Name: Analisi basata su macchie di luce per lanalisi di Drosophila Larval Phototaxis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Scopri il light-spot assay per analizzare il fototassismo nelle larve di Drosophila melanogaster. Questo metodo permette di tracciare i movimenti e studiare le basi neurologiche del comportamento.

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Questo lavoro è supportato dalla fondazione di scienze naturali della Cina (31671074) e dai Fondi di Ricerca fondamentali per le Università Provinciali di zhejiang (2019X-X003-12).

1. Preparazione delle larve di Drosophila
<ol><li>Preparare il mezzo standard costituito da farina di mais bollito (73 g), agar (5,6 g), farina di soia (10 g), lievito (17,3 g), sciroppo (76 mL) e acqua (1000 mL).</li>
	<li>Sollevare tutte le mosche a 25 gradi centigradi su un supporto standard in una stanza con un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h.</li>
</ol>2. Preparazione di piatti di agar
<ol><li>Preparare la soluzione agar 1.0%. Pesare 3 g di agar in un becher da 500 mL con una bilancia, quindi aggiungere 300 mL di acqua distillata. Posizionare una carta stagnola sopra l'interruttore per evitare che l'acqua evapora. Riscaldare il becher in un forno a microonde a ebollizione.</li>
	<li>Estrarre il becher e mescolare bene con una verga di vetro, quindi riscaldare in un forno a microonde a ebollizione. Ripetere fino a quando il liquido è completamente trasparente e fluido. NOTA: La soluzione finale di agar caldo dovrebbe essere priva di bolle d'aria; in caso contrario, versando l'agar nella piastra si tradurrà in superficie irregolare e ammaccata della piastra di agar, che influenzerà i successivi test del comportamento larvale. La concentrazione della soluzione agar non deve essere troppo alta o bassa. Se la concentrazione è troppo alta, la luce diffusa riflessione sulla piastra di agar sarà forte e spalmare il confine di luce / scuro. Se la concentrazione è troppo bassa, le larve lasceranno tracce sulla piastra. Entrambi questi errori ostacoleranno l'elaborazione video più avanti nel protcol.</li>
	<li>Versare lentamente la soluzione di agar caldo in una piastra Petri (diametro 15 cm) fino a quando il fondo è coperto uniformemente con uno strato di agar (4 mm di spessore), e raffreddare a temperatura ambiente (RT) fino a quando la soluzione agar è solidificata.</li>
	<li>Piatto di agar deve essere utilizzato quando è appena preparato. In caso contrario, versare uno strato d'acqua sulla superficie e conservarlo in frigorifero a 4 gradi centigradi per un uso successivo.</li>
</ol>3. Configurazione del sistema di stimolazione visiva
<ol><li>Selezionare la sorgente luminosa a LED: luce blu LED collimata a 470 nm o luce bianca calda. NOTA: La sorgente luminosa può essere sostituita con una luce LED di qualsiasi altra lunghezza d'onda. In questo esperimento, la luce blu LED viene utilizzata come esempio.</li>
	<li>Arrotolare un pezzo spesso di foglio di alluminio o cartone nero (assicurare l'opacità) per formare un cilindro aperto di 12 cm di lunghezza con un diametro simile a quello del LED blu-luce con un diametro di 3 cm. Lasciare che l'estremità superiore del cilindro copra l'estremità anteriore del LED a luce blu. Coprire l'estremità inferiore con un cartone nero con un piccolo foro rotondo (0,5 cm di diametro) al centro. Questo costituisce il sistema di sorgente luminosa impostato.</li>
	<li>Fissare la sorgente luminosa preparata sul telaio di ferro con una clip, assicurandosi che la luce LED si sciolga verso il desktop. Inclinare leggermente il cilindro. L'angolo tra il piano del cilindro e il piano verticale è di circa 10 gradi (vedere la figura 1). Collegare la luce LED blu da 470 nm alla spina "LED1" del driver LED ad alta potenza. Accendere il driver, girare la manopola nell'angolo superiore destro del driver per selezionare il canale 470 nm, quindi fare clic su LED. Quindi, quando sullo schermo viene visualizzato il messaggio """ sul desktop verrà visualizzato un punto luce blu. NOTA: Se il cilindro perde luce oltre al piccolo foro rotondo, si consiglia di utilizzare nastro nero sulle parti che perdono per assicurarsi che solo il foro possa passare la luce.</li>
	<li>Fare clic su OK e ruotare la manopola per regolare l'intensità della luce. Ruotare la manopola a un'intensità di luce superiore di 50 mA. Misurare e registrare lo spettro della luce con uno spettrometro.</li>
	<li>Spostare la posizione della sorgente luminosa verso l'alto e verso il basso per regolare il diametro del punto luce a 2 cm. Il desktop deve essere nero per un migliore effetto di contrasto.</li>
	<li>Ruotare la manopola per scegliere l'intensità della luce in base alle esigenze sperimentali. Utilizzare una console compatta misuratore di potenza con un sensore di potenza fotodiode standard per misurare la potenza di luce massima e minima nel posto, registrarlo, misurare tre volte e prendere il valore medio. NOTA: Si consiglia di utilizzare un sensore di potenza fotodiode per misurare l'intensità della luce per la luce di una specifica lunghezza d'onda e utilizzare un sensore di potenza termica per misurare l'intensità della luce per la luce bianca.</li>
	<li>Calcolare l'intensità della luce nel punto luce dividendo la potenza della luce misurata per l'area del sensore. NOTA: Ad esempio, se la potenza della luce misurata nel passaggio 2,6 è 20 pW e l'area del sensore è 0,81 mm2, l'intensità della luce è 24,69 pW/mm2 (dividendo 20 pW per 0,81 mm2).</li>
</ol>4. Configurazione del sistema di imaging
<ol><li>Bloccare una webcam ad alta risoluzione con una clip di ferro, a circa 10 cm sopra il punto luce sul desktop (Figura 1).</li>
	<li>Regolare l'orientamento dell'obiettivo della fotocamera verso il desktop. Collegare la fotocamera a un computer tramite un'interfaccia USB.</li>
	<li>Posizionare una piastra di agar sul desktop proprio sotto la fotocamera.</li>
	<li>Aprire il software "Amcap9.22" sul computer con Windows 7 e il punto luce verrà visualizzato automaticamente nella finestra di AMcap. Spostare la fotocamera leggermente a sinistra o a destra per assicurarsi che il punto luce si trova vicino al centro della finestra. Assicurarsi che la fotocamera non blocchi il percorso della luce. Il punto luce deve essere completo e rotondo. NOTA: il software è disponibile allhttp://amcap.en.softonic.com/.</li>
	<li>Fissare un filtro a bande da 850 nm e 3 nm con una clip a 5-7 mm proprio sotto la fotocamera. NOTA: il diametro del filtro è di circa 2,5 cm e l'obiettivo della fotocamera ha meno di 1 cm di diametro, quindi il filtro può coprire il campo visivo della fotocamera. Con il filtro sotto la fotocamera, il punto luce non dovrebbe essere visto nella finestra di AMcap.</li>
	<li>Posizionare in modo uniforme tre LED che generano infrarossi (lunghezza d'onda centrale e 850 nm) in modo uniforme intorno alla piastra dell'agar. Ogni LED dovrebbe essere a circa 5 cm di distanza dal bordo della piastra di agar, e la faccia dell'obiettivo del LED dovrebbe essere ad un angolo verso il basso di 70 gradi verso la piastra di agar. Collegare i LED all'alimentazione tramite il convertitore da AC a DC. NOTA: È meglio fissare le posizioni e gli angoli dei LED luminosi infrarossi per garantire la coerenza della luminosità del campo in varie prove sperimentali e facilitare l'elaborazione video successiva.</li>
	<li>Mettere una scheda nera tra il computer e il dispositivo. Impostare la luminosità dello schermo del computer per evitare che la luce dello schermo del computer influisca sull'esperimento. NOTA: mantenere l'ambiente scuro durante la misurazione della lunghezza d'onda o dell'intensità della luce.</li>
</ol>5. Impostazione dei parametri di imaging
<ol><li>Nel menu del software AMcap, scegliere Opzioni Dispositivo video Formato di acquisizionee impostare le dimensioni in pixel del video acquisito su 800 x 600 e la frequenza fotogrammi a 60 fps.</li>
	<li>Rimuovere il filtro da sotto la fotocamera, mettere un righello sotto la fotocamera e regolare la messa a fuoco della fotocamera per rendere la linea di scala chiara e parallela alla larghezza del campo visivo video.</li>
	<li>Fare clic su Acquisizione . Proprietà Set up ( Configurazione) Acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio, fare clic su Avvia registrazione, registrare la distanza effettiva corrispondente a 600 pixel e calcolare il rapporto di ogni pixel con la distanza effettiva.</li>
</ol>6. Registrazione video del comportamento di prevenzione della luce
<ol><li>Mantenere una temperatura di 25,5 gradi centigradi attraverso tutti gli esperimenti. Controllare la temperatura della stanza con un condizionatore d'aria, se necessario. Mantenere l'umidità costantemente al 60% con un umidificatore.</li>
	<li>Fai un breve video della posizione dell'area luminosa denominata "lightarea1". Quindi, spostare indietro il filtro 850 nm - 3 nm per coprire l'obiettivo della fotocamera. NOTA: durante la registrazione del comportamento larvale, l'obiettivo della fotocamera è coperto dal filtro da 850 nm e 3 nm in modo che il punto luce non venga visualizzato nel video. Il punto luce può essere ricostruito in video con larve in seguito con Matlab. Non modificare la posizione della fotocamera ed evitare di cambiare il rapporto tra ogni pixel e la distanza effettiva misurata nel passaggio 4.3.</li>
	<li>Accendere una luce (cioè una luce di stanza) lontano dal dispositivo sperimentale. Abbassare la luce il più basso possibile, purché le larve possano essere chiaramente viste con gli occhi. Togliere le larve dal mezzo di coltura con un cucchiaio, scegliere delicatamente una larva di terza stella e lavarla pulita con acqua distillata. Fare attenzione a lavare la larva uno alla volta per evitare interferenze dalla fame. Un singolo esperimento richiede almeno 20 larve.</li>
	<li>Trasferire la larva al centro della piastra di agar posta sotto la fotocamera durante il passaggio 3.3. Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso dalla larva con un pennello o utilizzare la carta gonfia per rimuovere l'acqua dalla larva per evitare la riflessione della luce sotto la lente. Spegnere la luce della stanza e lasciare che la larva acclimatare per 2 min in ambiente buio.</li>
	<li>Accendere la luce LED per generare luce infrarossa, e spazzolare delicatamente la larva al centro della piastra. Quando la larva inizia a strisciare dritto, ruotare la piastra per rendere la testa della larva verso il punto di luce. Assicurarsi che striscia dritto dall'inizio, altrimenti potrebbe non ottenere l'accesso al punto luce.</li>
	<li>Fare clic su Acquisizione . Proprietà Set up ( Configurazione) Acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio, quindi fare clic su Avvia registrazione per registrare. Lasciare che la larva striscia verso il punto di luce, entrare nel punto di luce, quindi lasciare il punto di luce fino a quando non è quasi fuori dal campo visivo. Fare clic su Interrompi registrazione. Se la larva si allontana dal punto luce prima di avvicinarsi, fare clic direttamente su Interrompi registrazione.</li>
	<li>Allontanare il filtro dalla fotocamera. Prendere un breve video della posizione del punto luce denominato "lightarea2" e confrontarlo con "lightarea1" per assicurarsi che la posizione della luce non venga modificata. Se si osserva un'ovvia modifica della posizione, eliminare i dati.</li>
</ol>7. Analisi dei dati
<ol><li>Utilizzare SOS17 per estrarre i parametri di contorno e movimento del corpo animale dai video utilizzando i metodi di elaborazione delle immagini come descritto in precedenza17. NOTA: Sono stati utilizzati parametri quali headSpeed (velocità della testa larvale), tailSpeed (velocità della coda larvale), midSpeed (velocità del punto medio larvale della linea scheletrica) e cmSpeed (velocità del centroide larvale). Parametri tra cui headTheta (l'angolo tra le linee di head-midpoint e midpoint-tail) e headOmega (la velocità di cambio di headTheta) sono stati utilizzati per misurare la flessione larvale del corpo e la velocità angolare della piegatura.</li>
</ol>

<ol><li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669(1971).</li>
<li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li>
<li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%3A+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337(1999).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293(2005).</li>
<li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527(2011).</li>
<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li>
<li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868(2013).</li>
<li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications.+9%22%5BJournal%5D)">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li>
<li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li>
<li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113(2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li>
<li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin.+Feb%22%5BJournal%5D)">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li>
<li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li>
<li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237(2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921(2010).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo presenta il saggio light spot per testare la capacità delle larve di Drosophila di fuggire dalla luce. Questo analisi consente di tracciare il comportamento delle larve prima di entrare, durante l'incontro e dopo aver lasciato un punto luce. I dettagli del movimento larvale possono essere catturati e analizzati. L'anamante del punto luce è molto semplice e possiede una forte praticabilità. Il costo dell'intero dispositivo non è elevato. Nell'esperimento, la luce LED viene utilizzata come sorgen...

Le larve di Drosophila melanogaster mostrano un evidente comportamento che evita la luce durante la fase di foraggiamento. Drosophila fototaxis larvaè è stato in fase di indagine, soprattutto negli ultimi 50 anni1,2,3,4,5,6,7 ,8. Negli ultimi anni, nonostante il fatto che 1) molti neuroni che mediano l'elusione della luce larvale sono stati identificati4,5,9,10,11,12 e 2) il connettoma completo del sistema visivo larvale alla risoluzione delle sinapsi è stato stabilito13, i meccanismi neurali alla base della fototaxis larvale rimangono in gran parte poco chiari.
Un certo numero di saggi comportamentali sono stati utilizzati nello studio fototassi larvali. Possono essere in gran parte divisi in due classi: una che coinvolge gradienti di luce spaziale e l'altra che coinvolge gradienti di luce temporale. Per i saggi di gradiente di luce spaziale, l'arena è divisa in un numero uguale di sezioni in chiaro e buio. L'arena può essere divisa in metà chiara e scura2,4 o quadranti chiari e scuri14,15, o può anche essere separato in quadrati luminosi e scuri alternativi come su una scacchiera7. Di solito, piastre di agar sono utilizzati per il saggio di gradiente di luce spaziale, ma tubi che sono divisi in sezioni chiare e scure alternate possono anche essere utilizzati10,14.
Nella versione precedente dei saggi, l'illuminazione leggera proviene generalmente da sotto le larve. Tuttavia, l'illuminazione nelle versioni più recenti ha origine in gran parte dall'alto, poiché gli occhi larvali (ad esempio, gli organi del Bolwig sensibili alle intensità di luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyngeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyingeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalopharyingeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalofario opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media 16 ) sono contenuti nello scheletro cefalophariongeal opaco con aperture verso l'intensità della luce bassa o media16 la parte anteriore superiore. Questo rende le larve più sensibili alla luce dalle direzioni anteriori superiori rispetto al basso dietro le direzioni7. Per i saggi di sfumatura di luce temporale, l'intensità della luce è spazialmente uniforme nell'arena, ma l'intensità cambia nel tempo. Oltre alla luce temporale ad onde quadrate (cioè lampeggiante on/off o luce forte/debole3,7), la luce temporaneamente variabile che si conforma ad una rampa lineare di intensità viene utilizzata anche8 per misurare la sensibilità delle larve ad un temporaneamente cambiando lo stimolo leggero.
Un terzo tipo di analisi fototaxis è la navigazione direzionale del paesaggio leggero, che coinvolge l'illuminazione dall'alto con un angolo di 45s7. Prima del lavoro di Kane et al.7, solo parametri grossolani come il numero di larve nelle regioni chiare e scure, la frequenza di tornitura e la lunghezza del sentiero sono stati calcolati in analisi fototassis larvali. Dal lavoro di questo stesso gruppo, con l'analisi della registrazione video ad alta risoluzione temporale per fototassi larvali, la dinamica dettagliata del movimento larvale durante il phototaxis (cioè velocità istantanee di diverse parti del corpo larvale, direzione di direzione, angolo di tornitura e la corrispondente velocità angolare) sono stati analizzati7. Così, più dettagli del comportamento fototassi larva sono stati in grado di essere scoperti. In questi saggi, le larve sono testate in gruppi in modo che gli effetti di gruppo non siano esclusi.
Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per lo studio delle risposte comportamentali larve alla stimolazione della luce individuale. Il principale set-up sperimentale consiste in un sistema di stimolazione visiva e in un sistema di imaging a luce infrarossa. Nel sistema di stimolazione visiva, una sorgente luminosa a LED genera un punto luminoso rotondo di 2 cm di diametro su una piastra di agar, dove viene testata la larva. L'intensità della luce può essere regolata utilizzando un driver LED. Il sistema di imaging include una telecamera a infrarossi che cattura il comportamento della larva oltre a tre LED a infrarossi da 850 nm che forniscono illuminazione per la fotocamera. L'obiettivo della fotocamera è coperto da un filtro passa-banda di 850 nm per impedire che la luce proveniente dal sistema di stimolazione visiva entri nella fotocamera, mentre la luce infrarossa può entrare nella fotocamera. Pertanto, l'interferenza della stimolazione visiva sull'imaging è prevenuta. In questo saggio, i dettagli comportamentali delle risposte veloci delle singole larve entro un periodo compreso prima, durante e dopo l'immissione della luce vengono registrati e analizzati.

<table><tbody><tr><td>850 nm &plusmn; 3 nm LED che genera luce infrarossa</td><td>Thorlabs, USA</td><td>PM100A</td><td>Sensori compatibili: Fotodiodo e Termico Gamma di potenza otticaa: da 100 pW a 200 W Gamma di lunghezze d'onda del sensore disponibilia: 185 nm-25 &mu; m Frequenza di aggiornamento del display: 20 Hz Larghezza di banda: DC-100 kHz Gamma del sensore del fotodiodob: 50 nA-5 mA Gamma del sensore a termopilab: 1 mV-1 V</td></tr><tr><td>Convertitore da CA a CC</td><td>Thorlabs, USA</td><td>S120VC</td><td>Dimensione dell'apertura: &Oslash; 9,5 mm Gamma di lunghezze d'onda: 200-1100 nm Gamma di potenza: 50 nW-50 mW Tipo di rivelatore: Si Fotodiodo (UV esteso) Linearità: &plusmn; 0,5% Incertezza di misura: &plusmn; 3% (440-980 nm), &plusmn; 5% (280-439 nm), &plusmn; Filtro passa-banda 7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td></tr> <tr><td></td><td>Thorlabs, USA</td><td>DC2100</td><td>LED Gamma di corrente: 0-2 A Risoluzione di corrente LED: 1 mA Precisione di corrente LED: &plusmn; 20 mA LED Tensione diretta: 24 V Gamma di frequenza di modulazione: 0-100 kHz Onda sinusoidale Modulazione:</td></tr><tr><td>Luce blu LED collimata arbitraria&nbsp;</td><td>ELP, Cina</td><td>USBFHD01M</td><td>Max. Risoluzione: 1920X1080 F6.0 mm Sensore: 1/2.7" CMOS OV2710</td></tr><tr><td>Console di misurazione della potenza compatta&nbsp;</td><td>Ocean Optics, USA</td><td>USB2000+(RAD)</td><td>Dimensioni: 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Peso: 190 g Rivelatore: Sony ILX511B (array CCD lineare al silicio a 2048 elementi) Gamma di lunghezze d'onda: 200-850 nm Tempo di integrazione: 1 ms - 65 secondi (20 secondi tipici) Gamma dinamica: 8,5 x 10^7 (sistema); 1300:1 per una singola acquisizione Rapporto segnale/rumore: 250:1 (segnale completo) Rumore scuro: 50 conteggi RMS Reticolo: 2 (250 - 800 nm) Fessura: SLIT-50 Lente di raccolta del rivelatore: L2 Ordinamento degli ordini: OFLV-200-850 Risoluzione ottica: ~2,0 nm FWHM Luce diffusa: < 0,05% a 600 nm; < 0,10% a 435 nm Connettore in fibra ottica: SMA da 905 a 0,22 ad apertura numerica in fibra a filo singolo</td></tr><tr><td>Driver LED ad alta potenza</td><td>Minhongshi, Cina</td><td>MHS-48XY</td><td>Tensione di lavoro: DC12V Lunghezza d'onda centrale: webcam ad alta risoluzione da 850 nm</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs, USA</td><td>MWWHL4</td><td>Colore: bianco caldo Temperatura di colore correlata: 3000 K Corrente di prova per la potenza tipica del LED: 1000 mA Corrente massima (CW): 1000 mA Larghezza di banda (FWHM): N/A Potenza elettrica: 3000 mW Angolo di visione (angolo completo): 120 Dimensioni dell'emettitore: 1 mm x 1 mm Durata tipica: >50.000 h Temperatura di funzionamento (senza condensa): Da 0 a 40 &deg C Temperatura di stoccaggio: da -40 a 70 gradi C Gruppo di rischio: RG1 LED Gruppo a Basso</td></tr><tr><td>Rischio Bianco Caldo</td><td>Mega-9, Cina</td><td>BP850/22K</td><td>&Oslash; 25,4 (+0~-0,1) mm Larghezza di banda: 22&plusmn; 3nm Trasmittanza di picco: 80% Lunghezza d'onda centrale: 850nm&plusmn; 3 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Spettrometro&nbsp;</td><td>Noel Danjou</td><td>Amcap9.22</td><td>AMCap&nbsp; è un'applicazione di acquisizione di immagini fisse e video con funzionalità avanzate di anteprima e registrazione. Si tratta di un'applicazione desktop progettata per computer con Windows 7 SP1 o versioni successive. La maggior parte Video-per-Windowse&nbsp; I dispositivi compatibili con DirectShow sono supportati, indipendentemente dal fatto che si tratti di webcam economiche o di schede di acquisizione video avanzate.</td></tr><tr><td>Sensore di potenza a fotodiodo standard&nbsp;</td><td>Super Dragon, Cina</td><td>YGY-122000</td><td>Ingresso: CA 100-240 V ~ 50 / 60 Hz 0,8 A Uscita: CC 12 V 2 A</td></tr><tr><td>Sensore di potenza termica...</td><td>Thorlabs, USA</td><td>M470L3-C1</td><td>Colore: Blu Lunghezza d'onda nominalea: 470 nm Larghezza di banda (FWHM): 25 nm Corrente massima (CW): 1000 mA Tensione diretta: 3,2 V Potenza elettrica (max): 3200 mW Dimensioni dell'emettitore: 1 mm x 1 mm Durata tipica: 100 000 h Temperatura di esercizio (senza condensa): da 0 a 40 gradi C Temperatura di stoccaggio: da -40 a 70 gradi C Gruppo di rischiob: RG2 Gruppo a rischio moderato</td></tr><tr><td>Sensore di potenza termica&nbsp;</td><td>Thorlabs, USA</td><td>S401C</td><td>Gamma di lunghezze d'onda: 190 nm-20 &mu; m Gamma di potenza ottica: 10 &mu; W-1 W(3 Wb) Dimensione dell'apertura di ingresso: &Oslash; 10 mm Area del rivelatore attivo: 10 mm x 10 mm Densità di potenza ottica massima: 500 W/cm2 (Media) Linearità: &plusmn; 0,5%</td></tr></tbody></table>

analisi basata su macchie di luce per l'analisi di drosophila larval phototaxis

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Le larve di Drosophila melanogaster mostrano un evidente comportamento che evita la luce durante la fase di foraggiamento. La fototassia larvale della Drosophila può essere usata come modello per studiare il comportamento di evitamento degli animali. Questo protocollo introduce un saggio spot per studiare il comportamento fototattico larvale. Il set-up sperimentale include due parti principali: un sistema di stimolazione visiva che genera la luce leggera e un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa che registra il processo di prevenzione della luce larvale. Questo analisi consente di tracciare il comportamento della larva prima di entrare, durante l'incontro e dopo aver lasciato il punto luce. I dettagli del movimento larvale, tra cui decelerazione, pausa, colata e tornitura della testa, possono essere catturati e analizzati utilizzando questo metodo.

Secondo il protocollo, il saggio di luce è stato utilizzato per studiare il comportamento di elusione della luce della terza larva instella che sono stati allevati a 25 gradi centigradi su un mezzo standard in una stanza con un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h. Una singola larva w1118 è stata testata utilizzando l'assaggio del punto luce a 25,5 gradi centigradi. L'intensità media della luce del punto luce generata da un LED di 460 nm è stata di 0,59 w/cm2. L'intero processo di entrata e usc...

Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per studiare il comportamento fototattica larvale della Drosophila. In questo analisi, un punto luce viene generato come stimolazione della luce e il processo di prevenzione della luce larvale è registrato da un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa.

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Utilizzando il saggio del punto luce, il comportamento per le larve può essere monitorato prima, durante e dopo essere entrato nell'area luminosa consentendo di analizzare il dettaglio del movimento larvale. Questo test è semplice e facile da eseguire. La risposta alla luce viene testata una sola volta, in modo da escludere qualsiasi possibile effetto dell'adattamento alla luce.Per preparare le piastre di agar, coprire lentamente e uniformemente il fondo di una piastra di Petri di 15 centimetri con uno strato di circa quattro millimetri di agar caldo dell'1%. Lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente fino a quando l'agar non si è solidificato. Per configurare il sistema di stimolazione visiva, agganciare una sorgente luminosa LED preparata su un telaio in ferro, facendo attenzione che la luce si progetti verso il desktop.Inclinare leggermente il cilindro fino a quando l'angolo tra il piano del cilindro e il piano verticale è di circa 10 gradi. Collegare la luce LED blu 470 nanometri al LED una spina del driver LED ad alta potenza e accendere il driver. Ruotare la manopola nell'angolo superiore destro del driver per selezionare il canale 470 nanometri e fare clic su LED

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In questo articolo il video, si descrive un metodo nuovo che consente la costruzione di gradienti di odorizzante con geometrie stabili e controllabili. Abbiamo brevemente illustrare come questi gradienti possono essere usati per lo screening dei difetti olfattivi (anosmia totale e parziale) e di studiare le caratteristiche più sottili del comportamento chemiotassi.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

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Metodi per test Drosophila Comportamento

Le larve di Drosophila sono sensibili alla luce e rispondono ai cambiamenti della luce circostante. Questo video descrive un test che verifica la loro capacità di evitare la luce, chiamato saggio del punto luminoso. Il protocollo presentato mostra come impostare il test con un LED a luce blu e mostra come registrare il comportamento dell'animale in risposta all'incontro con la luce.

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Qui si descrive un test di preferenza chiaro-scuro per Drosophila larva. Questo test fornisce informazioni sulla regolazione innata e circadiano di luce di rilevamento ed elaborazione photobehavior.

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High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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