Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti
August 28th, 2019
Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.
Il nostro protocollo può essere utilizzato per indagare la motilità e la localizzazione di organelli astrocitici o proteine sotto ambienti extracellulari controllati e stati di malattia lieve. A differenza dei preparati fissi MHA, che forniscono singole istantanee di localizzazione di proteine e organelli, la nostra tecnica di imaging dal vivo può essere utilizzata per analizzare la dinamica delle particelle nei singoli astrociti vivi. Il giorno prima del seme di trasfezione astrociti alla densità appropriata per l'imaging a 24-48 ore dopo la trasfezione.
Diluire il reagente di lipofezione in mezzo siero ridotto alla concentrazione sperimentale appropriata. Diluire cinque microgrammi di DNA ad alta purezza in 250 microlitri di mezzo siero ridotto e aggiungere cinque microlitri di reagente esaltatore di lipofezione al tubo. Mescolare il reagente lipofection con un volume uguale del mix di esaltatore lipofezione del DNA e incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente.
Alla fine dell'incubazione, rimuovere il supernatante dalla coltura di astrociti e aggiungere 100 microlitri della miscela di trasfezione dropwise alle cellule. Dopo sei ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, sostituire il complesso di trasfezione con un volume appropriato di terreno di coltura di astrociti e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare per ulteriori 24-72 ore. 30 minuti prima dell'imaging, diluire una sonda di etichettatura lisosomiale adatta in 200 microlitri di mezzo di coltura di astrociti a una concentrazione di lavoro di un micromolare ed etichettare gli astrociti con una sonda per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi lavare le cellule una volta con un mezzo di coltura di astrociti caldi e sostituire il lavaggio con un mezzo di imaging. Subito dopo l'etichettatura della sonda, posizionare il contenitore di coltura degli astrociti nell'adattatore appropriato sullo stadio del microscopio e utilizzando la luce a fluorescenza EBI, individuare le cellule che esprimono proteine fluorescenti o sonda. Utilizzare la fotocamera digitale per regolare l'illuminazione del campione fluorescente per visualizzare le celle selezionate e regolare la messa a fuoco e ingrandire una singola cella.
Quindi utilizzare le funzioni Zoom e Messa a fuoco definita per acquisire una singola serie time-lapse Z-stack con una frequenza di un fotogramma ogni due secondi per intervalli di tempo compresi tra 300 e 500 secondi. Salvare ed esportare le immagini time-lapse come file dello stack AVI o TIFF. Per analizzare le immagini time-lapse, aprite la sequenza di immagini time-lapse in ImageJ o Fiji e usate lo strumento Canale diviso per dividere i canali.
Nell'immagine del canale verde a otto bit, usate lo strumento Linea segmentata per tracciare una linea lungo le traiettorie delle particelle usando la stessa convenzione direzionale desiderata per tutti i filmati in modo che la polarità sia coerente all'interno e attraverso tutte le celle studiate. Fare doppio clic sull'utensile Linea per regolare la larghezza della linea in base allo spessore della traccia ed eseguire la macro Draw Kymo del plug-in Kymo ToolBox utilizzando una larghezza della linea di 10. Verrà visualizzata una richiesta di calibrazione dell'immagine nel tempo e nello spazio.
Una volta calibrati, i cimografi verranno generati e possono essere salvati come file TIFF. Per assegnare traiettorie di particelle, usate lo strumento Linea segmentata (Segmented Line) per tracciare manualmente ogni particella nel kymografo per l'intera durata dell'acquisizione e utilizzate il gestore del ROI per registrare ogni traiettoria di particelle come regione di interesse. Salva tutte le regioni di interesse per ogni video time-lapse per ulteriori analisi ed esegui la macro Analyze Kymo del plug-in Kymo ToolBox.
Si aprirà una finestra che chiede di definire la direzione verso l'esterno del movimento delle particelle dal nucleo della cella di interesse dal menu a discesa. La velocità limite deve essere definita in base alla sensibilità del software per ogni carico di interesse e la larghezza della linea deve essere regolata in base allo spessore di ciascuna traiettoria delle particelle. Log All Data e Log Extrapolated Coordinates devono essere per il calcolo dei vari parametri di trasporto merci.
Fare clic su Ok. I dati calcolati per le singole tracce verranno quindi raggruppati per kymograph e salvati in file di testo specifici di ogni immagine. La combinazione del trattamento della citosina arabinoside con la strategia di purificazione basata sullo scuotimento arricchisce la purezza delle colture di astrociti rispetto ai protocolli tradizionali che includono solo la fase di purificazione.
La trasfezione a base di lipofezione consente l'espressione transitoria delle proteine a livelli ottimali per l'imaging di cellule vive senza causare tossicità o influire sulla vitalità degli astrociti. Allo stesso modo, l'uso di una sonda fluorescente consente l'etichettatura rapida ed efficiente di organelli endolisosomiali acidi per il tracciamento della dinamica degli organelli e degli astrociti. I dati time-lapse dell'imaging possono essere utilizzati per generare cimografi che tracciano il movimento del carico nel tempo e nello spazio.
In questi cimografi, il movimento anterogrado del carico indicato è rappresentato da traiettorie con pendenze negative, mentre il movimento retrogrado è rappresentato da traiettorie con pendenze positive. Le vescicole stazionarie appaiono come traiettorie verticali. In questa analisi, la quantificazione del flusso di un carico specifico attraverso un'area dell'astrocita ha rivelato differenze nella percentuale di particelle modali tra i carichi che sono probabilmente rappresentative della loro normale motilità della linea di base nella regione dell'astrocita all'interno della quale sono stati acquisiti i film.
La mappatura precisa del cambiamento nella posizione X, Y lungo la scala di tempo completa per ogni particella ottenuta dal cimografo può anche essere usata per valutare altri parametri di movimento, come la velocità di carico e la lunghezza di corsa. Poiché questo protocollo richiede colture di astrociti di alta qualità ed efficiente etichettatura del carico, il tempo di incubazione del reagente di trasfezione e la tempistica di acquisizione dovrebbero essere regolati per ogni plasmide o carico di interesse. Questo protocollo può essere modificato per caratterizzare gli eventi di trasporto negli astrociti in risposta a danni cellulari, tossicità, mutazioni patogene, attività sinaptica o cambiamenti nell'ambiente intra o extracellulare.
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Panoramica
Questo articolo presenta una tecnica di imaging in vivo in vitro progettata per visualizzare il trasporto intracellulare degli organelli e il traffico delle proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. La metodologia consente un'analisi dettagliata della dinamica delle particelle in colture astrocitarie vive in varie condizioni, compresi gli stati patologici.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Imaging di cellule vive
Sfondo
- Gli astrociti svolgono un ruolo cruciale nel sistema nervoso centrale e i loro meccanismi di trasporto intracellulare sono essenziali da comprendere.
- I metodi tradizionali, come le preparazioni fisse MHA, forniscono istantanee limitate della localizzazione delle proteine.
- Le tecniche di imaging in vivo consentono l'osservazione di dinamiche in tempo reale, arricchendo la nostra comprensione della funzione astrocitica.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo per analizzare la motilità e la localizzazione degli organelli e delle proteine negli astrociti.
- Stabilire una metodologia per studiare gli itinerari e la cinetica del trasporto di carichi.
- Valutare gli effetti di varie condizioni sulla dinamica del trasporto intracellulare.
Metodi utilizzati
- Il protocollo utilizza l'imaging di cellule vive e la marcatura fluorescente per osservare la dinamica astrocitica.
- Gli astrociti murini vengono trasfettati con DNA mediante lipofezione, seguita da regimi di trattamento specifici prima dell'imaging.
- L'imaging cattura sequenze time-lapse, seguite dall'analisi mediante software per tracciare il trasporto dinamico e le traiettorie delle particelle.
- I passaggi chiave includono la marcatura lisosomiale, la preparazione del mezzo di imaging e l'analisi dei dati utilizzando il software ImageJ o Fiji.
Risultati principali
- La tecnica di imaging rivela distinte traiettorie di movimento del carico, differenziando tra trasporto anterogrado e retrogrado.
- La quantificazione indica variazioni nella motilità del carico e nei meccanismi di traffico all'interno degli ambienti astrocitari.
- I risultati contribuiscono alla comprensione di come le dinamiche degli organelli rispondono a stimoli fisiologici e patologici.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato facilita l'indagine sui processi di trasporto astrocitari, migliorando la comprensione del funzionamento neuronale.
- Comprendere la dinamica del trasporto negli astrociti potrebbe avere implicazioni per affrontare malattie neurodegenerative o risposte cellulari alle lesioni.
- Questo approccio innovativo di imaging fornisce una piattaforma per ulteriori ricerche sulla biologia degli astrociti e sui meccanismi di trasporto.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables real-time visualization and quantification of intracellular transport dynamics in astrocytes, a key glial cell type in CNS homeostasis. By providing kinetic and spatial data on organelle and protein trafficking, it supports mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease models. The approach enhances predictive confidence in preclinical screening by linking cargo motility to functional astrocyte states under controlled extracellular conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking organelle and protein motility in live astrocytes under disease-relevant conditions.
- Operational Value: Provides quantitative transport parameters such as velocity and run length to functionally validate targets involved in cytoskeletal regulation or membrane trafficking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible kymograph-based readouts for high-content screening of compounds affecting astrocytic transport.
- Operational Value: Supports assay scalability through use of widely available ImageJ/FIJI plugins and transient transfection for consistent cargo labeling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease modeling by capturing transport alterations in response to cytotoxic agents, synaptic activity, or pathogenic mutations.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cargo flux changes to inform risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional readouts that bridge molecular target engagement with cellular phenotypes in astrocytes, supporting lead identification through phenotypic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of targets regulating microtubule-dependent transport, organelle positioning, or membrane protein localization in astrocytes.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved outputs (e.g., kymographs, trajectory maps) that allow comparison of compound effects on anterograde and retrograde cargo movement.
- Analytics: Enables extraction of transport kinetics (velocity, run length, flux) to quantify phenotypic responses and prioritize hits based on mechanistic consistency.
- Translational Research: Connects in vitro findings to pathophysiological relevance by modeling transport deficits observed in injury or neurodegenerative contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, adaptable platform for studying diverse cargos (organelles, proteins) across multiple astrocyte models and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking genetic or pharmacological perturbations to observable changes in intracellular dynamics.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized imaging and analysis protocols, minimizing variability across laboratories and projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by identifying early-stage biological liabilities related to cytoskeletal dysfunction or trafficking defects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by providing functional biomarkers of astrocyte health that correlate with neuronal support capacity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, transfection, and live-cell confocal microscopy.
- Dependent on access to fluorescence microscopy systems with time-lapse capability and environmental control (37°C, 5% CO2).
- Necessitates standardization of transfection efficiency, labeling protocols, and image acquisition settings across users and sites.
- Adaptation to different cargos (e.g., mitochondria, lysosomes, membrane proteins) requires validation of labeling specificity and signal-to-noise ratios.
- Practical limitations include phototoxicity risks during prolonged imaging and the need for optimization of transfection timing for each DNA construct.
