Name: Analisi del metabolismo delle cellule staminali ematopoietiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi nelle cellule staminali ematopoietiche murine. Questo metodo migliora la vitalità cellulare e facilita l'analisi metabolica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è in parte supportato dal sostegno finanziatorio dei National Institutes of Health (HL131645, CA016058), dalla Fondazione St. Baldrick e dalla Pelotonia Foundation.

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato nazionale per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale pediatrico (IACUC).
 NOT:</</c0> Il protocollo è descritto in ordine cronologico che si estende per il periodo di due giorni. Utilizzare nuovi reagenti come descritto nel protocollo riportato di seguito.
1. Preparazione del reagenti il giorno precedente al test
<ol><li>
Idratare la cartuccia del sensore.
	<ol>
<li>Incubare 5 mL del calibro (Tabella dei Materiali) in un incubatore non-CO2 37 gradi centigradi durante la notte.</li>
		<li>Aprire il kit di analisi del flusso (Tabella dei materiali) e separare la cartuccia del sensore (verde; superiore) dalla piastra di utilità (trasparente; inferiore). Posizionare quindi la cartuccia del sensore capovolta e adiacente alla piastra di utilità.</li>
		<li>Utilizzando acqua sterile, riempire i pozzetto della piastra di utilità (200 ) e le camere intorno ai pozzi (400 .</li>
		<li>Immergere la cartuccia del sensore nella piastra di utilità assicurandosi che i sensori siano completamente coperti dall'acqua. Toccare 3x per evitare la formazione di bolle.</li>
		<li>Collocare la cartuccia sommersa nella piastra di utilità in un'incubatrice non-CO2 37 gradi centigradi durante la notte. Per evitare l'evaporazione dell'acqua, assicurarsi che l'incubatrice sia adeguatamente umidificata. Posizionare un becher aperto contenente H2O come ulteriore precauzione accanto alla piastra cartuccia-utility, in particolare se si utilizza un forno normale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare il piatto di assaggio.
	<ol>
<li>Sterilizzare la superficie della biosicurezza cabinet classe 2 utilizzando 70% etanolo. Aprire la piastra di qualità sotto il cofano.</li>
		<li>Aggiungete 40 l di soluzione poli-L-ll(PLL) disponibile in commercio a ciascun bene della piastra di s'anguilla sotto il cofano.</li>
		<li>Coprire la piastra di prova con il coperchio fornito nel kit. Incubare la piastra di aspetto chiusa a temperatura ambiente (RT) sotto il cofano per 1 h. NOT:</</c9> L'obiettivo dell'incubazione è quello di lasciare PLL rivestire la superficie della piastra di saggio per facilitare l'adesione delle celle di sospensione alla superficie della piastra di saggio.</li>
		<li>Dopo 1 h incubazione della piastra di gusto, rimuovere la soluzione in eccesso con un aspiratore sterile a basso vuoto e asciugare l'aria del pozzo sotto il cofano. NOT:</</c10> Ci vogliono 30-60 dollari per asciugare ad aria i pozzetti della piastra di manto a seguito dell'eccessiva rimozione del PLL con l'aspiratore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Giorno del Saggio
<ol><li>Preparare la cartuccia.
	<ol>
<li>Sollevare la cartuccia del sensore. Metterlo a testa in giù nella cappa di coltura dei tessuti e scartare l'acqua dalla piastra di utilità.</li>
		<li>Riempire i pozze di servizio con 200 gradi del calibro preriscaldato.</li>
		<li>Riempire le camere intorno ai pozzi con 400 l del calibratore.</li>
		<li>Sommergi la cartuccia del sensore nella piastra di utilità, assicurandoti che i sensori siano completamente coperti dal calibratore. Toccare 3x per evitare la formazione di bolle.</li>
		<li>Equilibrate la cartuccia del sensore immersa nella piastra di utilità in un'incubatrice non-CO2 37 gradi centigradi per 45-60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogliere hSPC LSK derivati da murine.
	<ol>
<li>Per accogliere un numero sufficiente di repliche biologiche, si prevede di utilizzare Gli HSPC derivati da un topo per pozzo della piastra di analisi. NOT:</</c2> Questo metodo di raccolta del midollo osseo fornisce 50.000-80.000 LSK HSPC da ogni topo. Questo protocollo per misurare il flusso extracellulare è ottimizzato per HSPC LSK da 70.000 dollari per pozzo di 96 pozzi.</li>
		<li>Topi eutanasi che utilizzano sovradosaggio di CO2 e lussazione cervicale, seguendo metodi locali approvati da IACUC.</li>
		<li>Sterilizzare la superficie degli utensili di dissezione e la panca utilizzando il 70% di etanolo.</li>
		<li>Per ogni topo, precompilare una parabola Petri con 1x salina tamponata da fosfato (PBS) contenente il 2% di siero bovino fetale inattivato dal 2% (FBS) a RT. NOT:</</c4> Non utilizzare PBS preraffreddamento in quanto creerà grumi nei passaggi seguenti.</li>
		<li>Spruzzare 70% di etanolo (v/v) sull'intero topo eutanasia. Isolare tutte le ossa, compresi gli arti superiori e inferiori, le ossa dell'anca, lo sterno, la gabbia toracica e la colonna vertebrale, dal topo17,18. Estrarre la materia bianca dal midollo spinale del mouse in quanto può contaminare le cellule LSK. Collocare tutte le ossa in 1x PBS (2% FBS), mentre vengono raccolte, in un piatto Petri fino a nuovo utilizzo.</li>
		<li>Invertire un tubo conico da 50 ml (nuovo ogni volta) e utilizzarlo per triturare le ossa sommerse in 1x PBS (-2% FBS) nel piatto Petri.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, pipetta su e giù (10x) per lavare uniformemente le cellule dalle ossa, dopo aver schiacciato le ossa.</li>
		<li>Posizionare un colino a 40 m su un tubo conico da 50 ml. Pre-bagnato della superficie del colino passando 1 mL di 1x PBS (2% FBS).</li>
		<li>Raccogliere la sospensione cellulare derivata dal midollo osseo dal punto 2.2.7 e passarla attraverso la superficie pre-bagnata del colino cellulare per rimuovere i detriti ossei.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 2.2.6 a 2.2.9 fino a quando tutti i materiali ossei diventano bianchi come marcatore che la maggior parte delle cellule del midollo osseo sono raccolte nel tubo conico da 50 mL. NOT:</</c8> Spesso ci vogliono due tubi conici da 50 mL per mouse per raccogliere tutte le cellule derivate dal midollo osseo.</li>
		<li>Centrifuga 50 mL tubi conici contenenti cellule derivate dal midollo osseo per 5 min a 500 x g e RT.</li>
		<li>Togliete il super-acletterante. Risospendere le cellule derivate dal midollo osseo (combinare il contenuto di entrambi i tubi da 50 mL) in 5 mL di 1x PBS (-2% FBS) come volume finale e mantenere le cellule a RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogliere cellule di midollo osseo murinee mononucleated.
	<ol>
<li>Aggiungere 5 mL di gradiente medio di densità (cioè Ficoll) a un tubo conico da 15 mL. Quindi aggiungere lentamente 5 mL della sospensione della cellula del midollo osseo. Assicuratevi che le celle rimangano come un livello al di sopra del mezzo di sfumatura di densità.</li>
		<li>Centrifuga per 30 min a 500 x g e RT. Non usare un freno nella centrifuga. Assicurarsi che la centrifuga sia alla più bassa accelerazione possibile (ad esempio, 1 accelerazione e 0 decelerazione).</li>
		<li>Raccogliere l'interfaccia centrale delle cellule mononilleate (colore bianco) dopo la centrifugazione in un tubo conico fresco da 15 mL.</li>
		<li>Lavare le cellule, raccolte da un mezzo di pendenza di densità, con 5 mL di 1x PBS (-2% FBS). Centrifuga per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Togliete il super-acletterante.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.3.4.</li>
		<li>Risospendere il contenuto della cella del tubo in 300 -L di 1x PBS (-2% FBS). Aliquota 10 di sospensione cellulare per il controllo incontaminato o monocolore in un tubo FACS.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogliere LSK HSPC da cellule mononucleate del midollo osseo murineo.
	<ol>
<li>Preparare un cocktail di biotina-anticorpi mescolando 3 -L per campione dei seguenti anticorpi: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Aggiungere 15 l del cocktail biotina-anticorpo a 300 -L di cellule mononucleate del midollo osseo. NOT:</</c2> Ogni anticorpo viene utilizzato a 1:100 diluizione.</li>
		<li>Incubare le cellule con il cocktail biotina-anticorpo per 30 min a 4 gradi centigradi con agitazione per evitare che le cellule si aggrovigliano nella parte inferiore del tubo.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di PBS pre-raffreddato (2% FBS) alle cellule mescolate con il cocktail biotina-anticorpo.</li>
		<li>Centrifugare il tubo per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 400 -L l of 1x PBS (2% FBS). Aliquota 10 L per il controllo del colore singolo streptavidin.</li>
		<li>Brevemente vortice anti-biotina microsfere (Tabella dei materiali) prima dell'uso. Aggiungete 80 l di microsfere ad ogni campione di cellule (di 400 gradi centigradi). Mescolare bene e incubare per ulteriori 20 min a 4 gradi centigradi, con agitazione.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di PBS 1x pre-raffreddato alle celle. Centrifugare il tubo per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di 1x PBS (-2% FBS). Conservare a 4 gradi centigradi durante la configurazione dell'unità di separazione magnetica.</li>
		<li>Collocare una colonna (Tabella dei materiali) nel campo magnetico del separatore di ordinamento delle celle magnetiche assistite (MACS) a 4 gradi centigradi. Preparare la colonna per la separazione magnetica risciacquandola con 3 mL di 1x PBS (-2% FBS) sotto il flusso di gravità a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Aggiungere la sospensione della cella dal punto 2.4.7 alla colonna pre-bagnata a 4 gradi centigradi. Lasciare che le cellule passino attraverso la colonna a 4 gradi centigradi e raccogliere gli effluenti in un tubo conico da 15 mL. NOT:</</c7> La frazione con celle senza etichetta in tali effluenti rappresenta le cellule negative di lignaggio arricchite.</li>
		<li>Lavare la colonna con 3 mL di 1x PBS (-2% FBS) a 4 gradi centigradi. Ripetere 3x. Raccogliere il flusso attraverso e tenerlo a 4 gradi centigradi. Contare le cellule vitali eluite con l'esclusione blu trypan utilizzando un emocitometro.</li>
		<li>Centrifugare il tubo conico da 15 mL contenente il flusso-through per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Risospendere le celle in 0,5 mL di 1x PBS (-2% FBS) e trasferire il contenuto in un tubo FACS.</li>
		<li>Aggiungere 24 - L del cocktail anticorpo LSK a ogni 107 cellule. Il cocktail anticorpale contiene la stessa concentrazione di anticorpi 450-streptavidin, anticorpo PE-CY7-Sca1, e anticorpo APC-c-Kit.</li>
		<li>Incubare per 1 h a 4 gradi centigradi con agitazione sotto scuro (coperto di stagnola).</li>
		<li>Aggiungete 3 mL di 1x PBS (-2% FBS) al tubo FACS. Centrifuga per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.</li>
		<li>Risospendere le cellule con etichettatura anticorpo in 1 mL di 1x PBS (-2% FBS). Aggiungere 1 ll di 1 mg/mL di iodio iodio alla sospensione cellulare appena prima dello smistamento.</li>
		<li>Filtrare il contenuto del tubo FACS utilizzando un colino da 40 m subito prima di ordinare le celle LSK.</li>
		<li>Raccogliere le cellule LSK, tramite lo smistamento FACS, in un tubo da 1,5 mL contenente 0,5 mL di supporto completo integrato con 2 mM di glutammina, 3 mg/mL di glucosio, 1 mM di piravate, 1x trombopoietina (TPO), 1x fattore di cellule staminali (SCF), 0,5x penicillina/streptomycin (P/S), pH 7.4Table).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sospensione mitocondriale e saggi di glicolisi degli HSPC LSK
<ol><li>
Semina LSK nella piastra di saggio
	<ol>
<li>Centrifuga cellule LSK da passo 2.4.17 per 5 min a 500 x g e RT. Scartare il sovratalmente.</li>
		<li>Risospendere le cellule in supporti completi ad una concentrazione finale di almeno 70.000 cellule/40 .</li>
		<li>Contenuto di semi di 40 -L (contenente 70.000 celle) nella lastra di 8 pozze di PLL dal punto 1.2.4. Lasciare vuoti tutti i pozzi d'angolo.</li>
		<li>Centrifuga per 1 min a 450 x g e RT. Non applicare il freno. Assicurarsi che le cellule siano attaccate al fondo del pozzo utilizzando il microscopio invertito.</li>
		<li>Aggiungete 135 l di supporto completo alle celle in ogni pozzo per un volume finale di 175 gradi.</li>
		<li>Incubare le cellule nell'incubatrice nonCO2 per 2 h a 37 .</li>
		<li>Impostare un programma per aggiungere farmaci a ogni pozzo della piastra di pozzo nell'analizzatore utilizzando una metrica descritta nella Tabella 2 (test di stress mitocondriale) e nella tabella 3 (test di stress della glicolisi). NOTA: Durante l'incubazione delle cellule, accendere lo strumento e assicurarsi che sia a 37 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test di stress mitocondriale
	<ol>
<li>Preparare 45 soluzioni di stock di oligomicina, 50 m di cianuro carbonile 4-(trifluromethoxy)fenylhydrazone (FCCP) e 25 soluzioni di stock m di rotenone/antimicina A. Per preparare una soluzione di 45 oligomicina, sciogliere il contenuto della sacca disponibile in commercio in 280 - L del supporto completo. Per preparare una soluzione di 50 m FCCP, sciogliere il contenuto della sacca disponibile in commercio in 288 - L del supporto completo. Per preparare una soluzione di supporto a 25 M rotenone/antimycin A, sciogliere il contenuto della sacca disponibile in commercio in 216 - L del supporto completo.</li>
		<li>Togliere la cartuccia del sensore nella piastra di utilità dall'incubatrice e caricare le sue porte (A, B e C) in modo che ogni pozzo abbia una concentrazione finale di 2 oligomicina M, 1,5 M FCCP e 0,5 M di rotenone/antimicina A come richiesto, seguendo le metriche di diluizione descritte nella tabella 4 (per il tasso di consumo di ossigeno).</li>
		<li>Rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore assemblato nella piastra di utilità e posizionarlo sul vassoio dello strumento. Avviare la calibrazione che richiederà 20 min.</li>
		<li>Dopo la calibrazione, rimuovere la piastra di utilità e sostituirla con una piastra di analisi contenente celle LSK, che ora sono aderenti al fondo del pozzo.</li>
		<li>Premere Continua per avviare il programma descritto nella tabella 2. Dopo il completamento del programma, recuperare i dati e analizzarli utilizzando il software Wave Desktop. NOT:</</c12> I dati generati dai saggi del flusso extracellulare possono essere tracciati utilizzando il grafico a punti dal software Wave Desktop o esportati in un programma di statistiche basato sul web.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test di stress della glicolisi
	<ol>
<li>Ricostituire il glucosio in 300 ml (100 mM), oligomycin in 288 L (50 m), glucosio 2D (2-DG) in 300 l (500 mM) di supporti completi dalla sacca disponibile in commercio.</li>
		<li>Delicatamente pipette su e giù (10x) per solubilizzare i composti. Vorticare la DG 2 per circa 1 min per garantire una corretta dissoluzione nei supporti.</li>
		<li>Togliere la cartuccia del sensore dall'incubatrice. Le porte di carico da A a C in base alle metriche di diluizione descritte nella tabella 5 per ottenere una concentrazione finale di glucosio di 10 mM, 2 oligomicina e 50 mM 2-DG.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.2.3 e 3.2.4.</li>
		<li>Premere Continua per avviare il programma descritto nella tabella 3. Dopo il completamento del programma, recuperare i dati e analizzarli utilizzando il software Wave Desktop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+diet%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li>
<li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+change%3A+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li>
<li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125(2016).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li>
<li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+Mitochondria%2C+Metabolism%2C+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li>
<li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901(2015).</li>
<li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li>
<li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li>
<li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li>
<li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li>
<li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis%3A+therapeutic+targets+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility%3A+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li>
<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, dimostriamo l'isolamento di una quantità massima di popolazione di HSPC murini murini puro e vitale, nonché la misurazione della loro glicolisi e della respirazione mitocondriale con un analizzatore di flusso extracellulare. In particolare, il protocollo supera i seguenti problemi tecnici per l'uso di HSPC LSK : i) la bassa frequenza degli HSPC LSK nel midollo osseo murino14, ii) bassa attività metabolica basale di LSK HSPCs26, iii) la fragilità di LSK HSPCs<sup class=...

Poiché la durata della vita della maggior parte delle cellule del sangue mature è breve, l'omeostasi del sangue si basa sull'auto-rinnovamento e la differenziazione di una popolazione longeva ma rara di cellule staminali ematopoietiche (HSPN)1. Gli HSPC sono quiescenti, ma sono pronti a proliferare e a subire differenziazione sulla stimolazione per sostenere le esigenze del sistema sanguigno. Poiché ogni stato cellulare HSPC richiede una domanda bioenergetica unica, i cambiamenti metabolici sono i fattori chiave delle decisioni del destino HSPC. Pertanto, la perdita di plasticità metabolica, alterando l'equilibrio tra quiescenza, auto-rinnovamento e differenziazione degli HPG, porta spesso a disturbi mielo- o linfo-proliferativi. Insieme, la comprensione della regolazione metabolica dello sviluppo HSPC è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle neoplasie ematologiche2,3,4,5.
La respirazione mitocondriale e la glicolisi generano ATP per guidare reazioni intracellulari e produrre gli elementi costitutivi necessari per la sintesi delle macromolecole. Poiché gli HSPC hanno una bassa massa mitocondriale rispetto alle cellule differenziate6 e sostengono la quiescenza nelle nicchie ipossiche del midollo osseo, gli HSPC si basano principalmente sulla glicolisi. L'attivazione di HSPC migliora il loro metabolismo mitocondriale che porta alla perdita di quiescenza e la loro successiva immissione nel ciclo cellulare. Tale plasticità metabolica degli HSPN consente la manutenzione del pool HSPC per tutta la vita adulta6,7,8,9,10,11,12. Pertanto, è fondamentale studiare le loro attività metaboliche, come il tasso di consumo di ossigeno (OCR; indice di fosforo ossidativo) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR; indice della glicolisi) per analizzare l'attivazione di HSPC e lo stato di salute. Sia l'OCR che l'ECAR possono essere misurati simultaneamente, in tempo reale, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Tuttavia, il metodo corrente richiede un numero elevato di celle ed è ottimizzato per le celle aderenti13. Poiché gli HSPC non possono essere isolati in grandi quantità dai topi14, richiedono lo smistamento per ottenere una popolazione pura, sono cellule non aderenti15e non possono essere coltivate durante la notte senza evitare la differenziazione16, è stato difficile misurare l'OCR e l'ECAR degli HSPC. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per accompagnare video-based tutorial su come misurare la respirazione metabolica e la glicolisi di poche migliaia di murine osso midollo-LineagenegSca1-c-Kit(LSK) HSPC.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina 0,01% (p/v)</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>Utilizzato per l'attacco LSK</td></tr><tr><td>40 & micro; filtro cellulare</td><td>m Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Utilizzato per la filtrazione cellulare dopo la frantumazione ossea</td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>Utilizzato per la separazione</td></tr><tr><td>della lintina Biotina di ratto Anti-topo CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>Utilizzato per la separazione</td></tr><tr><td>della lintina Biotina di ratto Anti-topo CD5 Clone 53-7.3</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>553019 Utilizzato per la lin- separazione</td></tr><tr><td>Biotina ratto Anti-topo CD8a clone 53-6.7</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td>utilizzato per la separazione</td></tr><tr><td>della lintina Biotina ratto anti-topo Ly-6G e Ly-6C clone RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>utilizzato per la separazione</td>della</tr><tr><td>lintina Biotina ratto Anti-topo TER-119/cellule eritroidi clone TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>utilizzato per la separazione della lina</td></tr><tr><td>CD117 (c-kit) anticorpo monoclonale (2B8), APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Utilizzato per lo smistamento LSK</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche Falcon 15 mL</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche Falcon 50 mL</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Provette in polipropilene a fondo tondo Falcon</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>Utilizzato per Selezione LSK</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Neuromics</td><td>FBS001-HI</td><td>Utilizzato nel tampone FACS</td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>Utilizzato per la separazione a gradiente di ficoll</td></tr><tr><td>L-glutammina 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>Utilizzato per il terreno di saggio</td></tr><tr><td>Colonna LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Utilizzato per la separazione Lin-</td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonale Anticorpo (D7), PE-Cianina7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>Utilizzato per la selezione LSK</td></tr><tr><td>Fattore di cellule staminali murine (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>Utilizzato per il terreno di prova</td></tr><tr><td>Trombopoietina murina (TPO)</td><td>PeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>Utilizzato per il terreno di prova</td></tr><tr><td>PBS 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>Utilizzato per il tampone FACS</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina ( 10.000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Utilizzato per il terreno di saggio</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1304MP</td><td>Utilizzato per la selezione LSK</td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XFp Coltura cellulare Minipiastra</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td>Utilizzato per la semina LSK</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>Utilizzato per il terreno di analisi</td></tr><tr><td>Streptavidina eFluor 450 Coniugato</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>Utilizzato per lo smistamento LSK</td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>Utilizzato per l'equilibratura della cartuccia</td></tr><tr><td>XF Terreni</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>Utilizzato per il terreno di saggio</td></tr><tr><td>Kit per test da sforzo per la glicolisi XFp</td><td>Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>Farmaci per il test da sforzo della glicolisi</td></tr><tr><td>XFp Mitocondriale Kit per test da sforzo</td><td>Agilent Technologies</td><td>103010100</td><td>Farmaci per test da sforzo mitocondriale</td></tr><tr><td>Cartuccia sensore XFp</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td>Utilizzato per test da sforzo glicolitico e mitocondriale</td></tr></tbody></table>

analisi del metabolismo delle cellule staminali ematopoietiche

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) hanno una plasticità metabolica distinta, che permette loro di passare dal loro stato quiescente a uno stato di differenziazione per sostenere le richieste della formazione del sangue. Tuttavia, è stato difficile analizzare lo stato metabolico (respirazione mitocondriale e glicolisi) degli HSPC a causa del loro numero limitato e della mancanza di protocolli ottimizzati per HSPC fragili e non aderenti. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per misurare la respirazione metabolica (tasso di consumo di ossigeno; OCR) e glicolisi (tasso di acidificazione extracellulare; ECAR) di HSPC di midollo osseo murino-Lingo Questo protocollo fornisce una maggiore quantità di HSPC LSK dal midollo osseo murino, migliora la vitalità degli HSPC durante l'incubazione, facilita l'analisi del flusso extracellulare di HSPC non aderenti e fornisce protocolli di iniezione ottimizzati (concentrazione e tempo) per i farmaci che prendono di mira il fosforolazione ossidativa e le vie glicolytiche. Questo metodo consente la previsione dello stato metabolico e della salute degli HPC durante lo sviluppo del sangue e le malattie.

Il nostro metodo di estrazione ci ha permesso di raccogliere fino a 80.000 HSPC LSK per mouse. La vitalità e il numero di cellule LSK sono stati migliorati con il nostro metodo, perché noi: (1) combinato midollo osseo da arti superiori e inferiori, ossa dell'anca, sterno, gabbia toracica, e la colonna vertebrale, (2) evitato utilizzando buffer di lisi a cellule rosse che avrebbe aumentato la morte delle cellule e l'agglomeramento, (3) utilizzato il gradiente di densità media separazione delle cellule mono-nucleate, e (4)...

Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) passano da uno stato quiescente a uno stato di differenziazione a causa della loro plasticità metabolica durante la formazione del sangue. Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi degli HSPC.

Analisi del metabolismo delle cellule staminali ematopoietiche

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

I cambiamenti metabolici nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici consentono loro di passare dal loro stato quiescente a uno stato di differenziazione per sostenere le richieste di formazione del sangue. L'alterazione della plasticità metabolica delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici porta a disturbi ematologici. Il nostro protocollo aiuterà a misurare la regolazione metabolica e la salute delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici durante lo sviluppo del sangue e le malattie.L'analisi della respirazione mitocondriale e della glicolisi delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici è difficile in quanto sono popolazione fragile e rara. Il nostro protocollo ottimizzato consente l'isolamento di una maggiore quantità di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici dal midollo osseo murino, migliora la loro vitalità durante l'incubazione, facilita l'analisi del flusso extracellulare di HSPC non aderenti e fornisce parametri di iniezione ottimizzati per il farmaco che mira alla fosforilazione ossidativa e alle vie glicolitiche. Per iniziare questa procedura, riempire i pozzi della piastra di utilità e le camere intorno ai pozzi con acqua sterile.Immergere la cartuccia del sensore nella piastra di utilità assicurandosi che i sensori siano completamente coperti dall'acqua. Quindi posizionare la cartuccia immersa nella piastra di utilità in un incubatore non di CO2 a 37 gradi Celsius per incubare durante la notte. In un armadio di biosicurezza di classe II, aggiungere 40 microlitri di soluzione 0,1%PLL disponibile in commercio a ciascun pozzo della piastra di dosaggio.Coprire la piastra di dosaggio con il coperchio fornito nel kit e incubare la piastra chiusa a temperatura ambiente sotto il cofano per un'ora. Successivamente, utilizzare un aspiratore sterile a base di vuoto per rimuovere la soluzione in eccesso e asciugare ad aria la piastra sotto il cofano. Per raccogliere cellule di midollo osseo murino mononucleate, aggiungere cinque millilitri di gradiente di densità medio a un tubo conico da 15 millilitri.Aggiungere lentamente cinque millilitri della sospensione cellulare del midollo osseo assicurandosi che le cellule rimangano come uno strato al di sopra del mezzo gradiente di densità. Centrifugare a 500 volte g e a temperatura ambiente per 30 minuti assicurandosi che la centrifuga sia alla più bassa accelerazione possibile. Raccogliere l'interfaccia centrale delle cellule mononucleate in un tubo fresco da 15 millilitri.Quindi lavare le celle con cinque millilitri di 1X PBS contenenti 2%FBS. Centrifuga a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le celle in 300 microlitri di 1X PBS contenenti 2%FBS.Successivamente, aliquote 10 microlitri della sospensione cellulare per il controllo non macchiato o monocolore in un tubo FACS. Per raccogliere HSPC LSK da cellule del midollo osseo murino mononucleate, aggiungere 15 microlitri di cocktail anticorpale di biotina a 300 microlitri di cellule mononucleate del midollo osseo. Per raccogliere HSPC LSK da cellule del midollo osseo murino mononucleate, aggiungere 15 microlitri di cocktail anticorpale di biotina a 300 microlitri di cellule mononucleate del midollo osseo.Posizionare i tubi in un secchio di ghiaccio posizionato su uno shaker in frigorifero per incubare a quattro gradi Celsius con agitazione per 30 minuti. Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS 1X prerimente refrigerato contenente 2%FBS alle celle. Centrifuga a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 400 microlitri di 1X PBS contenenti 2%FBS. Vortice brevemente le microperline anti-biotina prima dell'uso. Aggiungere 80 microlitri delle microperline a ciascun campione e mescolare bene.Incubare per altri 20 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di PBS pre-refrigerato contenenti 2%FBS alle celle. Centrifugare il tubo a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un millilitro di PBS contenente il 2%FBS. Conservare la sospensione cellulare a quattro gradi Celsius durante la configurazione dell'unità di separazione magnetica. Posizionare la colonna in un campo magnetico per il separatore di smistamento delle celle assistite magnetiche a quattro gradi Celsius.Preparare la colonna per la separazione magnetica risciacquarla con tre millilitri di 1X PBS contenenti 2%FBS sotto flusso di gravità a quattro gradi Celsius. Aggiungere la sospensione cellulare alla colonna pre-bagnata a quattro gradi Celsius. Lasciare passare tutte le cellule attraverso la colonna a quattro gradi Celsius e raccogliere l'effluente in un tubo conico da 15 millilitri.Quindi, lavare la colonna con tre millilitri di 1X PBS e 2%FBS a quattro gradi Celsius. Ripetere questo lavaggio tre volte. Raccogli il flusso e mantienilo a quattro gradi Celsius.Centrifugare il tubo conico contenente il flusso a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le celle in 0,5 millilitri di 1X PBS con 2%FBS e trasferire la sospensione su un tubo FACS. Quindi aggiungere 24 microlitri del cocktail anticorpale LSK a ogni 10 milioni di cellule.Coprire il tubo con un foglio e incubare al buio a quattro gradi Celsius con agitazione per un'ora. Successivamente, aggiungere tre millilitri di 1X PBS con 2%FBS al tubo FACS. Centrifuga a 500 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare le cellule etichettate con anticorpi in un millilitro di 1X PBS contenente 2%FBS. Poco prima dello smistamento, aggiungere un microlitro di un milligrammo per millilitro propidio ioduro alla sospensione cellulare e utilizzare un colino da 40 micrometri per filtrare il contenuto del tubo FACS. In primo luogo, centrifugare le cellule LSK raccolte a 500 volte g e a temperatura ambiente per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in mezzi completi ad una concentrazione finale di almeno 70.000 cellule per 40 microlitri. Semina 40 microlitri di questa sospensione cellulare nei pozzi di una piastra a otto pozzatti rivestita in PLL assicurandosi di lasciare tutti i pozzi d'angolo vuoti. Centrifugare la piastra a 450 volte g e a temperatura ambiente per un minuto.Utilizzare un microscopio invertito per assicurarsi che le cellule siano attaccate alla parte inferiore dei pozzi. Successivamente, aggiungere 135 microlitri di supporto completo alle cellule in ogni pozzo portando il volume finale di ogni pozzo a 175 microlitri. Aggiungere 175 microlitri di supporti completi ai due angoli della piastra come spazi vuoti.Incubare le cellule in un incubatore non di CO2 a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi impostare un programma per l'analizzatore per aggiungere farmaci a ogni pozzo della piastra come descritto nella tabella due e nella tabella tre del protocollo di testo. Per la prova di stress mitocondriale, recuperare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità dall'incubatore in modo tale che ogni pozzo abbia una concentrazione finale di due oligomicina micromolare, 1,5 micromolare FCCP e 0,5 micromolare di rotenone e antimicina A, se necessario.Rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore e posizionarlo sul vassoio dello strumento. Iniziare il processo di calibrazione che richiederà 20 minuti. Al termine della calibrazione, rimuovere la piastra di utilità e sostituirla con la piastra di dosaggio contenente le celle LSK.Premere continua per avviare il programma impostato in precedenza. Al termine del programma, recuperare i dati e analizzarli. In questo studio, una quantità massima di HSPC LSK murini vitali sono isolati e la loro glicolisi e metabolismo mitocondriale viene misurata con un analizzatore di flusso extracellulare.Sebbene l'analisi del flusso extracellulare sia tradizionalmente utilizzata per le cellule aderenti, questo metodo rende gli HSPC LSK aderenti ai pozzi rivestiti in PLL che consentono la misurazione del flusso extracellulare e quindi la salute metabolica degli HSPC LSK. Al fine di misurare la respirazione mitocondriale attraverso il tasso di consumo di ossigeno e la glicolisi attraverso il tasso di acidificazione extracellulare in condizioni basali e di stress, i farmaci che interferiscono con la glicolisi e la respirazione mitocondriale vengono iniettati in sequenza. Come previsto, il livello basale del tasso di acidificazione extracellulare è più elevato per gli HSPC LSK coltivati in glucosio e piruvati positivi rispetto a quelli coltivati in mezzi negativi.L'iniezione con glucosio non ha cambiato il tasso di acidificazione extracellulare per le cellule coltivate nei mezzi positivi, ma ha aumentato la glicolisi delle cellule in mezzi negativi. Tuttavia, il livello basale di queste cellule è rimasto ancora più basso nel gruppo positivo. L'iniezione con oligomicina ha attivato la glicolisi al suo livello massimo nel gruppo positivo, ma non ha influenzato il gruppo negativo.L'iniezione con l'analogo glucosio a 2-DG ha restituito il tasso di acidificazione extracellulare a livelli non glicolitici. Per la prova di stress mitocondriale, l'iniezione di oligomicina iperpolarizzò la membrana mitocondriale impedendo un maggiore pompaggio di protoni attraverso i complessi ETC e riducendo così il tasso di respirazione mitocondriale. L'iniezione di FCCP spinge il tasso di consumo di ossigeno al massimo mentre le cellule cercano di recuperare il potenziale della membrana mitocondriale.L'iniezione con altri due inibitori della catena di trasporto degli elettroni fa sì che la respirazione mitocondriale si fermi completamente e quindi il tasso di consumo di ossigeno sia tornato al suo livello minimo. Si prega di evitare l'uso di tampone di lisi dei globuli rossi per l'isolamento delle cellule mononucleari. Si consiglia la separazione del gradiente Ficoll per prevenire la formazione di ciuffi e ridurre la perdita di LSK.Utilizzando il nostro metodo ottimizzato, possiamo misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche rare e fragili e lo studio di segnali metabolici regolano l'ematopoiesi normale e maligna.

analysis-of-hematopoietic-stem-progenitor-cell-metabolism

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

La colonia di cellule che formano (CFC) test è un test in vitro in cui progenitori emopoietici formare colonie in terreno semisolido. Una combinazione di morfologia delle colonie, la morfologia delle cellule, e citometria a flusso sono utilizzati per valutare la capacità dei progenitori di proliferare e differenziarsi lungo le varie linee ematopoietiche.

Formanti colonia cellulare (CFC) Analisi per cellule emopoietiche

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Qui si descrive in vivo mutagenesi saggio per un piccolo numero di cellule ematopoietiche purificate utilizzando il modello di topo transgenico LacI. Il gene LacI può essere isolato per determinare la frequenza, la posizione ed il tipo di mutanti DNA sorto spontaneamente o dopo l'esposizione a genotossine.

L&#39;identificazione del DNA Mutazioni in depurata ematopoietiche cellule staminali / progenitrici

Questo protocollo fornisce linee guida passo dopo passo per l'impostazione di esperimenti competitivi di trapianto di midollo osseo di topo per studiare la funzione delle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche senza previa purificazione delle cellule staminali mediante selezione cellulare.

Trapianti competitivi per valutare staminali ematopoietiche cellule Fitness

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

Le pompe di efflusso xenobiotico sono altamente attive nelle cellule staminali esemiche e progenitrici (HSPC) e causano l'estrusione di TMRM, una membrana mitocondriale potenziale disfunzione fluorescente. Qui, presentiamo un protocollo per misurare con precisione il potenziale della membrana mitocondriale negli HSPC da TMRM in presenza di Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso.

Migliorare l'accuratezza del flusso Valutazione citometrica del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici attraverso l'inibizione delle pompe di efflusso

Qui descriviamo un metodo affidabile per misurare la massa mitocondriale e il potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche coltivate nell'ex vivo e nelle cellule T.

Misurazione della massa mitocondriale e del potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche e t-cellule da parte della citometria di flusso

Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.

Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale

Qui viene presentata una tecnica basata sulla citometria a flusso che consente di misurare simultaneamente il numero di divisioni cellulari, il fenotipo cellulare di superficie e la parentela cellulare. Queste proprietà possono essere testate statisticamente utilizzando un framework basato sulla permutazione.

Valutazione simultanea di parentela, numero di divisione e fenotipo tramite citometria a flusso per cellule staminali e progenitrici ematopoietiche

Qui presentiamo un protocollo per misurare in modo accurato e affidabile i metaboliti in rari tipi di cellule. I miglioramenti tecnici, tra cui un fluido di guaina modificato per la selezione cellulare e la generazione di campioni bianchi pertinenti, consentono una quantificazione completa dei metaboliti con un input di sole 5000 cellule per campione.

Metabolomica mirata su cellule primarie rare

Scopri un protocollo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi nelle cellule staminali ematopoietiche murine. Questo metodo migliora la vitalità cellulare e facilita l'analisi metabolica.

Analisi del metabolismo delle cellule staminali ematopoietiche

Esplora altri video