Name: Isolamento affidabile dei micronavi del sistema nervoso centrale in cinque gruppi di vertebrati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Scopri un metodo affidabile per isolare i micronavi del sistema nervoso centrale in vertebrati lissencefalici e giroencefalici. Questa tecnica semplificata evita l'ultracentrifuga e consente studi comparativi sulla microvascolatura cerebrale.

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Dr. Cruz-Orengo è stato sostenuto dalla University of California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.

Tutte le procedure del presente studio sono conformi alle linee guida stabilite dall'Università della California (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). La cura degli animali all'UC Davis è regolata da diverse risorse indipendenti ed è stata pienamente accreditata dalla Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) dal 1966. I tessuti CNS porcino sono stati ottenuti dal Dipartimento UCD di Scienze Animali, Meat Sciences Laboratory. I tessuti del CNS dei macachi rhesus sono stati ottenuti dal California National Primate Research Center Pathology Department (NIH P51OD01107). Nessuna anestesia, eutanasia o necropsia è stata eseguita dal personale di laboratorio su maiali e macachi. Pertanto, non ci sono raccomandazioni particolari in merito a tali questioni.
NOTA: Questo metodo è stato convalidato per più specie, ma il protocollo fornito corrisponde più direttamente ai tessuti murini e porcini. I dettagli relativi al lobo ottico non si applicano quando si utilizzano campioni di mammiferi. Tutti i materiali biopericolosi devono essere trattati in un adeguato livello di biosicurezza (BSL). Tutti i materiali acutamente tossici devono essere maneggiati sotto un cofano di fumi. Tutti i rifiuti medici biopericolosi e i rifiuti acutamente tossici devono essere smaltiti correttamente.
1. Preparazione
<ol><li>Preparare le soluzioni (Tabella 1) almeno un giorno prima. NOTA: È molto difficile sciogliere 70 kDa peso molecolare (MW) dextran. È più efficiente lasciare che la soluzione si agita durante la notte coperta con pellicola paraffina o pellicola. Il protocollo richiede l'uso di due diverse soluzioni MV-2 a seconda del campione in esame. Il 18% dextran separa in modo efficiente la mielina dal pellet del microvaso quando si esegue il protocollo su piccoli esemplari lissencephalic. Tuttavia, sviluppa uno striscio di mielina all'interno dell'interfaccia dei tessuti CNS da grandi esemplari gyrencephalic, così come l'ipotalamo e l'iptuitario da piccoli esemplari. Questo striscio è impedito utilizzando 20% dextran.</li>
	<li>Preparare i well-slides caricando 50 -L per pozzo di poli-D-lisina e lasciare asciugare per 2 h a temperatura ambiente (RT), preferibilmente in un armadio di sicurezza biologica-classe 2 (BSC-2). Non asciugare troppo. Sciacquare due volte con la salina con buffer fosfato (PBS) e conservarla in frigorifero fino a quando non è pronta per l'uso.</li>
</ol>2. Dissezione dei tessuti CNS dal piccolo esemplare di vertebrato lissencefalico
NOTA: l'articolo illustra l'applicazione del protocollo su un C57BL6/J, 10 settimane di età, 25 g, mouse maschile.
<ol><li>Preparare due tubi conici da 15 mL e un tubo di microcentrifuga da 1,7 mL con 5 mL e 1 mL, rispettivamente, di soluzione MV-1 per campione. Tenere i tubi sul ghiaccio.</li>
	<li>Anestesizzazione<ol>
<li>Anestetizza i topi mediante iniezione intraperitoneale di una chetamina, xilocina e acepromazina cocktail anestetico a 100/10/3 mg per kg di peso corporeo e spray con 70% di etanolo. Confermare l'anestesia valutando l'assenza di riflessi palpebrali e pedale toccando un occhio e pizzicando un piede, rispettivamente.</li>
		<li>Anestesizzai i piccioni per inalazione del 5% di isoflurane usando una scatola di anestesia ad induzione.</li>
		<li>Anestesizzare pesci e rane in 1% Tricaina in un acquario o soluzione anfibia Ringer (Tabella dei materiali), rispettivamente.</li>
		<li>Anestesizzale le lucertole raffreddandosi a 4 gradi centigradi prima dell'eutanasia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Decapitare l'animale con forbici chirurgiche, staccare la pelle con pinze per esporre il cranio e tagliare con le forbici LaGrange attraverso il forame magnum (Figura 1A).</li>
	<li>Dissezionare il cervello con una spatola e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL con soluzione MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.</li>
	<li>Recuperare l'ipofisi dalla sella turcica del cranio con pinze e trasferirlo in un tubo di microcentrifuga da 1,7 mL con soluzione MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.</li>
	<li>Rimuovere la pelle e il muscolo per esporre la colonna vertebrale. Tagliare gli arti, la gabbia toracica e gli organi interni (Figura 1B).</li>
	<li>Dissezionare il midollo spinale con uno dei due metodi descritti di seguito. Quindi, trasferire in un tubo conico 5 mL con soluzione MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.<ol>
<li>Eseguire laminectomia tagliando in direzione rostrale a caudale con forbici LaGrange, iniziando attraverso il forame vertebralecervicale , fino a raggiungere il cordone lombare.</li>
		<li>Eseguire il lavaggio in direzione caudale in rostrale in tutto il forame vertebrale lombare con un ago da 18 G e una siringa da 10 mL caricata con soluzione MV-1 (Figura 1C,D). NOTA: questo metodo funziona solo con campioni molto piccoli, per lo più roditori (<100 g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando un mirino di dissezione, tagliare il sacco durale dal midollo spinale con le forbici a molla e rimuovere le restanti meningi con un plettro a doppio campo (Figura 2).</li>
	<li>Trasferire il cervello in un piatto Petri e, utilizzando un mirino di dissezione, rimuovere le meningi con un plettro a doppia pletora (Figura 2A–C).</li>
	<li>Accise i bulbi olfattivi e il talamo con pinze, forbici da iride e forbici primaverili. Utilizzando il plettro a doppia puntura, rimuovere il plesso coroideo da tutti i ventricoli cerebrali. Assicurarsi di rimuovere tutto il plesso coroideo. NOTA: Il plesso coroideo e i bulbi olfattivi sono una massiccia fonte di contaminazione. A differenza della BBB, questi capillari sono altamente fenestrated e i risultati degli esperimenti successivi saranno compromessi se non vengono rimossi.</li>
	<li>Utilizzando pinze, separare le regioni SNC distinte: corteccia, cervelletto, tronco encefalico, lobo ottico (non su esemplari di mammiferi) e ipotalamo.</li>
</ol>3. Dissezione dei tessuti CNS da un grande esemplare di vertebrato ginefalo
NOTA: Questo protocollo utilizza tessuti CNS porcina ottenuti da un mattatoio. Pertanto, nessuna anestesia, eutanasia o necroscopia è descritta o mostrata qui.
<ol><li>Trasportare i tessuti CNS porcine in un contenitore di istologia da 0,946 L (32 oz) caricato con soluzione MV-1 all'interno di un forziere/secchio di ghiaccio.</li>
	<li>Utilizzando un mirino di dissezione, rimuovere le meningi con un piccone a doppia punta, pinze, forbici iride, e forbici a molla da ogni tessuto del SNC. Assicurarsi di rimuovere eventuali pezzi di plesso coroideo dai ventricoli cerebrali.</li>
</ol>4. Omogeneizzazione dei tessuti del CNS
NOTA: È più efficiente quando due ricercatori si impegnano nel processo di omogeneizzazione: uno seziona le meningi sotto lo stereoscopio e l'altro omogeneizzando i tessuti macinati. In questo modo, i tessuti vengono rapidamente restituiti al secchio di ghiaccio e mantenuti freddi.
<ol><li>Posizionare ogni regione CNS su una piastra Petri con 1 mL di soluzione MV-1. Utilizzando una lama a bordo singolo, macinare il tessuto per ottenere pezzi da 1–2 mm.<ol>
<li>Per un piccolo esemplare di vertebrato, utilizzare una piastra Petri da 100 mm x 20 mm.</li>
		<li>Per un grande esemplare di vertebrato, utilizzare una parabola Petri da 150 mm x 15 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Omogeneizzazione di un piccolo esemplare di vertebrato (Tabella 2 e Tabella 3)<ol>
<li>Trasferire la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico, il lobo ottico e il midollo spinale alla soluzione MV-1 da 1l mL in un'unica smerigliatrice di tessuto in vetro Potter-Elvehjem da 10 mL con un pestello PTFE utilizzando una pipetta di trasferimento. Aggiungere 5 mL di soluzione MV-1 e omogeneizzare ogni tessuto (10 colpi). Trasferire a singoli tubi conici da 15 mL. Tenere i tubi sul ghiaccio. NOTA: Per un piccolo vertebrato, 5 o 4, rispettivamente con o senza lobo ottico, sono necessari smerigliatrici Potter-Elvehjem da 10 mL e tubi conici da 15 mL.</li>
		<li>Trasferire l'ipotalamo e l'ipofisi con le pinze a 100 dollari di soluzione MV-1 in un tubo individuale da 1,7 mL e omogeneizzare con attenzione con un micropestle di vetro. Sciacquare ogni micropestle con una soluzione MV-1 da 1 mL di MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio. NOTA: Per un piccolo vertebrato, sono necessari 2 micropestle di vetro e tubi da 1,7 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Omogeneizzazione di un grande esemplare di vertebrato (Tabella 4 e Tabella 5)<ol>
<li>Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire il tessuto macinato in un macinino in tessuto di vetro Potter-Elvehjem da 55 mL con un pestello PTFE e attaccarlo al mimossere in testa. Aggiungere metà del volume consigliato della soluzione MV-1, in base alla porzione CNS specifica che viene omogeneizzata (Tabella 5).</li>
		<li>Accendere lo staffatore in testa a velocità molto bassa (150 giri/min) e spostare con attenzione il tubo di vetro su e giù per circa 30 s.</li>
		<li>Spegnere il collegitore dall'alto, aggiungere altra soluzione MV-1 e ripetere il passaggio 4.3.2 fino ad ottenere un liquame omogeneo.</li>
		<li>Trasferire su un tubo conico da 50 mL. Tieni il tubo sul ghiaccio.</li>
		<li>Lavare la smerigliatrice con acqua deionizzata tra ogni omogeneizzazione del tessuto SNC. NOTA: Per un vertebrato di grandi dimensioni 5 o 4, rispettivamente con o senza materia bianca, sono necessari 50 mL di tubi conici. Allo stesso modo, sono necessari due (2) 15 mL di tubi conici per l'ipotalamo e l'ipofisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Purificazione del recipiente
<ol><li>Omogenei del tessuto di centrifuga derivanti dal passo 4.2.1, 4.2.2, o 4.3.4 a 2.000 g per 10 min a 4 gradi centigradi. Una grande interfaccia bianca di mielina si formerà sulla parte superiore dei pellet rossastri delle microvessels. Scartate i superalatari.<ol>
<li>Piccolo esemplare vertebrato (Tabella 2 e Tabella 3)<ol>
<li>Risospendere la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico, il lobo ottico e il pellet del midollo spinale in 5 mL di soluzione MV-2 ghiacciata con una pipetta sierologica da 5 mL (10 lavaggi). Aggiungere 5 mL di soluzione MV-2 ghiacciata ad ogni sospensione e mescolare attentamente capovolgendo i tubi.</li>
			<li>Risospendere l'ipotalamo e i pellet ipofisari con 1 mL di soluzione MV-2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Grande esemplare di vertebrato (Tabella 4 e Tabella 5)<ol>
<li>Aggiungere 20 mL di soluzione MV-2 ghiacciata alla corteccia, al cervelletto, al tronco encefalico e ai pellet dei recipienti del midollo spinale. Risospendere i pellet mescolando su uno shaker revolver a tubo, mescolando a 40 giri per 5 min. Bilanciare i volumi dei tubi conici della corteccia, cervelletto, tronco encefalico, e sospensioni del midollo spinale con l'aggiunta di più soluzione MV-2.</li>
			<li>Risospendere l'ipotalamo e i pellet a micronave pituitaria in 5 mL di soluzione MV-2 con una pipetta sierologica da 5 mL (vampate di calore) da 10 usd. Aggiungere 5 mL di soluzione MV-2 ghiacciata alle sospensioni e mescolare con attenzione capovolgendo il tubo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuga a 4.400 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Staccare con attenzione lo strato di mielina spesso e denso sull'interfaccia liquida dalle pareti di ogni tubo ruotando lentamente i tubi e permettendo al supernatante di passare lungo le pareti.</li>
	<li>Scartare la mielina e l'interfaccia liquida e macchiare la parete interna di ogni tubo con una spatola avvolta con una salvietta di carta bassa. Per piccoli campioni di vertebrati, rimuovere lo strato di mielina da ogni ipotalamo e tubo ipofisario aspirando con attenzione con una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Pulire il liquido in eccesso con una salvietta di carta contorta a bassa lanella. Risospendere ogni pellet con 1 mL di soluzione MV-3 utilizzando punte a basso legame. Tenere i tubi sul ghiaccio.</li>
</ol>6. Eluzione e filtrazione dei recipienti
<ol><li>Versare la soluzione MV-3 ghiacciata in singoli becher per ogni regione del SNC. Tenere a 4 gradi centigradi.<ol>
<li>Per piccoli campioni di vertebrati, utilizzare 10 mL di soluzione MV-3 per becher da 50 mL. Un totale di 6-7 becher è necessario a seconda se il lobo ottico è incluso o meno.</li>
		<li>Per grandi campioni di vertebrati, utilizzare 30 mL di soluzione MV-3 per becher da 100 mL. Un totale di 6-7 becher è necessario a seconda se la materia bianca è inclusa o meno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare un colino cellulare sopra un tubo conico da 50 mL. Usane uno per ogni area CNS. Utilizzare un colino da 100 m per la corteccia, il tronco encefalico, il lobo ottico, il midollo spinale e l'ipofisi. Utilizzare un colino a 70 celle m per il cervelletto e l'ipotalamo.</li>
	<li>Umidità di ogni colino con 1 mL di soluzione MV-3 ghiacciata.</li>
	<li>Aggiungere più soluzione MV-3 alle sospensioni preparate al punto 5.5 con una pipetta sierologica durante la miscelazione per evitare gli aggregati. Caricare con attenzione i microrecipient sopra il colino. Risciacquare con soluzione MV-3 ghiacciata.<ol>
<li>Per piccoli campioni di vertebrati (Tabella 2 e Tabella 3),aggiungere 10-15 mL di soluzione MV-3 con una pipetta sierologica e risciacquare con 5 mL di soluzione MV-3.</li>
		<li>Per grandi campioni di vertebrati, aggiungere 20 mL di soluzione MV-3 con una pipetta sierologica e risciacquare con 10 mL di soluzione MV-3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assemblare l'unità di filtrazione posizionando un filtro di rete in nylon da 20 m su un supporto di filtro modificato (Figura 2D), uno per ogni regione DEL SNC.<ol>
<li>Per i piccoli campioni di vertebrati (Tabella 2 e Tabella 3), utilizzare i supporti filtranti modificati 25 mm per la corteccia, il cervelletto, il tronco cerebrale, il lobo ottico e il midollo spinale. Utilizzare portafiltri modificati da 13 mm per l'ipotalamo e l'ipofisi.</li>
		<li>Per i grandi campioni di vertebrati (Tabella 4 e Tabella 5), utilizzare supporti di filtro modificati 47 mm per la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico e il midollo spinale. Utilizzare 25 mm per l'ipotalamo e l'ipofisi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare il filtro sopra un tubo conico da 50 mL e un filtro bagnato con 5 mL di soluzione MV-3 ghiacciata assicurandosi che il buffer versa salga il supporto del filtro al tubo conico.</li>
	<li>Trasferire i microrecipient eluiti (dal punto 6.4) sopra il filtro a rete in nylon da 20 m e sciacquare i microrecipient con 5-10 mL di soluzione MV-3 ghiacciata.</li>
	<li>Recuperare il filtro con pinze pulite e immergerlo nel becher contenente la soluzione MV-3 ghiacciata preparata nel passaggio 6.1.</li>
	<li>Staccare i microrecipient dal filtro agitandolo delicatamente per circa 30 s. Per piccoli campioni di vertebrati, versare il contenuto del becher in un tubo conico da 15 mL. Per grandi campioni di vertebrati, versare il contenuto del becher in un tubo conico da 50 mL.</li>
	<li>Centrifuga a 2.000 x g per 5 minuti a 4 gradi centigradi e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione MV-3 ghiacciata utilizzando una punta di pipetta a bassa legame.<ol>
<li>Per piccoli campioni di vertebrati, trasferire la sospensione (dal passo 6.10) in un tubo di microcentrifuga di 1,7 mL e centrifugare a 20.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. NOTA: Questo spin viene eseguito su una centrifuga da banco alla massima velocità (20.000 x g) per garantire una resa robusta.</li>
		<li>Per grandi campioni di vertebrati, trasferire la sospensione dalla fase 6,10 in un tubo di microcentrifuga da 5,0 mL, aggiungere 4 mL di soluzione MV-3 e centrifugare a 2.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Immunostaining
NOTA: la colorazione ematossia e eosina (H&E) è stata eseguita su rettili, anfibi e campioni di pesce come prova di concetto della fattibilità del protocollo. Pertanto, non vi è alcuna raccomandazione per l'immunoetichettatura per questi campioni.
<ol><li>Rimuovere il supernatante dai tubi di microcentrifuga.</li>
	<li>Risospendere il pellet in PBS sterile 1x utilizzando una punta pipetta a basso legame (Tabella dei materiali). Impedire ai micronavi di formare aggregati tramite pipettaggio più volte. Per i piccoli campioni di vertebrati (tabella 3),utilizzare 100 - L-2.000 - L a seconda della dimensione del pellet. Per i campioni vertebrati di grandi dimensioni (Tabella 5),utilizzare 1.000 USD l-4.000 - L in base alle dimensioni del pellet.</li>
	<li>Utilizzando una punta pipetta a bassa rilegatura, trasferire i microrecipient in vetrini di pozzi, facendo attenzione ad aggiungerli al centro di ogni pozzo, evitando le pareti laterali.</li>
	<li>Impostare i vetrini del pozzo, scoperti, all'interno di un BSC-2, e lasciare asciugare per 20-30 min a RT. NOTA: Un volume relativamente elevato di 1x PBS viene utilizzato per evitare la formazione di aggregati. Per questo motivo, è necessario lasciare asciugare i vetrini prima della fissazione per assicurarsi che i microrecipienti siano tenuti dal rivestimento polid-lysina.</li>
	<li>Rimuovere il residuo 1x PBS con una pipetta di trasferimento, aggiungere 200 -L di 4% di paraformaldeide (PFA) e incubare per 30 min a RT.</li>
	<li>Pipette fuori la soluzione fixativa e lavare 3x con 200 s L di 1x PBS per 5 min a RT. NOTA: a questo punto è stata eseguita la colorazione H&E su pesci, microvessels anfibi e rettili cnsp.</li>
	<li>Aggiungere 200 l di tampone di bloccante al vetrino del pozzo e incubare per 60 min a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Rimuovere il buffer di blocco con una pipetta di trasferimento e aggiungere 200 l del cocktail anticorpale primario in diluente anticorpo (Tabella dei materiali). Incubare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Pipette fuori il cocktail anticorpale primario e lavare 3x con 200 l- l di 1x PBS per 5 min a RT.</li>
	<li>Caricare il cocktail anticorpale secondario (Tabella dei materiali) diluito in 1x PBS e incubare per 2 h a RT, protetto dalla luce.</li>
	<li>Pipette fuori il cocktail anticorpo secondario e lavare 3x con 200 l- l of 1x PBS per 5 min a RT, protetto dalla luce. Dopo l'ultimo lavaggio staccare il telaio del pozzo-slide e asciugare blot-secco eventuali in eccesso 1x PBS con una salvietta di carta a bassa pelnella.</li>
	<li>Aggiungere un coverslip, un mezzo di montaggio liquido anti-dissolvenza e 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) per la colorazione nucleare. Lasciare asciugare per tutta la notte a RT protetto dalla luce.</li>
	<li>Una volta asciutto, tenere al protetto dalla luce su una scatola di scorrimento a 4 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per la microscopia confocale e l'acquisizione dei dati.</li>
</ol>

<ol><li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).</li>
<li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li>
<li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+Physiology+to+Disease+and+Back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li>
<li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).</li>
<li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+barriers%3A+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes & Development. 32, 466-478 (2018).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li>
<li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li>
<li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSR%2Fangulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li>
<li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li>
<li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li>
<li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li>
<li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li>
<li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).</li>
<li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex%3A+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li>
<li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il BBB include le proprietà uniche delle cellule endoteliali di microvascolatura cerebrale accoppiate da una sofisticata architettura di stretto, aderenti-, "peg-socket" - giunzioni, e placche di adesione critiche per l'omeostasi CNS2,3,19. Le proprietà delle cellule endote sono indotte e mantenute dai periciti e dall'astroglia circostante i processi di fine piede2,3<sup...

Il nostro cervello è l'organo più importante del nostro corpo. Per questo motivo, mantenere l'omeostasi del cervello nonostante fattori esterni che possono innescare una deviazione dalla normalità è una priorità. Secondo alcuni studiosi, circa 400-500 milioni di anni fa1, gli animali vertebrati hanno sviluppato quella che oggi conosciamo come la barriera emato-encefalica (BBB)2,3. Questa "recinto" protettiva esercita la maggiore influenza sull'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS) e sulle funzioni regolando strettamente il trasporto di ioni, molecole e cellule tra sangue e parenchyma del SNC. Quando il BBB viene interrotto, il cervello diventa suscettibile a esposizione tossica, infezione, e infiammazione. Pertanto, la disfunzione BBB è associata a molti, se non tutti, disturbi neurologici e neurosviluppo4 ,5,6.
La sofisticata funzione del BBB è attribuita all'unica microvascolatura CNS conformata dall'unità neurovascolare (NVU)2,3. Cellule endoteliali altamente specializzate, periciti e piedi finali astrociti cisonoci sono i componenti cellulari della NVU2,3. La matrice extracellulare generata da queste cellule è anche essenziale per la fisiologia NVU e BBB2,3. Anche se i componenti cellulari e molecolari essenziali della NVU sono conservati tra i vertebrati, l'eterogeneità è riportata tra gli ordini e le specie7,8. Tuttavia, limitazioni tecniche ostacolano la nostra capacità di considerare pienamente queste differenze nella ricerca neurobiologia, biomedica o traslazionale.
Per questo motivo, abbiamo ampliato un metodo di isolamento dei microvessel specifico della regione CNS per renderlo applicabile a numerose specie di tutti e cinque i gruppi di vertebrati: pesci, anfibi, rettili, uccelli e mammiferi. Il protocollo è descritto per l'uso su vertebrati small-lissencefalici e grandi girocefali, comprese specie con rilevanza traslazionale9. Inoltre, includiamo altre regioni del CNS non studiate prima in questo contesto, ma rilevanti per la neurofisiologia e con enormi implicazioni cliniche: l'ipotalamo, l'ipofisi e la materia bianca. Infine, abbiamo testato la capacità di questo metodo di isolamento come uno strumento affidabile per identificare i cambiamenti nell'espressione proteica lungo l'NVU e/o BBB9,10,11. Come proof-of-concept, abbiamo mostrato come determinare i cambiamenti nell'espressione VCAM-1 e JAM-B durante EAE utilizzando il metodo di isolamento seguito dall'immunofluorescenza.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>Utilizzato per il blocco e il diluente anticorpale.</td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Microscopia Elettronica</td><td>Scienze 15713-S</td><td>Utilizzato come fissativo (4% PFA)</td></tr><tr><td>70.000 MW Destrano</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>Utilizzato per la soluzione MV-2</td></tr><tr><td>Adson Forcipe</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11006-12</td><td>Utilizzato per la rimozione di muscoli e pelle</td></tr><tr><td>Pinza Adson, qualità per studenti</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>Come sopra ma più economico</td></tr><tr><td>Siero bovino albumina (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Utilizzato per la soluzione MV-3, il bloccante e il diluente anticorpale</td></tr><tr><td>Corning 100 &mu; m Filtro cellulare</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 &mu; m Filtro cellulare</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning Deskwork punte a basso legame</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>Come di seguito ma più economico.</td></tr><tr><td>Cultrex Poli-D-lisina</td><td>R& D</td><td>3439-100-01</td><td>Utilizzato per il rivestimento scorrevole</td></tr><tr><td>Asino anti-capra IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Asino anti-Topo IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Asino anti-Coniglio IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Asino anti-ratto IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Plettro per tessuti a doppia punta</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>Utilizzato per la rimozione di meningi e plesso coroideo</td></tr><tr><td>Dumont #3c Pinza</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>Utilizzata per la manipolazione di tessuti del SNC più delicati e/o piccoli (come l'ipofisi)</td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinze</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Utilizzate per la dissezione e la manipolazione del tessuto del SNC</td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinze, studente</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>Come sopra ma più economici</td></tr><tr><td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>Migliore qualità rispetto ai puntali sopra (più costosi).</td></tr><tr><td>Pinze Graefe extra fini, seghettate</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>Utilizzato per la rimozione dell'osso</td></tr><tr><td>Forbici fini, affilate</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Utilizzato per la rimozione di sacchi durali di maiale e macaco</td></tr><tr><td>Pestello di vetro Omogeneizzatore per tritatessuti per microcentrifuga da 1,5 mL, confezione da 10</td><td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>Utilizzato per piccoli ipotali e ipofisi.</td></tr><tr><td>Capra anti-CXCL12, biotinilato</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata: 1:20.</td></tr><tr><td>Capra anti-JAM-B</td><td>R& D</td><td>AF1074</td><td>Utilizzato come anticorpo primario per valutare la neuroinfiammazione. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Capra anti-Topo IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Capra anti-Topo IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Capra anti-PDGFR&beta;</td><td>R& D</td><td>AF1042</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Capra anti-Coniglio IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Capra anti-Coniglio IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Capra anti-ratto IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Pinza Graefe, punta curva, denti 1X2 FST</td><td></td><td>11054-10</td><td>Utilizzabile per la tenuta e l'agitazione della rete filtrante in nylon</td></tr><tr><td>HBSS, tampone 1X con calcio e magnesio</td><td>Corning</td><td>21-022-CM</td><td>Utilizzato per la soluzione MV-1</td></tr><tr><td>HEPES, tampone liquido</td><td>1M Corning</td><td>25-060-CI</td><td>Utilizzato per la soluzione MV-1</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td><td>I21414</td><td>Glicoproteina isolata dalla leguminosa Griffonia simplicifolia che lega i residui di D-galattosilico della glicocalisse delle cellule endoteliali. Utilizzato per microvasi del SNC aviario e suino. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Forbici LaGrange, seghettate</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Utilizzate per la dissezione del cranio e la laminectomia (eccetto maiale e macaco)</td></tr><tr><td>Unità a 8 pozzetti Millicell EZ slide Millipore</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Topo anti-GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD31</td><td>R& D</td><td>BBA7</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC dei primati. Concentrazione consigliata: 16,5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Topo anti-NFM</td><td>Thermo</td><td>RMO-270</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Topo anti-&alpha;SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Rete filtrante in nylon, rotolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY6000010</td><td>Dischi filtranti tagliati al laser a 13 mm di diametro. Utilizzato per piccoli ipotali vetebrati e ipofisi.</td></tr><tr><td>Reti filtranti in nylon, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2002500</td><td>Utilizzato sulla maggior parte dei piccoli vertebrati del SNC, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. Utilizzato per l'ipotalamo e l'ipofisi di macaco e maiale.</td></tr><tr><td>Reti filtranti in nylon, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2004700</td><td>Utilizzate per i tessuti del SNC di macachi e suini, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi.</td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>Utilizzato per vetrini coprioggetti.</td></tr><tr><td>Coniglio anti-AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Coniglio anti-LSR</td><td>Millipore Sigma</td><td>SAB2107967</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Coniglio anti-NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Coniglio anti-OSP</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 1 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Coniglio anti-VE-Caderina</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Coniglio anti-ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Ratto anti-CD31</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 550274</td><td>Utilizzato come anticorpo primario per i microvasi murini del SNC. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Anti-GFAP per ratto</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>Utilizzato come anticorpo primario sui microvasi del SNC di tutti i campioni. Diluizione consigliata di 1:200.</td></tr><tr><td>Rat anti-VCAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 553329</td><td>Utilizzato come anticorpo primario per valutare la neuroinfiammazione. Concentrazione consigliata: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Soluzione sterile di Ringer, Frog</td><td>Aldon Corporation</td><td>IS5066</td><td>Utilizzato per l'anestesia amfibiana</td></tr><tr><td>Streptavidina-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>S32355</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario per marcare gli anticorpi primari biotinilati. Diluizione consigliata di 1:500.</td></tr><tr><td>Streptavidina-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario per marcare gli anticorpi primari biotinilati. Diluizione consigliata di 1:500.</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche, affilate</td><td>FST</td><td>14002-12</td><td>Utilizzate per la rimozione di muscoli e pelle</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche, affilate-smussate</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Utilizzate per la decapitazione (eccetto maiale e macaco)</td></tr><tr><td>Portafiltro Swinnex, 13 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0001300</td><td>Modificato mediante taglio laser. Utilizzato per piccoli ipotali vetebrati e ipofisi.</td></tr><tr><td>Portafiltro Swinnex, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0002500</td><td>Modificato mediante taglio laser. Utilizzato sulla maggior parte dei piccoli vertebrati del SNC, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. Utilizzato per l'ipotalamo e l'ipofisi di macaco e maiale.</td></tr><tr><td>Portafiltro Swinnex, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0004700</td><td>Modificato mediante taglio laser. Utilizzato per i tessuti del SNC di macaco e maiale, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>Utilizzato per il blocco e il diluente anticorpale.</td></tr><tr><td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td><td>VWR (Fornitore DWK Life Sciences)</td><td>62400-904 (DWK #903475)</td><td>Utilizzato per tessuti del SNC di macachi e suini con macinatore di tessuti da 55 mL, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi.</td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti Wheaton Potter-Elvehjem con pestello in PTFE, 10 mL</td><td>VWR (Fornitore DWK Life Sciences)</td><td>14231-384 (DWK #357979)</td><td>Utilizzato sulla maggior parte dei piccoli tessuti del SNC dei vertebrati, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi. Utilizzato per l'ipotalamo e l'ipofisi di macaco e maiale.</td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti Wheaton Potter-Elvehjem con pestello in PTFE, 55 mL</td><td>VWR (Fornitore DWK Life Sciences)</td><td>14231-372 (DWK #357994)</td><td>Utilizzato per i tessuti del SNC di macachi e suini, ad eccezione dell'ipotalamo e dell'ipofisi.</td></tr></tbody></table>

isolamento affidabile dei micronavi del sistema nervoso centrale in cinque gruppi di vertebrati

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

L'isolamento dei microvasi dal sistema nervoso centrale (CNS) è comunemente eseguito combinando tessuto corticale da più animali, il più delle volte roditori. Questo approccio limita l'interrogatorio delle proprietà della barriera emato-encefalica (BBB) alla corteccia e non consente il confronto individuale. Questo progetto si concentra sullo sviluppo di un metodo di isolamento che consente il confronto dell'unità neurovascolare (NVU) da più regioni del SNC: corteccia, cervelletto, lobo ottico, ipotalamo, ipofisi, tronco encefalico e midollo spinale. Inoltre, questo protocollo, originariamente sviluppato per i campioni di murini, è stato adattato con successo per l'uso su tessuti CNS da piccole e grandi specie di vertebrati da cui siamo anche in grado di isolare i microvasi dalla materia bianca dell'emisfero cerebrale. Questo metodo, se abbinato all'immunoetichettatura, consente la quantificazione dell'espressione proteica e il confronto statistico tra individui, tipo di tessuto o trattamento. Abbiamo dimostrato questa applicabilità valutando i cambiamenti nell'espressione delle proteine durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello murino di una malattia neuroinfiammatoria, la sclerosi multipla. Inoltre, i microvessels isolati con questo metodo potrebbero essere utilizzati per applicazioni a valle come qPCR, RNA-seq e macchia occidentale, tra gli altri. Anche se questo non è il primo tentativo di isolare le microvessels CNS senza l'uso di ultracentrifugazione o dissociazione enzimatica, è unico nella sua abilità per il confronto di singoli individui e più regioni del SNC. Pertanto, consente di scandire una serie di differenze che altrimenti potrebbero rimanere oscure: porzioni del SNC (corteccia, cervelletto, lobo ottico, tronco encefalico, ipotalamo, ipofisario e midollo spinale), tipo di tessuto CNS (materia grigia o bianca), individui, gruppi di trattamento sperimentale e specie.

I microvessels isolati dal SNC murino hanno mostrato tutti i componenti cellulari intrinseci dell'unità neurovascolare2,3. Utilizzando sia platelete endoteliale aderenazione delle cellule-1 (PECAM, noto anche come CD31) o isolettica IB4 (una glicoproteina che lega il glicocalyx cellule endotelialiali) per le cellule endoteliali, il fattore di crescita derivato dalle piastrine - (PDGFR) o l'antigene neurone-gliale 2 (NG2) per peric...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i microvasi da più regioni del sistema nervoso centrale dei vertebrati lissencefalici e gyrencephalic.

Isolamento affidabile dei micronavi del sistema nervoso centrale in cinque gruppi di vertebrati

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Questo protocollo è significativo perché consente il confronto della microvascolarizzazione tra diverse regioni del sistema nervoso centrale, nonché tra individui diversi. Questa tecnica di isolamento delle microvezze può essere completata in un solo giorno ed elimina la necessità di ultracentrifugazione e dissociazione enzimatica. Rimuovere le meningi e il plesso coroideo può essere difficile.Assicurati di lavorare lentamente e con attenzione per garantire la completa rimozione di ogni tessuto. Per la dissezione del tessuto del SNC da un piccolo campione di vertebrato lissencefalico, posizionare il cervello raccolto in un tubo conico da 15 millilitri contenente soluzione di MV-1 sul ghiaccio e utilizzare le forcelle per recuperare l'ipofisi dalla sella turcica del cranio. Posizionare l'ipofisi in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri di soluzione MV-1 sul ghiaccio e rimuovere la pelle e il muscolo per esporre la colonna vertebrale.Dopo aver rimosso gli arti, la gabbia toracica e gli organi interni, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 18 per sciacquare la colonna vertebrale con una soluzione MV-1 fresca, in direzione caudale-rostrale in tutto il foro vertebrale lombare. Quindi posizionare il midollo spinale in un tubo da 5 millilitri contenente soluzione MV-1 fresca. Quindi, posizionare il cervello in una piastra di Petri sotto il microscopio sezionante e rimuovere le meningi con puntura a doppia prozione.Assicurati di controllare il midollo spinale per assicurarti che non rimangano pezzi di meningi. Usa le forcep per separare l'ipotalamo, il cervelletto, il tronco encefalico e la corteccia. Quando necessario, utilizzare pini e forbici per iris e molla per asportare i bulbi olfattivi e il talamo e utilizzare la puntura a doppia punta per rimuovere tutto il plesso coroideo da tutti i ventricoli cerebrali.Per la dissezione del tessuto del SNC da un grande campione di vertebrato ginesfalico, utilizzare un microscopio sezionante e una puntura a doppia punta, pinza e forbici per iris e molla per rimuovere le meningi da ogni tessuto del SNC, facendo attenzione a rimuovere eventuali pezzi di plesso coroideo dai ventricoli cerebrali. Per l'omogeneizzazione dei tessuti SNC raccolti, tritare ogni regione del SNC in pezzi da uno a due millimetri all'interno delle singole piastre di Petri. Per omogeneizzare i tessuti del SNC da piccoli campioni di vertebrati, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere un millilitro di soluzione MV-1 per sospendere il tessuto tritato.Quindi utilizzare la stessa pipetta di trasferimento per erogare la corteccia, il cervelletto, lo stelo cerebrale, il lobo ottico e i pezzi del midollo spinale in singole smerigliatrici di tessuto di vetro da 10 millilitri e utilizzare un pestello PTFE e cinque millilitri di soluzione MV-1 per macinare ogni set di tessuti per circa 10 colpi. Trasferire ogni liquame tissutale in singoli tubi conici da 15 millilitri sul ghiaccio e utilizzare le forcelle per posizionare l'ipotalamo e l'ipofisi in 100 microlitri di soluzione MV-1, in singoli tubi da 1,7 millilitri. Quindi, omogeneizzare attentamente ogni tessuto con una micropestle di vetro.Per omogeneizzare un grande campione di vertebrato, utilizzare una pipetta di trasferimento a taglio smussato per trasferire il tessuto tritato a una smerigliatrice di tessuto di vetro da 55 millilitri e attaccare la smerigliatrice a un agitatore in testa. Aggiungere metà del volume consigliato della soluzione MV-1 in base alla porzione specifica del SNC da omogeneizzare come indicato nella tabella e accendere l'agitatore in testa a circa 150 rotazioni al minuto. Spostare con cura il tubo di vetro su e giù per circa 30 secondi prima di spegnere l'agitatore in testa per aggiungere più soluzione MV-1 per un'omogeneizzazione aggiuntiva, fino a ottenere un liquame omogeneo.Quindi trasferire il tessuto omogeneizzato in un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Per la purificazione delle microvezze, pellettizzare il tessuto DEL SNC omogeneizzato per centrifugazione e scartare i supernatanti. Per un piccolo campione di vertebrati isolamento microvessel, pipettare la corteccia, il cervelletto, lo stelo cerebrale, il lobo ottico e il pellet del midollo spinale, in cinque millilitri di soluzione MV-2 fresca e ghiacciata per campione, circa 10 volte, prima di aggiungere altri cinque millilitri di soluzione MV-2 ghiacciata ad ogni tubo.Capovolgere con cura i tubi per mescolare e sospendere di nuovo l'ipotalamo e il pellet ipofisario in un millilitro di soluzione MV-2. Per l'isolamento di microvessel di campioni di vertebrati di grandi dimensioni, aggiungere 20 millilitri di soluzione MV-2 ghiacciata alla corteccia, al cervelletto, allo stelo cerebrale e al pellet di microvessel del midollo spinale e sospendere di nuovo i pellet in un revolver a tubo a 40 rotazioni al minuto per circa 5 minuti. Al termine della nuova sospensione, separare i licate dei tessuti DEL SNC per centrifugazione e ruotare lentamente ogni tubo per consentire al supernatante di passare lungo la parete per staccare con cura lo strato di mielina spesso e denso sull'interfaccia liquida dalle pareti del tubo.Scartare le interfacce mielina e liquido e asciugare la parete interna di ogni tubo con una spatola avvolta da una salvietta di carta a bassa pelucchi. Quindi, utilizzare una salvietta di carta contorta a bassa pelucchi per assorbire il liquido in eccesso e utilizzare punte a bassa legatura per sospendere di nuovo ogni pellet in un millilitro di soluzione MV-3. Per l'eluizione e la filtrazione di microvessel, mescolare alcuni millilitri di soluzione MV-3 fresca in ogni liquame di microvessel di tessuto CNS e, durante la miscelazione per evitare aggregati, filtrare ogni sospensione attraverso un colino Pruitt in singoli tubi conici da 50 millilitri.Posizionare un filtro a rete in nylon da 20 micrometri su un supporto filtrante modificato per regione CNS. Trasferire il supporto del filtro su un tubo conico da 50 millilitri e bagnare il filtro con cinque millilitri di soluzione MV-3 ghiacciata, assicurandosi che il tampone si riversi nel supporto del filtro, nel tubo conico. Trasferire le microvezze eluizzate su ogni filtro a rete di nylon da 20 micrometri e sciacquare le microvezze con da cinque a 10 millilitri di soluzione MV-3 ghiacciata.Utilizzare le forcep per trasferire ogni filtro in singoli becher contenenti la soluzione MV-3 ghiacciata e agitare delicatamente ogni filtro per circa 30 secondi per staccare le microvezze. Dopo il trasferimento in un tubo conico da 15 millilitri, raccogliere le microvezze per centrifugazione e utilizzare una pipetta a bassa legatura per sospendere di nuovo ogni pellet in un millilitro di soluzione MV-3 ghiacciata. Quindi, trasferire le sospensioni di microvessel da piccoli campioni di vertebrati in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri per la centrifugazione per cinque minuti a 20.000 volte G, in quattro gradi celsius.Per campioni di vertebrati di grandi dimensioni, trasferire la sospensione in singoli tubi di centrifuga a cinque millilitri e aggiungere quattro millilitri di soluzione MV-3 per la centrifugazione per cinque minuti a 2.000 volte G in quattro gradi celsius. I componenti intrinseci dell'unità neurovascolare possono essere rilevati all'interno di microvessi, isolati come dimostrato, mediante immunoetichettatura per CD31, PDGFR-beta e aquaporina quattro, inclusi i microvessi corticali, cerebellari, ipofisi, ipotalamici, cerebrali e spinali. Allo stesso modo, è possibile visualizzare l'espressione della proteina ve-cadherina aderenza, delle proteine di giunzione stretta CLDN5 e Zonula Occludens-1, della proteina di giunzione tricellulare angulin-1 e dei segni basali chemiochina ligando CXCL motivo 12, e gamma-glutamiltransferasi-1.Inoltre, la maggior parte delle microvessel sono prive dell'espressione dell'actina muscolare liscia alfa, indicando che questo protocollo di isolamento prende di mira selettivamente microvessel di piccolo calibro. Le microvessel ottenute da altri piccoli vertebrati lissencefalici, come uccelli, liard, rane e pesci, condividono alcune caratteristiche morfologiche, suggerendo che questo metodo è utile per un'ulteriore caratterizzazione delle differenze nelle unità neurovascolari tra le specie. La quantificazione dei cambiamenti nell'espressione proteica rivela un aumento della molecola di adesione cellulare vascolare uno, e della molecola di adesione giunzionale B lungo le microvezze del midollo spinale, durante il picco dell'encefalomielite autoimmune sperimentale.Tuttavia, la molecola di adesione cellulare vascolare uno è anche significativamente aumentato nei microvessi ipofisi, e diminuito nei microvessi ipotalamo e tronco encefalico. Inoltre, si osservano cambiamenti nella molecola di adesione cellulare vascolare un'espressione durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale cronica in tutti i tessuti del SNC e nell'espressione della molecola di adesione congiunzione B nell'ipotalamo e nei microvessi ipofisi. Le analisi quantitative, come western blot, PCR e immunoistochimica, possono essere eseguite seguendo questa procedura per rivelare approfondimenti sui modelli di espressione genica e proteica all'interno della barriera ematico-encefalica.La paraformaldeide è un reagente acutamente tossico e deve sempre essere maneggiata sotto il cofano dei fumi indossando dPI adeguati.

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Questo video dimostra l'isolamento di vasi intatti dal cervello di un topo che costituiscono la barriera emato-encefalica (BEE) insieme a neuroni e cellule gliali. I vasi isolati possono essere utilizzati come modello in vitro per studiare il loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi cerebrale.

Isolamento dei vasi cerebrali di topo: un protocollo per isolare i vasi intatti da un campione di cervello murino

Questo video mostra il processo di isolamento dei microvasi cerebrali dai ratti soppressi. Comprende la dissezione del cervello, la pulizia del tessuto e la digestione meccanica, seguita da centrifugazione ripetuta per isolare la frazione pura dei microvasi.

Un metodo per l'isolamento delle unità neurovascolari dal cervello di ratto

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono interconnesse da specifiche proteine giunzionali che formano una barriera altamente regolata che separa il sangue e il sistema nervoso centrale (SNC), la cosiddetta barriera emato-encefalica (BBB). L'isolamento delle cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello murino, come discusso in questo protocollo, consente studi dettagliati in vitro della BEE.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

Questo protocollo descrive il precondizionamento ipossico ripetitivo, o brevi esposizioni all'ipossia sistemica che riducono i volumi di infarto e l'interruzione della barriera emato-encefalica a seguito di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media nei topi. Descrive inoltre la doppia quantificazione del volume dell'infarto e dell'interruzione della barriera emato-encefalica dopo l'ictus per valutare l'efficacia della protezione neurovascolare.

Quantificazione della Protezione Neurovascular seguito ripetitivo ipossico precondizionamento e transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media nei topi

Descriviamo un protocollo che permette la purificazione del compartimento vascolare del cervello del topo. I vasi cerebrali isolati includono cellule endoteliali collegate da giunzioni strette e circondate da una lamina basale continua, periciti, cellule muscolari lisce vascolari e membrane astrogliali perivascolari.

Purificazione delle navi cervello di topo

Questo manoscritto descrive un protocollo semplice e riproducibile per l'isolamento delle arteriole intracerebrali (un gruppo di vasi sanguigni che comprende arteriole parenchimali, arteriole penetranti e arteriole pre-capillari) dai topi, da utilizzare in miografia a pressione, immunofluorescenza, biochimica e studi molecolari.

Isolamento e Incannulazione di cerebrale parenchimale Arteriole

Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

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Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.

Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto

Questo documento presenta due protocolli ottimizzati per l'esame delle cellule immunitarie residenti e di derivazione periferica all'interno del sistema nervoso centrale, tra cui il cervello, il midollo spinale e le meningi. Ognuno di questi protocolli aiuta ad accertare la funzione e la composizione delle cellule che occupano questi compartimenti in condizioni stazionarie e infiammatorie.

Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

Scopri un metodo affidabile per isolare i micronavi del sistema nervoso centrale in vertebrati lissencefalici e giroencefalici. Questa tecnica semplificata evita l'ultracentrifuga e consente studi comparativi sulla microvascolatura cerebrale.

Isolamento affidabile dei micronavi del sistema nervoso centrale in cinque gruppi di vertebrati

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