativo delle concentrazioni di citochine e chemiochine normalizzate rivela che rispetto ai topi ingenui, diverse citochine sono elevate nei topi della CIA e il trattamento con anticorpo anti-IL17A inibisce significativamente la produzione di diverse citochine. L'analisi microarray viene eseguita per valutare i cambiamenti del trascritoma nella CIA e gli effetti correlati al trattamento.

Qui viene mostrato un grafico rappresentativo della mappa termica dei geni significativamente aumentato nei topi della CIA rispetto ai topi ingenui. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale per i ricercatori ridurre al minimo il tempo in cui il tubo e la polvere sono tenuti fuori dal ghiaccio secco. Questo aiuta a prevenire lo scongelamento della polvere e i conseguenti problemi all'RNA degradato e alle proteine.

L'alta qualità delle firme molecolari generate da questa tecnica consente ai ricercatori di interrogare il profilo unico che una terapia impartirà e consente ulteriormente la differenziazione dei meccanismi che possono essere utilizzati per trattare le condizioni artritiche. Questa tecnica potrebbe essere utilizzata per estrarre un certo numero di tessuti densi come orecchie e ossa per valutare ulteriormente le firme molecolari in questi tessuti di interesse. Comprendere come le terapie modulano le firme molecolari della malattia ci consente di valutare meglio quali percorsi di segnalazione specifici sono modulati.

E forse ancora più importante, quali percorsi non sono regolati con il meccanismo terapeutico in fase di valutazione. Quando si lavora con azoto liquido e ghiaccio secco, è imperativo utilizzare dispositivi di protezione individuale tra cui guanti adeguatamente classificati e scudi facciali. L'esposizione della pelle per più di alcuni secondi può causare gravi ustioni.

Quando si lavora con grandi quantità di ghiaccio secco, è importante lavorare in un'area ben ventilata poiché il ghiaccio secco rilascia anidride carbonica.