Prospezione ceppi microbici per biorimediazione e lo sviluppo di probiotici per la ricerca e la conservazione dei metaorganismi

Possiamo isolare e assemblare probiotici che possono promuovere la salute dei coralli e allo stesso tempo mitigare l'impatto dall'inquinamento e che possono contribuire alla persistenza di una barriera corallina nel mondo che cambia. L'approccio di isolamento e screening descritto può essere utilizzato per selezionare microrganismi che presentano attività metaboliche chiave come la degradazione degli inquinanti o altre caratteristiche benefiche per organismi marini come i coralli. Questo metodo può essere applicato per isolare microrganismi in grado di degradare eventuali contaminanti.

Inoltre, altre fonti di materiale possono essere utilizzate negli altri campioni ambientali come piante, suolo, acqua, qualsiasi cosa. Studia la letteratura e cerca di concentrarti su ceppi che possono essere buoni candidati per il tuo scopo. Se possibile, dirigere i metodi di isolamento per tali ceppi ed evitare agenti patogeni noti.

E se si sta cercando di utilizzare un consorzio di batteri, è anche molto importante prima indagare se i membri del consorzio hanno attività antagonistiche l'uno contro l'altro. Poiché i coralli sono sempre più a rischio di estinzione, questa metodologia sta iniziando ad essere avviata in tutto il mondo e c'è bisogno di diffondere e standardizzare il metodo. Poiché alcuni ricercatori di corallo non hanno esperienza con la microbiologia convenzionale, ecco perché hanno spesso chiesto consigli su come procedere con tale approccio.

Per iniziare, da ogni sito di campionamento mirato, utilizzare bottiglie sterili con tappi a vite per raccogliere 500 millilitri di acqua in triplice copia. Se la lavorazione del campione avviene in seguito, mantenere le bottiglie a quattro gradi Celsius. Utilizzare una coppia sterile di pinze e pinze per tagliare frammenti di corallo dallo stesso sito di campionamento dei campioni d'acqua.

Risciacquare il frammento di corallo campione utilizzando 20 millilitri di soluzione salina sterile al 3% o acqua di mare artificiale per sbarazzarsi dei batteri liberi dell'acqua di mare liberamente attaccati. Utilizzando le forcep, posizionare ogni frammento di corallo in un contenitore sterile con un tappo a vite contenente soluzione salina sterile. Utilizzando pinze e pinze sterili, pesare cinque grammi di frammenti di corallo in sterili piastre di Petri su una bilancia.

Trasferire i cinque grammi di campione di corallo in un mortaio sterile e macerare utilizzando un pestello sterile. Utilizzando una spatola sterile, trasferire il campione macerato in un pallone da coltura sterile contenente 25 millilitri di soluzione sterile di cloruro di sodio al 3% e da 10 a 15 perline di vetro di 2,5 millimetri. Utilizzare una soluzione salina sterile da 20 millilitri per lavare la malta nel tubo per recuperare la quantità massima del macerato.

Per staccare i microrganismi da diversi compartimenti corallo, tenere i contenitori sotto agitazione costante a 150 volte g per 16 ore alla temperatura dell'acqua del sito di campionamento. Per selezionare i batteri, eseguire prima diluizioni seriali fino a 10 a nove negative in soluzione salina sterile per campioni di corallo e fino a 10 a sei negative per campioni d'acqua. Le diluizioni della pipetta su e giù cinque volte prima di scartare la punta.

Quindi vortice ciascuno. Vortice i campioni per cinque secondi ogni volta prima di eseguire la successiva diluizione seriale. Pipetta 100 microlitri di ogni diluizione su piastre di Petri contenenti 3%di sodio cloruro di lisogenia brodo agar medio e placcarli.

Incubare le piastre per uno o tre giorni alla temperatura target, ad esempio 26 gradi Celsius. Controllare i piatti una volta al giorno. Selezionare e isolare le colonie che presentano morfologie di crescita distinte su nuove piastre utilizzando la tecnica della piastra striata.

Ripeti questo passaggio tutte le volte che è necessario per far crescere colonie pure sulle piastre. Conservare gli isolati a quattro gradi Celsius o in glicerolo come descritto nel manoscritto. Per eseguire il test di capacità di degradazione EE2, raccogliere una singola colonia dalle piastre fresche e inoculare in due millilitri di mezzo LB sterile in un tubo.

Nel caso in cui si tratta di uno stock di glicerolo, prendere 10 microlitri di calcio batterico di glicerolo e striature su piastre di agar LB. Incubare a 24-28 gradi Celsius durante la notte per far crescere singole colonie. Posizionare il tubo contenente LB medio inclinato sotto agitazione costante a 150 volte g a 24-28 gradi Celsius durante la notte.

Dopo la crescita batterica, pelletare le cellule centrifugandole a 8.000 volte g per otto minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante. Per lavare il brodo LB rimanente, aggiungere due millilitri di acqua salina per rimorsi le cellule.

Ripetere il lavaggio due volte per garantire che non ci siano tracce di fonte di carbonio. Inoculare le cellule lavate e rimescolate nel mezzo di coltura minimo Bushnell Haas contenente EE2 come unica fonte di carbonio. Valuta la crescita batterica per densità ottica a 600 nanometri e le nostre unità di formazione della colonia sul mezzo agar LB dopo 16-72 ore di incubazione.

Per preparare un supporto minimo contenente una frazione solubile olio-acqua e una frazione insolubile olio-acqua come unica fonte di carbonio, aggiungere l'1-2% di petrolio greggio a 500 millilitri di acqua distillata sterile in un pallone filtrante contenente una valvola sul fondo. Mantenere il pallone sotto agitazione costante a 24-28 gradi Celsius a 150 volte g per 48 ore. Successivamente, posizionare il pallone su una superficie stabile e attendere da 10 a 20 minuti per consentire la separarsi della frazione solubile e insolubile.

Quindi aprire il pallone filtrante inferiore per trasferire la frazione solubile olio-acqua in un nuovo pallone sterile risparmiando la frazione insolubile olio-acqua. Quindi preparare due bottiglie di Bushnell Haas agar mezzo minimo. Autoclave.

Combinare con la frazione solubile olio-acqua come unica fonte di carbonio per realizzare 500 millilitri di mezzo agar. Fare lo stesso con la frazione insolubile olio-acqua e trasferire circa 25 millilitri di ogni mezzo su singole piastre di Petri. Per isolare i batteri degradanti dell'olio, riutilizzare campioni precedentemente diluiti e pipettare 100 microlitri di ogni diluizione sulle piastre di Petri contenenti mezzo agar e placcarli.

Ricorda di mantenere i controlli negativi per le tue piastre. Incubare i piatti per uno o tre giorni alla temperatura target e ripetere le procedure di isolamento come in precedenza. In questo protocollo, i microrganismi sono stati isolati da diverse fonti d'acqua e nubbine coralline che presentano caratteristiche putative BMC e in grado di degradare diverse classi di contaminanti.

Utilizzando campioni d'acqua raccolti in un impianto di trattamento delle acque reflue ottenuto dal Centro sperimentale di igiene ambientale dell'Università Federale di Rio de Janeiro, sono stati isolati 33 ceppi batterici in grado di degradare EE2. Inoltre, utilizzando la tecnica per selezionare i batteri degradanti dell'olio, sono stati isolati 20 ceppi in grado di degradare sia la frazione solubile olio-acqua che la frazione insolubile olio-acqua. Le caratteristiche putative del BMC sono state proiettate in microrganismi, tra cui un ceppo che presenta una forte attività antagonista contro l'agente patogeno corallo Vibrio cholerae lyticus, sono stati trovati ceppi in grado di degradare l'urea, un buon produttore di catalasi, e microrganismi che presentano geni potenzialmente benefici.

Utilizzando sia il biorimediamento che l'inoculazione del BMC, è stato possibile prevedere i coralli dagli impatti dell'esposizione all'olio. Un consorzio PBMC bioremediatore petrolifero isolato dal corallo è stato inoculato su nubbine coralline esposte all'1% di olio. Ha mostrato una migliore capacità fotochimica preservata rispetto alla salute dei coralli senza inoculazione.

Non lasciare campioni a temperatura ambiente per troppo tempo. In caso contrario, la comunità microbica può cambiare e i microbi correlati alle malattie possono sovrascrivarne altri. Il petrolio greggio è tossico.

Si prega di assicurarsi di utilizzare dispositivi di protezione individuale appropriati quando si lavora con questo o qualsiasi altro contaminante che si decide di utilizzare. La tecnica ha spianato un modo innovativo nel campo del ripristino dei coralli e del bioremediamento oceanico può potenzialmente essere utilizzata per ridurre al minimo gli impatti economici, ecologici e sociali causati dal cambiamento globale.