Name: Analisi per lintegrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Impara a valutare l'integrità della barriera ematoencefalica in Drosophila melanogaster durante lo sviluppo embrionale e larvale. Questo metodo permette l'analisi in vivo della funzione della barriera.

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Gli autori ringraziano il Dr. F. Bryan Pickett e il Dr. Rodney Dale per l'uso di attrezzature per l'iniezione. Questo lavoro è stato finanziato da finanziamenti per la ricerca della Loyola University di Chicago a M.D., D.T., e J.J.

1. Raccolta di campioni
<ol><li>Raccolta di embrioni
	<ol><li>In ogni gabbia di raccolta embrionale, usa un minimo di 50 femmine vergini con 20-25 maschi per le collezioni. Incubare queste mosche in una bottiglia con cibo di farina di mais-agar (Tabella dei Materiali) per 1/2 giorni prima di iniziare le collezioni23. NOT:</</c2> È possibile utilizzare più mosche, ma il rapporto femminile-maschio deve essere mantenuto a 2:1.</li>
		<li>Piatti preriscaldati di succo di mela (Tabella 1) a 25 gradi durante la notte. NOT:</</c1> Ciò è necessario per una corretta messa in scena degli embrioni. Se le piastre si stanno asciugando rapidamente, aggiungere una ciotola con acqua all'incubatrice per aumentare l'umidità della camera.</li>
		<li>Anestesizza le mosche dal passo 1.1.1 con CO2 e trasferizza in una gabbia di raccolta. Mettere un piatto di agar di succo di mela preriscaldato con un piccolo striscio di pasta di lievito all'estremità aperta e fissarlo alla gabbia con la manica rossa (Tabella dei Materiali). Per eliminare gli embrioni più vecchi, consentire alle mosche di deporre embrioni/uova su un piatto di agar di succo di mela per 1 h a 25 gradi centigradi.</li>
		<li>Togliere la gabbia di raccolta dall'incubatrice. Invertire il lato della rete della gabbia verso il basso e toccare vola verso il basso fino alla parte inferiore della gabbia. Sostituire l'agar di succo di mela con un nuovo piatto di agar preriscaldato con un piccolo svasatura di pasta di lievito. Scartare il primo piatto.</li>
		<li>Lasciare che le mosche depongano gli embrioni/uova sul nuovo piatto di agar di succo di mela per 1 h a 25 gradi centigradi. Scartare questa piastra dopo la raccolta di 1 h e procedere alla fase successiva per raccogliere gli embrioni per l'iniezione.</li>
		<li>Per raccogliere i 17 embrioni della fase tardiva (20-21 h AEL), permettete alle mosche del genotipo desiderato dai passi 1.1.1.1.5 di posare su un nuovo piatto di agar preriscaldato con un piccolo striscio di pasta di lievito a 25 gradi centigradi per 1 h. Piastra di età per 19 h in un incubatore di 25 gradi centigradi , quindi gli embrioni avranno 20/21 h di età al momento dell'imaging. NOT:</</c0> Questo passaggio può essere ripetuto come desiderato per più cicli di raccolta del campione, iniezione e imaging.</li>
		<li>Raccogliere gli embrioni dalle piastre in un colino cellulare con una rete di nylon di 70 m aggiungendo una salina tamponata di fosfati (PBS) con 0,1% di surfactant nonionico (PBTx; Tabella 1) per coprire la superficie della piastra e allentare gli embrioni dalla superficie utilizzando un pennello.</li>
		<li>Embrioni dechorionati raccolti nel colino cellulare in una soluzione di candeggina al 50% (Tabella 1) in una piastra Petri da 100 mm per 5 min con agitazione occasionale a temperatura ambiente. Risciacquare gli embrioni 3x ruotando il colino cellulare in PBTx in un piatto Petri, utilizzando ogni volta un piatto fresco di PBTx.</li>
		<li>Se tutti gli embrioni sono del genotipo corretto, procedere direttamente al passaggio 1.1.10. Se la generazione di embrioni del genotipo corretto richiede una croce con mosche eterozigole, selezionare gli embrioni del genotipo corretto utilizzando la presenza o l'assenza di cromosomi bilanciatori marcati fluorescente. Utilizzare uno stereoscopio con capacità fluorescenti per la selezione del genotipo. NOT:</</c0> Cromosomi bilanciatori contrassegnati con proteina fluorescente deformata-gialla; Kruppel-Gal4, proteina fluorescente verde UAS (GFP); e torsione-Gal4, UAS-GFP funzionano bene per la selezione del genotipo nella tarda embriogenesi (Tabella 2)24,25,26.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire gli embrioni in PBTx a una lastra di gel di agarose del 2%(Tabella 1). Rimuovere il liquido in eccesso con carta da filtro. Allineare gli embrioni di 6-8 dollari sulla lastra di gel di agarose del 2% con il posteriore a destra e il lato dorsale rivolto verso l'alto (Figura 1B). NOT:</</c3> La micropirle, il piccolo foro attraverso il quale gli spermatozoi entrano nell'uovo, si trova all'estremità anteriore dell'embrione. L'estremità posteriore è più arrotondata. La trachea appare bianca e si trova dorsalmente nell'embrione, consentendo la distinzione dei lati dorsale e ventrale dell'embrione (Figura 1B).</li>
		<li>Preparare uno scivolo con un pezzo di nastro adesivo. Premere saldamente il vetrino sulla parte superiore degli embrioni per trasferirli sul nastro a due lati.</li>
		<li>Desiccate gli embrioni per incubazione a temperatura ambiente per 25 min (non viene utilizzato alcun disint). Dopo la disidratazione, coprire gli embrioni con olio di alocarbonio. NOT:</</c0> I periodi di desciccazione possono variare a seconda della temperatura, dell'umidità e della ventilazione nella stanza. Il periodo di incubazione deve essere utilizzato per impostare l'apparecchio per l'iniezione e il microscopio confocale per l'imaging, come descritto nelle sezioni 2 e 3 di questo protocollo.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta larva
	<ol>
<li>Impostare una croce con 5-10 mosche femmine vergini del genotipo desiderato e la metà di altrettanti maschi del genotipo desiderato in una fiala con cibo di farina di mais-agar e incubare a 25 c23.</li>
		<li>Dopo 5/7 giorni, a seconda del genotipo, raccogli le larve erranti della terza stella dalla fiala delicatamente con le pinze. Risciacquare le larve in 1x PBS per rimuovere il cibo attaccato alle larve. Trasferire le larve a un piatto di agar succo di mela per genotipine come descritto al punto 1.1.9 se necessario.</li>
		<li>Rotolare le larve su un tessuto utilizzando un pennello per asciugarli. Trasferisci le larve di 6-8 su uno scivolo preparato con nastro adesivo fronte/retro usando pinze.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione di aghi e iniezione di campioni
<ol><li>Estrarre gli aghi su un estotraine a micropipette prima dell'avvio di questo protocollo. Fissare i tubi capillari nell'aghieretto e tirare secondo la forma dell'ago standard e i parametri per le iniezioni di D. melanogaster (Tabella 3)27. Conservare gli aghi in un piatto Petri ancorando in argilla fino all'uso per l'iniezione.</li>
	<li>Caricare un ago con 5 10 kDa dextran coniugato al sulforhodamina 101 cloruro acido (Tabella dei materiali) utilizzando una punta di pipetta da 20 litri a carica gel durante il periodo di disidratazione di 25 minuti per gli embrioni (passaggio 1.1.12), o immediatamente dopo il trasferimento di larve alla diapositiva (passaggio 1.2.3).</li>
	<li>Caricare l'ago in un porta ago e la posizione in un micromanipolatore fissato a una base in acciaio (Tabella dei materiali). NOT:</</c5> L'ago deve essere quasi parallelo allo stadio del microscopio per l'iniezione di embrioni e inclinato leggermente verso il basso per le iniezioni larvali.</li>
	<li>Impostare l'apparato di iniezione (Tabella dei materiali) a 50 psi, 5,10 ms con un intervallo di 10. NOT:</</c7> Potrebbe essere necessario modificare queste impostazioni per il particolare apparato di iniezione utilizzato.</li>
	<li>Posizionare la diapositiva sul palco e il bordo del pennello dell'ago sul bordo del nastro a due lati ad un angolo di 45 gradi per creare una punta angolata e rotta. NOT:</</c8> Per gli embrioni è solo necessario rompere la punta abbastanza per consentire il flusso del 10 kDa dextran. Un ago perfetto ha una punta leggermente angolata e solo una piccola goccia di tinenza uscirà ad ogni iniezione. Per le larve, è necessario rompere la punta più, ma con una punta angolata per penetrare la parete del corpo larvale. Una goccia più grande di tine verrà fuori.</li>
	<li>Pompare il pedale del piede fino a quando il tinri è sulla punta dell'ago.</li>
	<li>Allineare l'ago in modo che sia parallelo con l'embrione o inclinato leggermente verso il basso verso la larva.</li>
	<li>Spostare l'ago per forare l'estremità posteriore del campione e iniettare il campione pompando il pedale del piede. Iniettare 2 nL di tintura negli embrioni e 220 nL di tinture nelle larve. NOT:</</c9> L'embrione o la larva deve inondare di tinrio se l'iniezione ha successo.</li>
	<li>Si noti il tempo di iniezione per scopi di incubazione. Incubare gli embrioni per 10 min a temperatura ambiente. Incubare le larve per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Continuare lungo il vetrino per iniettare campioni aggiuntivi, notando il tempo di iniezione per ogni campione. NOT:</</c10> A seconda della velocità con cui è possibile eseguire i passaggi di dissezione e di imaging successivi, è possibile iniettare alla volta campioni di 4,8 esemplari.</li>
</ol>3. Preparazione di campioni per l'imaging
<ol><li>
Imaging di embrioni
	<ol>
<li>Dopo l'iniezione, preparare gli embrioni per l'imaging. Applicare la gelatina di petrolio con un applicatore con punta di cotone sui lati destro e sinistro dei campioni sul vetrino come distanziale per evitare danni agli embrioni al momento del posizionamento del coperchio.</li>
		<li>Esempi di immagini che utilizzano un microscopio confocale per tutta la profondità dell'embrione con un obiettivo 20x. Calcolare la percentuale di campioni totali con tintura osservata nel cordone nervoso ventrale (VNC) utilizzando la seguente equazione: % di campioni con BBB compromessa - Numero di campioni con accumulo di tinture nel VNC/numero totale di campioni analizzati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissezione e imaging delle larve
	<ol>
<li>Preparare i vetrini per i campioni larvali in anticipo. Montare due coprilabbra distanziate di circa 0,5 cm l'una dall'altra fino allo scivolo con smalto. NOT:</</c4> I copricoperture funzionano come distanziali per il cervello, quindi non è danneggiato durante il processo di montaggio.</li>
		<li>Dopo l'incubazione di 30 min, sezionare le larve in 1x PBS direttamente sul vetrino che verrà utilizzato nell'imaging. In primo luogo, utilizzare una coppia di pinze per afferrare la larva a metà del corpo larvale e utilizzare una seconda coppia di pinze per separare le metà anteriori e posteriori della larva.</li>
		<li>Successivamente, utilizzare una coppia di pinze per afferrare la regione anteriore ai ganci della bocca e utilizzare una seconda coppia di pinze per invertire la parete del corpo sopra la punta delle pinze che afferrano i ganci della bocca. Il cervello e il VNC saranno esposti.</li>
		<li>Separare il cervello e il VNC dalla parete del corpo recidendo i nervi e rimuovere la parete del corpo dal vetrino (Figura 1C,D). Se lo si desidera, rimuovere i dischi immaginari.</li>
		<li>Coprire il campione con 10 luna dell'80% di glicerolo e posizionare un coperchio sopra il campione per l'imaging.</li>
		<li>Immagine attraverso la profondità del tessuto del sistema nervoso utilizzando un obiettivo 20x. Calcolare la percentuale di campioni totali con il tinrito osservato nel VNC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).</li>
<li>Hindle, S. J., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+mechanisms+in+the+Drosophila+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 414(2014).</li>
<li>Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+signaling+is+required+for+blood-brain+barrier+formation+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila.</a> Cell. 123 (1), 133-144 (2005).</li>
<li>Stork, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).</li>
<li>Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+of+glia+in+neural+development+links+tissue+growth+to+blood-brain+barrier+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity.</a> Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).</li>
<li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li>
<li>Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+cell+cycles+regulated+by+Notch+signaling+control+cell+size+and+ensure+a+functional+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier.</a> Development. 145 (3), dev157115(2018).</li>
<li>von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity%2C+origin%2C+and+migration+of+peripheral+glial+cells+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo.</a> Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).</li>
<li>Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtypes+of+glial+cells+in+the+Drosophila+embryonic+ventral+nerve+cord+as+related+to+lineage+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression.</a> Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).</li>
<li>Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexin+IV%2C+caspr+and+paranodin--novel+members+of+the+neurexin+family%3A+encounters+of+axons+and+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia.</a> Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).</li>
<li>Baumgartner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+neurexin+is+required+for+septate+junction+and+blood-nerve+barrier+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function.</a> Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).</li>
<li>Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+ensheathment+and+septate+junction+formation+in+the+peripheral+nervous+system+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).</li>
<li>Bhat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon-glia+interactions+and+the+domain+organization+of+myelinated+axons+requires+neurexin+IV%2FCaspr%2FParanodin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.</a> Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).</li>
<li>Faivre-Sarrailh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+contactin%2C+a+homolog+of+vertebrate+contactin%2C+is+required+for+septate+junction+organization+and+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function.</a> Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).</li>
<li>Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+domains+of+myelinated+axons+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system.</a> Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).</li>
<li>von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predetermined+embryonic+glial+cells+form+the+distinct+glial+sheaths+of+the+Drosophila+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system.</a> Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).</li>
<li>Matzat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+wrapping+in+the+Drosophila+PNS+is+controlled+by+glia-derived+neuregulin+homolog+Vein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein.</a> Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).</li>
<li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+blood-brain+barrier%3A+development+and+function+of+a+glial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365(2014).</li>
<li>Ho, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressional+Profiling+of+Carpet+Glia+in+the+Developing+Drosophila+Eye+Reveals+Its+Molecular+Signature+of+Morphology+Regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 244(2019).</li>
<li>DeSalvo, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+surface+glia+transcriptome%3A+evolutionary+conserved+blood-brain+barrier+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 346(2014).</li>
<li>BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2017).</li>
<li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+Drosophila+balancer+chromosomes+with+a+w-+dfd-GMR+yellow+fluorescent+protein+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker.</a> Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).</li>
<li>Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).</li>
<li>Halfon, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).</li>
<li>Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).</li>
<li>Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+raw+as+a+regulator+of+glial+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of raw as a regulator of glial development.</a> PLoS One. 13 (5), e0198161(2018).</li>
<li>Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+models+for+studying+the+blood-brain+and+blood-eye+barriers+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).</li>
<li>Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLove%2C+CR+%22Blood-Brain+Barrier%22">Blood-Brain Barrier</a>. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).</li>
<li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li>
<li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS%2FPNS+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038(2018).</li>
<li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo fornisce una descrizione completa dei passi necessari per testare l'integrità di BBB durante gli stadi larvali tardoembrionici e terzi instar dello sviluppo di D. melanogaster. Approcci simili sono stati descritti altrove per testare l'integrità della BBB durante lo sviluppo, così come nelle fasi adulte5,7,29,30. Tuttavia, le descrizioni delle procedure nelle sezioni ...

Durante lo sviluppo, la comunicazione cellulare-cellula e le interazioni sono fondamentali per la creazione della struttura e della funzione dei tessuti e degli organi. In alcuni casi, queste interazioni cellula-cellula sigillano gli organi dall'ambiente circostante per garantire la corretta funzione dell'organo. Questo è il caso del sistema nervoso, che è isolato dalla barriera emato-encefalica (BBB). La disfunzione della BBB nell'uomo è stata collegata a disturbi neurologici tra cui l'epilessia, e la rottura della barriera è stata osservata nelle malattie neurodegenerative tra cui la sclerosi multipla e la sclerosi laterale amiotrofica1. Nei mammiferi, la BBB è formata da strette giunzioni tra le cellule endoteliali2,3. Altri animali, tra cui la mosca della frutta, Drosophila melanogaster, hanno un BBB composto da cellule gliali. Queste cellule gliali formano una barriera selettivamente permeabile per controllare il movimento di sostanze nutritive, prodotti di scarto, tossine e grandi molecole dentro e fuori il sistema nervoso4. Ciò consente la manutenzione del gradiente elettrochimico necessario per sparare potenziali di azione, consentendo la mobilità e la coordinazione4. In D. melanogaster, la glia proteggere il sistema nervoso dal potassio-ricco, emolymph sangue-come5.
Nel sistema nervoso centrale (CNS) e nel sistema nervoso periferico (PNS) di D. melanogaster, due strati gliali esterni, la glia subperineuriale e la glia perineuriale, così come una rete esterna di matrice extracellulare, la lamella neurale, formano barriera emolymph-brain e emolymph-nerve6, indicata come BBB in tutto questo articolo. Durante lo sviluppo glia subperineurial diventano poliploidi e ingrandiscono per circondare il sistema nervoso5,6,7,8,9,10,11 . La glia subperineuriale forma giunzioni di septate, che forniscono la barriera di diffusione principale tra l'emolina e il sistema nervoso5,6,12. Queste giunzioni sono molecolarmente simili alle giunzioni simili a septate che si trovano nei paranodi della glia mielinata nei vertebrati, e svolgono la stessa funzione delle giunzioni strette nella BBB dei mammiferi13,14, 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17.La glia perineuriale si divide, cresce e avvolge la glia subperineuriale per regolare la diffusione di metaboliti e grandi molecole6,10,18,19. La formazione di BBB è completata da 18,5 h dopola deposizione delle uova (AEL) a 25 . Studi precedenti hanno identificato geni che sono regolatori critici della formazione di BBB20,21,22. Per comprendere meglio i ruoli esatti di questi geni, è importante esaminare l'effetto della mutazione di questi potenziali regolatori sull'integrità BBB. Mentre studi precedenti hanno delineato approcci per affermare l'integrità della BBB negli embrioni e nelle larve, un protocollo completo per questo test deve ancora essere descritto5,7. Questo protocollo passo-passo descrive i metodi per il test di integrità BBB durante gli stadi della larva embrionale e terza nella stella di D. melanogaster.

<table><tbody><tr><td>10 kDa sulforhodamine 101 cloruro acido (Texas Red) destrano</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1863</td><td>Il destrano deve essere diluito in ddH2O autoclavato a una concentrazione di 25 mg/mL.</td></tr><tr><td>20 &mu; L Puntali per pipette con caricamento di gel</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolo (200 proof)</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>11000200</td><td></td></tr><tr><td>Lievito secco attivo</td> Red <td>Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Compressore d'aria</td><td>DeWalt</td><td>D55140</td><td></td></tr><tr><td>Succo di mela</td><td>Candeggina naturale di succo di mela</td><td></td><td></td>di Mott</tr><tr><td>Candeggina</td><td></td><td>per uso domestico</td><td>1-5%</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td> di ipoclorito <td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per bottiglie Fisher</td><td>Scientific</td><td>AS-277</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>Campioni ripresi utilizzando l'obiettivo 20x (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td></tr><tr><td>Applicatore con punta in cotone</td><td>Puritan</td><td>19-062614</td><td></td></tr><tr><td>Nastro biadesivo 1/2"</td> <td>Pinzetta Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont; Modello #5; .05 x .01 mm Punta</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglie per alimenti per mosche</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fiale per alimenti per mosche</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Pedale</td><td>Treadlite II</td><td>T-91-S</td><td></td></tr><tr><td>Ruote in gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1704422</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio per gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1704436</td><td></td></tr><tr><td>vetro Pipetta</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr>Zucchero <td></td><td></td><td>semolato</td><td>Acquistato al supermercato.</td></tr><tr><td>Halocarbon Oil</td><td>Lab Scientific, Inc.</td><td>FLY-7000</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa</td><td>Schott</td><td>Ace I</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore Stand</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>World Precision Instruments</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Porta ago World</td><td>Precision Instruments</td><td>MPH310</td><td></td></tr><tr><td>Set di filtri Nightsea Microscopia</td><td>elettronica Scienza</td><td>SFA-LFS-CY</td><td>Per la visualizzazione del sistema di adattatori completo YFP</td></tr><tr><td>Nightsea con testa di luce di colore blu reale</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienza SFA-RB</td><td>Per la visualizzazione del</td></tr><tr><td>pennello</td> GFP <td>Simply Simmons</td><td>Chisel Blender #6</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>Pompa pneumatica</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Questo è anche indicato come microiniettore o regolatore di pressione. Poiché il modello utilizzato nel nostro studio non è più disponibile, questa è un'alternativa.</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Gabbie per la raccolta di piccoli embrioni</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di base in acciaio</td><td>World Precision Instruments</td><td>5052</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Utilizzato per la dissezione dei tessuti.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio con sorgente di luce trasmessa</td><td>Baytronix</td><td></td><td>Utilizzato per iniezioni.</td></tr><tr><td>Tegosept (acido p-idrossibenzoico, estere metilico)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>Tensioattivo non ionico</td></tr><tr><td>Tappi per fiale Fisher</td><td>Scientific</td><td>AS-273</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Un corretto sviluppo del sistema nervoso include la formazione della barriera emato-encefalica, la barriera di diffusione che regola strettamente l'accesso al sistema nervoso e protegge il tessuto neurale dalle tossine e dagli agenti patogeni. I difetti nella formazione di questa barriera sono stati correlati con le neuropatie, e la ripartizione di questa barriera è stata osservata in molte malattie neurodegenerative. Pertanto, è fondamentale identificare i geni che regolano la formazione e il mantenimento della barriera emato-encefalica per identificare potenziali bersagli terapeutici. Per comprendere i ruoli esatti che questi geni svolgono nello sviluppo neurale, è necessario testare gli effetti dell'espressione genica alterata sull'integrità della barriera emato-encefalica. Molte delle molecole che funzionano nella creazione della barriera emato-encefalica sono state trovate per essere conservate attraverso le specie eucariotiche, tra cui la mosca della frutta, Drosophila melanogaster. I moscerini della frutta hanno dimostrato di essere un ottimo sistema modello per esaminare i meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso. Questo protocollo descrive una procedura passo-passo per testare l'integrità della barriera emato-encefalica durante le fasi embrionali e larve dello sviluppo di D. melanogaster.

I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dell'integrità della BBB in tutto il CNS in embrioni e larve di D. melanogaster (Figura 1). Al termine della formazione di BBB nella tarda embriogenesi, il BBB funziona per escludere grandi molecole dal cervello e VNC5. Questo protocollo sfrutta questa funzione per affermare la formazione di BBB. Quando furono iniettati embrioni di tipo selvaggio (Oregon R) in fase avanzata 17 (20-21 h- ) con 10 kDa dextran...

L'integrità della barriera emato-encefalica è fondamentale per la funzione del sistema nervoso. Nella Drosophila melanogaster, la barriera emato-encefalica è formata da cellule gliali durante l'embriogenesi tardiva. Questo protocollo descrive i metodi per la formazione e la manutenzione delle barriere emato-encefalice negli embrioni di D. melanogaster e delle larve instar terze.

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la regolazione genetica della formazione e il mantenimento della barriera ematica-encefalica durante più fasi dello sviluppo della drosofila. Questo metodo può anche essere adattato per esaminare la permeabilità di altre barriere, come l'epitelio intestinale in una varietà di organismi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la valutazione della funzione di barriera eto-encefalica nei tessuti vivi.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto le manipolazioni di esempio possono essere difficili e molti passaggi richiedono molta attenzione ai dettagli. Per la raccolta degli embrioni posizionare un minimo di 50 femmine vergini con da 20 a 25 maschi per bottiglia con cibo Corn Meal Agar e incubare queste mosche per uno o due giorni prima di iniziare le collezioni. Il giorno prima della raccolta, scaldare i piatti di agar di succo di mela a 25 gradi Celsius durante la notte.La mattina seguente trasferire le mosche anestetizzate di anidride carbonica in una gabbia di raccolta e posizionare un piatto di agar di succo di mela prerifavorato con un piccolo striscio di pasta di lievito

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Test per misurare il comportamento delle funzioni locomotore, apprendimento, memoria e abilità...

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Drosophila melanogaster è un sistema genetico e comportamentale del modello trattabile che è stato utilizzato per comprendere le basi molecolari e cellulari di molti importanti processi biologici per oltre un secolo 1. Drosophila è stata ben sfruttata per acquisire conoscenze in base genetica del comportamento mosca.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Questo video mostra una procedura per valutare l'interruzione della barriera emato-encefalica in un modello murino EAE. Coloranti fluorescenti di diverse dimensioni vengono iniettati per via retro-orbitale e circolano attraverso i vasi sanguigni del cervello. Il colorante più piccolo fuoriesce attraverso le fessure nel tessuto cerebrale, mentre il colorante più grande entra solo se l'interruzione è grave, correlata all'entità del danno alla barriera.

Determinazione dell'interruzione della barriera emato-encefalica utilizzando coloranti fluorescenti in un modello murino EAE

Qui descriviamo due saggi che sono stati stabiliti per studiare neurodegenerazione età-dipendente di dopaminergici (DA) neuroni...

Valutare fenotipi neurodegenerative<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Qui presentiamo un'analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato - encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l'altro per la visualizzazione dell'elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Il protocollo descrive un'analisi semplice per identificare le larve di Drosophila melanogaster che stanno vivendo ipossia sotto i livelli normali di ossigeno atmosferico. Questo protocollo permette hypoxic larve deve essere distinto da altri mutanti che mostrano fenotipi sovrapposti ad esempio lentezza o crescita lenta.

Un saggio di Burrowing/Tunneling per rilevazione di ipossia nelle larve di Drosophila melanogaster

Vi presentiamo un protocollo per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare nei cervelli di larve e adulti di Drosophila melanogaster . Un analizzatore metabolico è utilizzato con un protocollo adattato e ottimizzato. Vincoli di micro-tessuto sono una componente fondamentale del presente protocollo e progettate e create appositamente per il loro uso in questa analisi.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

Questo protocollo descrive un metodo per registrare l'attività elettrica discendente del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster per abilitare il costo-efficiente e conveniente test degli agenti farmacologici, mutazioni genetiche delle proteine neuronali, e/o il ruolo di inesplorate vie fisiologiche.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

Vi presentiamo un protocollo utilizzando un approccio genetico in avanti allo screening per i mutanti che mostrano neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Incorpora un saggio di arrampicata, analisi istologica, mappatura genica e sequenziamento del DNA per identificare in ultima analisi nuovi geni legati al processo di neuroprotezione.

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

Questo protocollo presenta un metodo affidabile per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) nel modello adulto di pesce zebra (Danio rerio) utilizzando la valutazione basata sul colorante blu di Evan, consentendo un'analisi sia qualitativa che quantitativa dell'interruzione neurovascolare.

Visualizzare il guardiano: la valutazione di Evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto

Impara a valutare l'integrità della barriera ematoencefalica in Drosophila melanogaster durante lo sviluppo embrionale e larvale. Questo metodo permette l'analisi in vivo della funzione della barriera.

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

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