Isolamento affidabile dei micronavi del sistema nervoso centrale in cinque gruppi di vertebrati
12 gennaio 2020
L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i microvasi da più regioni del sistema nervoso centrale dei vertebrati lissencefalici e gyrencephalic.
Questo protocollo è significativo perché consente il confronto della microvascolarizzazione tra diverse regioni del sistema nervoso centrale, nonché tra individui diversi. Questa tecnica di isolamento delle microvezze può essere completata in un solo giorno ed elimina la necessità di ultracentrifugazione e dissociazione enzimatica. Rimuovere le meningi e il plesso coroideo può essere difficile.
Assicurati di lavorare lentamente e con attenzione per garantire la completa rimozione di ogni tessuto. Per la dissezione del tessuto del SNC da un piccolo campione di vertebrato lissencefalico, posizionare il cervello raccolto in un tubo conico da 15 millilitri contenente soluzione di MV-1 sul ghiaccio e utilizzare le forcelle per recuperare l'ipofisi dalla sella turcica del cranio. Posizionare l'ipofisi in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri di soluzione MV-1 sul ghiaccio e rimuovere la pelle e il muscolo per esporre la colonna vertebrale.
Dopo aver rimosso gli arti, la gabbia toracica e gli organi interni, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 18 per sciacquare la colonna vertebrale con una soluzione MV-1 fresca, in direzione caudale-rostrale in tutto il foro vertebrale lombare. Quindi posizionare il midollo spinale in un tubo da 5 millilitri contenente soluzione MV-1 fresca. Quindi, posizionare il cervello in una piastra di Petri sotto il microscopio sezionante e rimuovere le meningi con puntura a doppia prozione.
Assicurati di controllare il midollo spinale per assicurarti che non rimangano pezzi di meningi. Usa le forcep per separare l'ipotalamo, il cervelletto, il tronco encefalico e la corteccia. Quando necessario, utilizzare pini e forbici per iris e molla per asportare i bulbi olfattivi e il talamo e utilizzare la puntura a doppia punta per rimuovere tutto il plesso coroideo da tutti i ventricoli cerebrali.
Per la dissezione del tessuto del SNC da un grande campione di vertebrato ginesfalico, utilizzare un microscopio sezionante e una puntura a doppia punta, pinza e forbici per iris e molla per rimuovere le meningi da ogni tessuto del SNC, facendo attenzione a rimuovere eventuali pezzi di plesso coroideo dai ventricoli cerebrali. Per l'omogeneizzazione dei tessuti SNC raccolti, tritare ogni regione del SNC in pezzi da uno a due millimetri all'interno delle singole piastre di Petri. Per omogeneizzare i tessuti del SNC da piccoli campioni di vertebrati, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere un millilitro di soluzione MV-1 per sospendere il tessuto tritato.
Quindi utilizzare la stessa pipetta di trasferimento per erogare la corteccia, il cervelletto, lo stelo cerebrale, il lobo ottico e i pezzi del midollo spinale in singole smerigliatrici di tessuto di vetro da 10 millilitri e utilizzare un pestello PTFE e cinque millilitri di soluzione MV-1 per macinare ogni set di tessuti per circa 10 colpi. Trasferire ogni liquame tissutale in singoli tubi conici da 15 millilitri sul ghiaccio e utilizzare le forcelle per posizionare l'ipotalamo e l'ipofisi in 100 microlitri di soluzione MV-1, in singoli tubi da 1,7 millilitri. Quindi, omogeneizzare attentamente ogni tessuto con una micropestle di vetro.
Per omogeneizzare un grande campione di vertebrato, utilizzare una pipetta di trasferimento a taglio smussato per trasferire il tessuto tritato a una smerigliatrice di tessuto di vetro da 55 millilitri e attaccare la smerigliatrice a un agitatore in testa. Aggiungere metà del volume consigliato della soluzione MV-1 in base alla porzione specifica del SNC da omogeneizzare come indicato nella tabella e accendere l'agitatore in testa a circa 150 rotazioni al minuto. Spostare con cura il tubo di vetro su e giù per circa 30 secondi prima di spegnere l'agitatore in testa per aggiungere più soluzione MV-1 per un'omogeneizzazione aggiuntiva, fino a ottenere un liquame omogeneo.
Quindi trasferire il tessuto omogeneizzato in un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Per la purificazione delle microvezze, pellettizzare il tessuto DEL SNC omogeneizzato per centrifugazione e scartare i supernatanti. Per un piccolo campione di vertebrati isolamento microvessel, pipettare la corteccia, il cervelletto, lo stelo cerebrale, il lobo ottico e il pellet del midollo spinale, in cinque millilitri di soluzione MV-2 fresca e ghiacciata per campione, circa 10 volte, prima di aggiungere altri cinque millilitri di soluzione MV-2 ghiacciata ad ogni tubo.
Capovolgere con cura i tubi per mescolare e sospendere di nuovo l'ipotalamo e il pellet ipofisario in un millilitro di soluzione MV-2. Per l'isolamento di microvessel di campioni di vertebrati di grandi dimensioni, aggiungere 20 millilitri di soluzione MV-2 ghiacciata alla corteccia, al cervelletto, allo stelo cerebrale e al pellet di microvessel del midollo spinale e sospendere di nuovo i pellet in un revolver a tubo a 40 rotazioni al minuto per circa 5 minuti. Al termine della nuova sospensione, separare i licate dei tessuti DEL SNC per centrifugazione e ruotare lentamente ogni tubo per consentire al supernatante di passare lungo la parete per staccare con cura lo strato di mielina spesso e denso sull'interfaccia liquida dalle pareti del tubo.
Scartare le interfacce mielina e liquido e asciugare la parete interna di ogni tubo con una spatola avvolta da una salvietta di carta a bassa pelucchi. Quindi, utilizzare una salvietta di carta contorta a bassa pelucchi per assorbire il liquido in eccesso e utilizzare punte a bassa legatura per sospendere di nuovo ogni pellet in un millilitro di soluzione MV-3. Per l'eluizione e la filtrazione di microvessel, mescolare alcuni millilitri di soluzione MV-3 fresca in ogni liquame di microvessel di tessuto CNS e, durante la miscelazione per evitare aggregati, filtrare ogni sospensione attraverso un colino Pruitt in singoli tubi conici da 50 millilitri.
Posizionare un filtro a rete in nylon da 20 micrometri su un supporto filtrante modificato per regione CNS. Trasferire il supporto del filtro su un tubo conico da 50 millilitri e bagnare il filtro con cinque millilitri di soluzione MV-3 ghiacciata, assicurandosi che il tampone si riversi nel supporto del filtro, nel tubo conico. Trasferire le microvezze eluizzate su ogni filtro a rete di nylon da 20 micrometri e sciacquare le microvezze con da cinque a 10 millilitri di soluzione MV-3 ghiacciata.
Utilizzare le forcep per trasferire ogni filtro in singoli becher contenenti la soluzione MV-3 ghiacciata e agitare delicatamente ogni filtro per circa 30 secondi per staccare le microvezze. Dopo il trasferimento in un tubo conico da 15 millilitri, raccogliere le microvezze per centrifugazione e utilizzare una pipetta a bassa legatura per sospendere di nuovo ogni pellet in un millilitro di soluzione MV-3 ghiacciata. Quindi, trasferire le sospensioni di microvessel da piccoli campioni di vertebrati in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri per la centrifugazione per cinque minuti a 20.000 volte G, in quattro gradi celsius.
Per campioni di vertebrati di grandi dimensioni, trasferire la sospensione in singoli tubi di centrifuga a cinque millilitri e aggiungere quattro millilitri di soluzione MV-3 per la centrifugazione per cinque minuti a 2.000 volte G in quattro gradi celsius. I componenti intrinseci dell'unità neurovascolare possono essere rilevati all'interno di microvessi, isolati come dimostrato, mediante immunoetichettatura per CD31, PDGFR-beta e aquaporina quattro, inclusi i microvessi corticali, cerebellari, ipofisi, ipotalamici, cerebrali e spinali. Allo stesso modo, è possibile visualizzare l'espressione della proteina ve-cadherina aderenza, delle proteine di giunzione stretta CLDN5 e Zonula Occludens-1, della proteina di giunzione tricellulare angulin-1 e dei segni basali chemiochina ligando CXCL motivo 12, e gamma-glutamiltransferasi-1.
Inoltre, la maggior parte delle microvessel sono prive dell'espressione dell'actina muscolare liscia alfa, indicando che questo protocollo di isolamento prende di mira selettivamente microvessel di piccolo calibro. Le microvessel ottenute da altri piccoli vertebrati lissencefalici, come uccelli, liard, rane e pesci, condividono alcune caratteristiche morfologiche, suggerendo che questo metodo è utile per un'ulteriore caratterizzazione delle differenze nelle unità neurovascolari tra le specie. La quantificazione dei cambiamenti nell'espressione proteica rivela un aumento della molecola di adesione cellulare vascolare uno, e della molecola di adesione giunzionale B lungo le microvezze del midollo spinale, durante il picco dell'encefalomielite autoimmune sperimentale.
Tuttavia, la molecola di adesione cellulare vascolare uno è anche significativamente aumentato nei microvessi ipofisi, e diminuito nei microvessi ipotalamo e tronco encefalico. Inoltre, si osservano cambiamenti nella molecola di adesione cellulare vascolare un'espressione durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale cronica in tutti i tessuti del SNC e nell'espressione della molecola di adesione congiunzione B nell'ipotalamo e nei microvessi ipofisi. Le analisi quantitative, come western blot, PCR e immunoistochimica, possono essere eseguite seguendo questa procedura per rivelare approfondimenti sui modelli di espressione genica e proteica all'interno della barriera ematico-encefalica.
La paraformaldeide è un reagente acutamente tossico e deve sempre essere maneggiata sotto il cofano dei fumi indossando dPI adeguati.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per isolare i microvasi da varie regioni del sistema nervoso centrale (SNC) sia nei vertebrati lissencefali che girincefalici. Consentendo il confronto della microvascolarizzazione tra diverse regioni del SNC e individui, questa tecnica facilita una comprensione più approfondita delle strutture vascolari. Il protocollo può essere completato in un giorno senza la necessità di ultracentrifugazione o dissociazione enzimatica.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Studi sulla microvascolarizzazione
- Ricerca sul sistema nervoso centrale
Contesto
- L'isolamento dei microvasi del SNC è cruciale per comprendere le differenze regionali nella vascolarizzazione.
- Gli studi microvascolari possono fornire informazioni su disturbi neurologici e salute vascolare.
- Lo studio affronta le sfide nella rimozione di tessuti complessi garantendo al contempo un campione pulito per l'analisi.
- L'analisi comparativa tra specie può migliorare la nostra comprensione delle strutture del SNC nei vertebrati.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per isolare i microvasi da varie regioni del SNC.
- Confrontare la microvascolarizzazione nei vertebrati lissencefali rispetto a quelli girincefalici.
- Semplificare il processo di isolamento evitando tecniche tradizionali come l'ultracentrifugazione.
Metodi utilizzati
- Il metodo prevede la dissezione e l'omogeneizzazione del tessuto del SNC, seguita da centrifugazione per la purificazione dei microvasi.
- Vengono utilizzati esemplari di vertebrati sia piccoli che grandi, con protocolli specifici per ogni dimensione.
- Le tecniche manuali come la rimozione attenta dei tessuti e l'omogeneizzazione sono enfatizzate per evitare di danneggiare i microvasi.
- Le soluzioni fresche MV-1 e MV-2 sono fondamentali per mantenere la vitalità del tessuto durante tutto il processo.
- La filtrazione attraverso filtri in nylon aiuta nella purificazione dei microvasi isolati.
Risultati principali
- Il processo delineato isola efficacemente i microvasi, fornendo una solida piattaforma per futuri studi comparativi.
- Le sfide nella rimozione dei tessuti, in particolare delle meningi e del plesso coroideo, sono affrontate con raccomandazioni specifiche.
- Questo metodo è versatile, consentendo l'isolamento sia da specie di vertebrati piccoli che grandi.
Conclusioni
- Questo studio dimostra una tecnica efficiente per l'isolamento dei microvasi che può migliorare la ricerca sulle reti vascolari del SNC.
- La capacità di confrontare la microvascolarizzazione tra diversi vertebrati apre strade per la comprensione delle adattazioni vascolari.
- Nel complesso, il protocollo contribuisce alla nostra conoscenza della morfologia e funzionalità del SNC, in particolare in relazione alla salute microvascolare.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct comparison of neurovascular units across CNS regions and individuals, addressing a key limitation in blood-brain barrier research. By supporting cross-species and cross-tissue-type analysis, it enhances target validation and mechanistic de-risking in neuroinflammatory disease models. The method’s compatibility with downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot positions it as a scalable tool for preclinical biomarker assessment and pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing NVU composition across cortex, cerebellum, hypothalamus, brainstem, spinal cord, and pituitary.
- Operational Value: Supports individual-level comparisons, reducing variability from pooled samples and improving statistical power in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified microvessels suitable for quantitative protein expression analysis via immunolabeling of CD31, PDGFR-beta, aquaporin-4, VE-cadherin, CLDN5, ZO-1, and angulin-1.
- Operational Value: Eliminates need for ultracentrifugation and enzymatic dissociation, streamlining workflow and preserving native protein complexes for reliable assay readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrated utility in EAE model showing quantifiable changes in VCAM-1 and JAM-B expression across spinal cord, pituitary, hypothalamus, and brainstem microvessels.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of vascular biomarkers in disease progression, supporting risk-adjusted advancement decisions in neuroinflammatory programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, particularly for neurovascular and neuroinflammatory targets where BBB integrity is a critical determinant of drug efficacy and safety.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on region-specific NVU composition and treatment-induced changes in adhesion and junctional proteins.
- Screening: Produces standardized, reproducible microvessel preparations amenable to high-content imaging and multiplex protein profiling.
- Analytics: Enables quantitative Western blot, qPCR, and RNA-seq readouts to compare protein and gene expression across individuals, regions, and treatment groups.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical validation by allowing direct comparison of NVU alterations in disease models like EAE.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across vertebrate species and CNS regions, promoting cross-project standardization and reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by linking microvascular changes to neuroinflammatory mechanisms through quantifiable biomarkers like VCAM-1 and JAM-B.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dissection, homogenization, and filtration steps that minimize operator variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-relevant vascular response data in preclinical models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS-targeted compounds based on BBB modulation potential and neurovascular safety signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and microsurgical dissection to ensure complete removal of meninges and choroid plexus.
- Depends on access to tissue grinders, centrifuges capable of 2,000–20,000 × G, and low-binding tubes to prevent microvessel loss.
- Necessitates standardization of MV-1, MV-2, and MV-3 buffer preparations across labs for consistent microvessel yield and purity.
- Adaptation across species requires adjustment of homogenization volume and time based on tissue density and size, as outlined in the protocol.
- Myelin removal step adds technical complexity; incomplete removal may contaminate preparations and interfere with downstream protein analysis.
