Consegna intratecala di Oligonucleotidi Antisense nel Rat Central Nervous System
29 ottobre 2019
Qui, descriviamo un metodo per fornire farmaci al sistema nervoso centrale del ratto impiantando un catetere nello spazio lombare intrateco della colonna vertebrale. Ci concentriamo sulla consegna di oligonucleotidi antisenso, anche se questo metodo è adatto per la consegna di altre modalità terapeutiche pure.
Questo protocollo consente la somministrazione diretta di terapie nel sistema nervoso centrale del ratto per valutare la farmacocinetica, la farmacodinamica e l'efficacia di nuove terapie nei modelli di malattia del ratto. Questa procedura è sicura, efficace e non richiede attrezzature costose o strumenti chirurgici. A dimostrare la procedura saranno Yi Chen e Yi Luo, ricercatori del mio laboratorio.
Per preparare le speciali cannule guida, utilizzare uno strumento rotante con una ruota tagliata per tagliare entrambe le estremità di un ago calibro 19 per ottenere una cannula guida lunga circa uno e mezzo o due centimetri. Quindi utilizzare la mola dell'utensile rotante per levigare entrambe le estremità. Per preparare l'assemblaggio del filo del catetere, tagliare un pezzo lungo otto centimetri di tubi PE10 di 011 pollici di diametro per fungere da catetere intratecale per ogni animale.
Utilizzare una penna marcatore resistente all'etanolo per ottenere un segno a due centimetri da un'estremità di ogni pezzo di tubo. Per ogni animale, inserire un filo di stylet lungo 11 centimetri tagliato dal filo di acciaio inossidabile rivestito in politetrafluoroetilene nel lume del catetere PE10 di otto centimetri. Per preparare l'assemblaggio del catetere di consegna, tagliare un pezzo di catetere PE50 da cinque a 10 centimetri di diametro 023 pollici e inserire un adattatore tubo di 23 calibri in un'estremità del catetere.
Quindi inserire un ago calibro 30 con un mozzo tagliato in un pezzo di tubi PE10 di circa 0,5 centimetri e collegare il tubo PE10 all'altra estremità del catetere. Per preparare un assemblaggio di cannula-ago guida, posizionare una cannula guida all'estremità di un ago calibro 23. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, posizionare una pastiglia riscaldante sul tavolo dell'intervento chirurgico e coprire il pad con un foglio di drappo sterile.
Posizionare un tubo di centrifuga conica da 50 ml sul foglio e confermare la mancanza di risposta al pizzico nel ratto sperimentale anestetizzato. Dopo aver pesato l'animale, radere la schiena dalla coda alla colonna vertebrale toracica caudale e posizionare il ratto rasato sul foglio sterile in posizione prona. Posizionare il tubo da 50 ml sotto l'addome per flettere la colonna vertebrale nella regione lombare e applicare un unguento oftalmico agli occhi.
Successivamente, iniettare per via sottocutanea un milligrammo per chilogrammo di buprenorfina a rilascio prolungato e pulire la pelle esposta con povidone sequenziale e scrub alcool. Drappeggiare l'animale con un foglio trasparente sterile fenestrato. Per il posizionamento del catetere e l'iniezione del composto, identificare le due fosse naturali tra i muscoli sopra il bacino rasato e, con una mano che tiene le fosse, utilizzare l'altra mano per premere delicatamente e sentire la colonna vertebrale dalla direzione caudale a quella rostrale per individuare la prima indentazione principale tra le vertebre.
Dopo aver identificato lo spazio intervertebrale tra le vertebre S1 e L6, muoversi leggermente rostralmente per identificare lo spazio intervertebrale tra le vertebre L5 e L6. Usa un bisturi per fare un'incisione lunga non più di due centimetri nella pelle e nella capsula muscolare in questo sito lungo la linea mediana dalla direzione rostrale a quella caudale in modo che il sito di iniezione sia al centro dell'incisione. Utilizzare le forbici di dissezione per sezionare il tessuto connettivo fino a quando lo strato muscolare non può essere visualizzato.
Fare un'incisione di un centimetro nella capsula muscolare immediatamente laterale al processo spinale dorsale della vertebra lombare L6. Posizionare l'assemblaggio dell'ago della cannula guida vicino all'aspetto anteriore della sesta vertebra lombare e spingere l'assemblaggio nello spazio intervertebrale lungo l'aspetto anteriore della sesta vertebra in modo che l'estremità dell'ago penetri nel canale spinale. Utilizzare pini smussati per localizzare il processo spinale dorsale della vertebra lombare L6, quindi spingere l'ago lungo l'aspetto anteriore della sesta vertebra nello spazio invertebrata.
Spingere la cannula guida in posizione lungo l'ago, rimuovere l'ago e inserire l'assemblaggio del filo del catetere nella cannula guida. Inclinando il catetere con un angolo di circa 45 gradi rispetto al canale spinale, forzare l'estremità del catetere di circa 0,3 centimetri nel canale. Rimuovere il filo di stile a circa 2,5 centimetri dalla punta intratecale del catetere e far avanzare il catetere nel canale spinale fino a quando la marcatura dei due centimetri sul catetere è appena visibile sotto il muscolo.
Quando il catetere è in posizione, rimuovere la cannula guida per lasciare il catetere e il filo di stile in posizione. Far avanzare il catetere nel canale spinale fino a quando il segno dei due centimetri è all'ingresso del canale e ritirare completamente il filo di stile. Il fluido spinale cerebrale può essere visualizzato entrando nel catetere impiantato.
Quindi collegare il gruppo del catetere di erogazione all'estremità distale del catetere impiantato tramite l'estremità dell'ago calibro 30. Successivamente, caricare 60 microlitri di soluzione salina sterile in una siringa da 100 microlitri e caricare un bolo di 30 microlitri del composto in esame in una seconda siringa. Collegare la siringa salina all'estremità dell'adattatore di tubazione dell'assieme del catetere di erogazione e sciacquare 20 microlitri di soluzione salina sterile nello spazio intratecale.
Una volta che tutta la salina è stata lavata, sostituire la siringa salina con la siringa caricata con bolo e iniettare 30 microlitri del composto in esame nello spazio intratecale per un periodo di 30 secondi. Una volta che tutto il bolo è stato consegnato, sostituire la siringa caricata di bolo con un'altra siringa caricata salina e sciacquare il catetere con altri 40 microlitri di soluzione salina. Una volta consegnato il secondo volume di soluzione salina, staccare il gruppo del catetere di erogazione dal catetere impiantato e utilizzare un paio di pinze di dissezione sterilizzate termicamente molto calde per bloccare il tubo per tagliare e sigillare termicamente il catetere impiantato.
Utilizzare suture monofilamento assorbibili per fissare il catetere termo-sigillato al tessuto connettivo e quindi utilizzare suture non assorbibili per chiudere la pelle. Quindi utilizzare garza e soluzione salina per lavare il sangue dalla pelle e posizionare il topo in un'incubatrice riscaldata con monitoraggio fino alla piena ricompitenza. In questo esperimento rappresentativo, un'ottima abbattimento è stata ottenuta in tutte le regioni raccolte dopo la consegna di oligonucleotide antisense singolo bolo come dimostrato.
Tuttavia, è stato misurato un certo grado di variabilità regionale con il midollo spinale che presenta la più alta percentuale di abbattimento. Dopo un'iniezione riuscita dell'oligonucleotide antisense, o altre terapie, in un modello appropriato, si possono valutare la farmacocinetica, la farmacodinamica e l'efficacia delle terapie.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per somministrare farmaci, in particolare oligonucleotidi antisenso, direttamente al sistema nervoso centrale del ratto mediante impianto di un catetere nello spazio intratecale lombare. Il protocollo pone l'accento su sicurezza, efficacia e accessibilità, in quanto non richiede attrezzature costose.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Farmacologia
- Metodi sperimentali
Sfondo
- Il sistema nervoso centrale svolge un ruolo fondamentale in numerosi processi biologici e malattie.
- La somministrazione mirata di farmaci può aumentare l'efficacia degli agenti terapeutici.
- Gli oligonucleotidi antisenso rappresentano una promettente strategia terapeutica per i disturbi del sistema nervoso centrale.
- I metodi precedenti possono essere costosi o tecnicamente complessi, limitandone l'uso nella ricerca.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo semplice per la somministrazione di farmaci nel sistema nervoso centrale del ratto.
- Valutare la farmacocinetica, la farmacodinamica e l'efficacia di nuovi farmaci in modelli di malattia.
- Facilitare ulteriori ricerche mediante un metodo sicuro ed economico.
Metodi Utilizzati
- Lo studio impiega una tecnica di impianto di catetere.
- Il modello biologico utilizzato è il ratto, specificamente per somministrare sostanze nello spazio intratecale della colonna vertebrale.
- Non vengono menzionati flussi di lavoro multi-omici.
- Sono forniti protocolli chirurgici dettagliati, inclusi i siti delle incisioni e il posizionamento dei cateteri.
- Sono sottolineate misure di sicurezza e cure postoperatorie per garantire il benessere degli animali durante l'intervento.
Risultati principali
- Il protocollo consente una somministrazione efficace di terapie, con una visualizzazione riuscita dell'ingresso del liquido cerebrospinale nel catetere.
- Elevata efficienza dimostrata nel raggiungere l'abbattimento del composto in diverse regioni, indicando una somministrazione farmacologica efficace.
- I risultati suggeriscono possibili progressi nelle applicazioni terapeutiche per trattamenti mirati al sistema nervoso centrale.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo affidabile per somministrare agenti terapeutici al sistema nervoso centrale, aprendo la strada a ricerche sperimentali migliorate.
- In questo studio non è stata condotta alcuna analisi multi-omiche.
- I risultati sottolineano l'utilità del metodo per lo studio dei meccanismi neuronali e dell'efficacia dei farmaci nei modelli di malattia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La somministrazione intratecale diretta di oligonucleotidi antisenso consente una valutazione precisa della farmacocinetica e della farmacodinamica nei modelli preclinici di malattie del sistema nervoso centrale, aggirando le limitazioni della barriera ematoencefalica. Questo approccio supporta la validazione del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistico confermando l'esposizione al sistema nervoso centrale e l'interazione con il bersaglio. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti leader fornendo dati quantitativi di silenziamento regionale nei tessuti del midollo spinale e del cervello.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche mediante somministrazione diretta nel sistema nervoso centrale di oligonucleotidi antisenso per valutare l'abbattimento dell'RNA bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce un protocollo chirurgico riproducibile per una somministrazione costante del composto tra diversi gruppi di studio.
- Valore predittivo: Rafforza la fiducia sul bersaglio dimostrando una variabilità regionale dipendente dalla dose nell'efficienza di abbattimento.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening dell'efficacia successivo, garantendo un'amministrazione intratecale affidabile del composto.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso volumi di somministrazione del bolo quantificabili e il ricambio di fluidi mediante catetere.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma in diverse modalità terapeutiche oltre agli oligonucleotidi antisenso.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la validazione del bersaglio nella fase di scoperta alla valutazione preclinica attraverso esiti farmacodinamici misurabili nei tessuti del sistema nervoso centrale.
- Avanzamento basato sul rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione definendo soglie regionali di silenziamento che si correlano con il legame al bersaglio.
- Sistema rilevante per la malattia: Utilizza il sistema nervoso centrale del ratto come modello predittivo per valutare la distribuzione e l'efficacia degli oligonucleotidi antisenso.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione dell'efficacia preclinica, consentendo la somministrazione diretta di composti al sistema nervoso centrale e la valutazione dell'esposizione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la somministrazione controllata di terapie mirate al sistema nervoso centrale per valutarne gli effetti specifici.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso procedure standardizzate di impianto del catetere e iniezione in bolo, garantendo un'esposizione riproducibile ai composti.
- Analisi: Evidenzia misurazioni quantitative di variabili dipendenti, come le percentuali di riduzione dell'RNA regionale, che permettono confronti tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica dimostrando la biodistribuzione nel sistema nervoso centrale e la modulazione del bersaglio, elementi rilevanti per l'efficacia terapeutica.
- Riutilizzo aziendale: Presenta la tecnica di impianto del catetere come una capacità riutilizzabile per valutare diverse modalità di somministrazione al sistema nervoso centrale, inclusi oligonucleotidi, peptidi e piccole molecole.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione dell'obiettivo grazie alla dimostrazione diretta dell'esposizione al sistema nervoso centrale e della riduzione meccanicistica dell'obiettivo.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante passaggi chirurgici definiti, marcatori per il posizionamento del catetere e protocolli di scambio dei fluidi.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'interazione con l'obiettivo nel sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta del rischio basata su dati quantitativi di riduzione regionale che informano le decisioni di avanzamento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia stereotassica su roditori e tecniche di accesso al liquor.
- È dipendente da strumentazione chirurgica sterile, inclusi bisturi, pinze e materiali per sutura, necessari per l’impianto del catetere.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi chirurgico, farmacologico e analitico per un’interpretazione coerente dei risultati.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diverse ceppi di roditori e modelli di età, che influenzano l’anatomia spinale e il volume del liquor.
- I limiti pratici includono le percentuali di sopravvivenza post-chirurgica e la pervietà del catetere, che richiedono un monitoraggio postoperatorio per garantire l'affidabilità dei dati.
