Determinazione delle relazioni di auto-compatibilità in Apricot Combinando l'impollinazione manuale, la microscopia e le analisi genetiche

Questo metodo può aiutare a determinare i requisiti di impollinazione in diverse specie e stabilire relazioni di incompatibilità tra cultivar. Il vantaggio principale di questo approccio è che consente di valutare diverse incompatibilità in condizioni di laboratorio. Evitare i numerosi problemi che possono verificarsi negli esperimenti eseguiti in condizioni di campo.

Ciò consente l'identificazione insieme alla dedizione di un certo numero di cultivar ai corrispondenti gruppi di incompatibilità. Determinazione della relazione di intercompatibilità tra cultivar. Questo approccio può anche essere utile per determinare l'autoincompatibilità e la relazione di incompatibilità in altre colture di alberi da frutto come ciliegia o prugna.

Inizia assaggiando i fiori nel campo. Raccogli i fiori in fase di palloncino, che corrisponde allo stage 58 sulla scala BBCH per l'albicocca per evitare l'impollinazione precedente. In laboratorio, rimuovere le anthers dei fiori e posizionarle su un pezzo di carta per asciugare a temperatura ambiente.

Dopo 24 ore setacciare i grani di polline con una sottile rete da 26 millimetri. Eviculare un gruppo di 30 fiori nella stessa fase di sviluppo del palloncino per ogni autoimpollinazione e cross-impollinazione e posizionare le pistole sulla schiuma fioraio in acqua 24 ore dopo l'emaculazione e impollinare le pistole usando un pennello con polline dai fiori della stessa cultivar. Impollinare un altro set di pistole di ogni cultivar con polline dai fiori di un impollinatore compatibile come controllo.

Dopo 72 ore, rimuovere le pistole dalla schiuma fioraia bagnata e fissare le pistole in una soluzione fissativa di etanolo 3:1 in acido acetico per almeno 24 ore a 4 gradi Celsius. Quindi scartare il fissatore e aggiungere il 75% di etanolo, assicurandosi che i campioni siano completamente immersi nella soluzione. I campioni possono essere conservati nell'etanolo a 4 gradi Celsius fino all'uso.

Spargere i granelli di polline delle stesse cultivar utilizzate per le impollinazioni di controllo nel mezzo di germinazione del polline solidificato e osservarli al microscopio dopo 24 ore. Preparare le pistole per la microscopia lavandole 3 volte con acqua distillata per un'ora per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciarli in solfito di sodio al 5% a 4 gradi Celsius per 24 ore.

Quindi autoclavarli a un chilogrammo per centimetro squadrato per 10 minuti in solfito di sodio per ammorbidire il tessuto. Posizionare le pistole autoclavate sopra uno scivolo di vetro e usare un bisturi per rimuovere i tricomi intorno all'ovaio. Quindi schiacciare la pistola con un coverglass.

Applicare una goccia di blu anilina sui preparati per macchiare le deposizioni inchiodate durante la crescita del tubo di polline e osservare i tubi di polline lungo lo stile con un microscopio secondo le indicazioni manoscritte. Usa un kit commerciale per estrarre il DNA genomico da giovani foglie raccolte in primavera. Quindi impostare la PCR combinando i reagenti in base alle indicazioni manoscritte.

Vortice del mix di reazione e distribuzione tra i pozzi nella piastra PCR. Aggiungere 1 microlitro della diluizione del DNA in ogni pozzo ed eseguire pcr utilizzando il programma di termo-ciclismo delineato nel manoscritto. Una volta completata la reazione, analizzare i risultati utilizzando elettroforesi capillare o elettroforesi a gel di agarosio.

Per l'elettroforesi capillare aggiungere 1 microliter del prodotto PCR nel pozzo della piastra lettore insieme a 1 goccia di olio minerale per evitare l'evaporazione dell'acqua. Quindi preparare la piastra di separazione aggiungendo il tampone di separazione. Utilizzare il software commerciale per l'analizzatore genico per creare una nuova piastra campione e salvare i nomi dei campioni per tutti i pozzi sulla piastra.

Quindi selezionare il metodo di analisi e inserire le due piastre nell'analizzatore genico. Riempire l'array capillare con acqua distillata. Caricare il gel lineare in poliacrilammide e fare clic su Esegui.

Se si analizzano i risultati della PCR con elettroforesi del gel, preparare un gel di agarosio dell'1% sciogliendo l'agarosio nel buffer di funzionamento dell'elettroforesi secondo le indicazioni manoscritte. Quindi aggiungere 4 microlitri di macchia di acido nucleico al gel e mescolare delicatamente. Impostare un vassoio di gel con un pettine e rallentare versare il gel nel mezzo facendo attenzione ad evitare bolle.

Lasciare il gel a temperatura ambiente fino a completa solidifica, circa 30-45 minuti. Quindi mettere nella camera di elettroforesi. Rimuovere il pettine e coprirlo con 1 tampone TAE.

Caricare il gel con la scala del DNA seguita dai prodotti PCR mescolati con colorante di carico. Quindi eseguire il gel a 90 volt per 60-90 minuti fino a quando la linea di tintura blu è a circa il 75% della corsia di gel. Una volta completata l'esecuzione, visualizzare il gel utilizzando un transilluminatore.

La crescita del tubo di polline nelle autoimpollinazioni e incrociate è stata osservata dalla microscopia a fluorescenza per determinare l'autocompatibilità per ogni cultivar. Le cultivar erano considerate auto-incompatibili quando la crescita del tubo di polline fu arrestata e autocompatibile quando almeno un tubo di polline raggiunse la base dello stile. 5 combinazioni di coppie di primer sono state utilizzate per identificare gli alleli S utilizzando PCR in combinazione con elettroforesi capillare o gel.

In primo luogo, gli alleli S furono identificati dall'amplificazione del primo introne S-RNasi usando la coppia di primer SRc. Quindi il secondo introne della RNasi fu amplificato con tre set di primer per distinguere gli alleli S6, S9, S1 e S7. E le regioni variabili V2 e HVB del gene SFB sono state amplificate con il primer AprFBC8 impostato per identificare gli alleli Sc e S8.

Una volta identificati gli alleli S, è possibile stabilire diversi gruppi di incompatibilità con i genotipi inter incompatibili. È importante ricordare di usare il controllo nell'elettroforesi capillare, poiché usano un sistema automatico di analisi dei frammenti che può segnalare come maggiori differenze nelle dimensioni dei frammenti causando un'identificazione imprecisa dell'allele. La combinazione di osservazioni di microscopia e analisi genetica ha portato ad un approccio molto utile per determinare l'autoincompatibilità nell'albicocca e stabilire le relazioni di incompatibilità tra cultivar.

L'autoincompatibilità è ora il collegamento con la gente del posto in albicocca. La determinazione dei fattori sembra essere coinvolta. Gli sforzi futuri devono essere concentrati sull'edificazione genetica di questa cultivar nell'albicocca.

La combinazione di questo approccio documentario si traducono in preziose informazioni per l'appropriata selezione di cultivar in frutteti commerciali e genotipi di modelli nei programmi di allevamento di albicocche. Un approccio simile può essere utilizzato in altre colture legnose perenni.