Name: Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri tre saggi in vitro per valutare la migrazione cellulare e le interazioni tra cellule endoteliali periventricolari umane e interneuroni GABAergici. Questi metodi semplici e a basso costo aiutano a comprendere i disturbi psichiatrici.

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Questo lavoro è stato sostenuto da premi dal National Institute of Mental Health (R01MH110438) e dall'Istituto Nazionale di Disturbi Neurologici e Ictus (R01NS100808) ad AV.

1. Cultura e conservazione delle cellule endoteliali umane
<ol><li>Mantenere le cellule endoteliali periventricolari umane su una matrice a membrana sotterranea rivestita a matrice (vedi Tabella dei materiali)di 6 pozzetti in mezzo a cellule endoteliali periventricolari (mezzo E6 contenente 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 e 5 gannive GABA) a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. Cambia mezzo ogni giorno alternativo.</li>
	<li>Scongelare la matrice della membrana del seminterrato a 4 gradi centigradi e creare una soluzione 1:100 diluindola in un mezzo DMEM/F12 freddo. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di 6 pozze con soluzione a matrice da 1 mL. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi per almeno 1 h prima dell'uso.</li>
	<li>Consentire alle cellule endoteliali periventrapiche umane di raggiungere una confluenza dell'80%-90%. Mezzo aspirato dal pozzo. Lavare i pozzetti una volta con 1 mL di sterile 1x PBS per pozzo.</li>
	<li>Scollegare le celle aggiungendo 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare (vedere Tabella dei materiali) per ogni pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Dopo 5 min, aggiungere 1 mL di mezzo di cellule endoteliali periventricolari. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 mL. NOTA: Qui usiamo Accutase per la dissociazione cellulare, a differenza di TrypLE nelle sezioni 3 e 4.</li>
	<li>Centrifuga cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il super-atante e respendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo cellulare periventricolare.</li>
	<li>Contare le celle vive utilizzando il metodo di esclusione blu trypan. Celle di semi in piastre fresche rivestite a matrice ad una densità di 1,2 x 105 celle/cm2. Incubare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.</li>
	<li>Conservare le cellule endoteliali periventricolari umane crioconservando nel mezzo di congelamento (90% di misura periventricolare di cellule endoteliali e 10% DMSO).<ol>
<li>Dissociare e raccogliere le cellule seguendo i passaggi 1.3 e 1.4 sopra. Contare le celle nella soluzione con il metodo di esclusione blu trypan.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare a 5 x 106 cellule / mL di mezzo di congelamento.</li>
		<li>Distribuisci 1 mL di mezzo di congelamento più cellule per crioviale. Posizionare le fiale nella camera piena di isopropanolo e raffreddare durante la notte a -80 gradi centigradi a 1 oM/min. Trasferire le fiale in un serbatoio di azoto liquido il giorno successivo per la conservazione a lungo termine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule endoteliali periventriculari umane per il saggio
<ol><li>Consentire alle cellule endoteliali periventrapiche umane di raggiungere il 70%-80% di confluenza.</li>
	<li>Dissociare le cellule seguendo i passaggi da 1,3 a 1,5 come descritto in precedenza. Contare le celle utilizzando il metodo di esclusione blu trypan.</li>
</ol>3. Preparazione di interneuroni GABAergici umani per il saggio
NOTA: sono stati acquistati commercialmente interneuroni GABAergici derivati da cellule staminali pluripotenti (iPSC) derivate dall'uomo (iPSC) e il mezzo neuronale è stato acquistato commercialmente (cfr. tabella dei materiali). I neuroni sono generati differenziando una linea iPSC derivata dal fibroblasto umano seguendo un protocollo sviluppato dal produttore. Le cellule sono state scongelate e coltivate secondo il protocollo del produttore.
<ol><li>Scongelare gli interneuroni GABAergici umani e li coltura in 12-bene piastra per due settimane ad una confluenza di 70%-80%.</li>
	<li>Il giorno dell'apputato, soluzione di dissociazione delle cellule calde (vedi Tabella dei materiali)e un mezzo neuronale a 37 gradi centigradi per 10 min prima dell'uso.</li>
	<li>Mezzo aspirato da ogni pozzo contenente le cellule. Lavare le cellule con 1 mL di sterile 1x PBS per pozzo.</li>
	<li>Scollegare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di dissociazione preriscaldata per pozzo e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Aggiungere 1 mL di mezzo neuronale per pozzo. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 mL. Triturare delicatamente per dissociare i grumi cellulari.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 380 x g per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il super-natante e rispendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo neuronale. Contare le celle vive utilizzando il metodo di esclusione blu trypan.</li>
</ol>4. Preparazione del controllo delle cellule endoteliali umane per il saggio
NOTA: Sono state acquistate commercialmente le cellule endoteliali di origine endoteliale di controllo e il mezzo di cellule endoteliali (Tabella dei materiali). Queste cellule endoteliali sono generate differenziando una linea iPSC derivata dal fibroblasto umano al destino endoteliale a seguito di un protocollo sviluppato dal produttore. Le cellule sono state scongelate e coltivate sul substrato fibronectino secondo il protocollo del produttore. Le lastre rivestite di fibronectina sono state preparate seguendo il protocollo del produttore.
<ol><li>Lo sisma controlla le cellule endoteliali umane e le coltura in 6-po placca ad una confluenza di 80%-90%.</li>
	<li>Il giorno del saggio, soluzione di dissociazione delle cellule calde (vedi Tabella dei materiali)e un grado di mezzo endoteliale a 37 gradi centigradi per 10 min prima dell'uso.</li>
	<li>Aspirare il mezzo da ogni pozzo contenente le cellule. Lavare le cellule con 1 mL di sterile 1x PBS per pozzo.</li>
	<li>Staccare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di dissociazione preriscaldata per pozzo. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 1 mL di mezzo a cellule endoteliali per bene per neutralizzare la soluzione di dissociazione. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo cellaele endoteliale. Contare le celle vive utilizzando il metodo di esclusione blu trypan.</li>
</ol>5. Preparazione di inserti di cultura in un solo pozzo
<ol><li>Soluzione di laminina scongelata da 1 mg/mL a temperatura ambiente o pernottamento a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Rivestire un numero adeguato di piatti da 35 mm con soluzione poli-l-ornitaria dello 0,01% (1 mL per piatto). Incubare i piatti a temperatura ambiente per almeno 1 h.</li>
	<li>Diluire la soluzione di laminina 1 mg/mL 1:300 in acqua sterile ad una concentrazione finale di 3,3 g/mL immediatamente prima dell'uso.</li>
	<li>Completamente aspirato poli-L-ornitina da ogni piatto. Sciacquare accuratamente ogni piatto 3x con acqua sterile e aspirare completamente per evitare la tossicità cellulare indotta da poli-l-ornitina.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di laminina da 3,3 g/mL a ciascun piatto e incubare a 37 gradi durante la notte o almeno 1 h. Rimuovere la soluzione di laminina dal piatto immediatamente prima dell'uso. NOTA: In alternativa, conservare i piatti contenenti laminina in 4 gradi centigradi. Prima dell'uso, i piatti in un incubatore a coltura cellulare a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Tagliare tre lati di un pozzo di un inserto a coltura in silicone a due pozzetti (Figura 1A) utilizzando una lama sterile per generare un inserto a uno ben (Figura 1B). NOTA: Tenere saldamente fissato l'inserto a due pozzetto sulla superficie dell'imballaggio originale durante il taglio per garantire un taglio uniforme e proteggere l'adesivo dell'inserto.</li>
	<li>Soluzione di laminina aspirata dai piatti. NOTA: Non lavare i piatti con PBS sterile o acqua dopo l'incubazione della laminina. Le superfici umide impediranno una stretta adesione all'inserto della coltura.</li>
	<li>Rimuovere l'inserto monocolore con una pinzetta sterile e metterlo al centro del piatto rivestito poli-l-ornina/laminin. Premere lungo i bordi dell'inserto per fissarlo alla superficie del piatto.</li>
	<li>Capovolgere con attenzione il piatto per verificare che l'inserto sia saldamente aderente.</li>
	<li>Tenere il piatto a testa in giù e contrassegnare il contorno del vano inserto utilizzando un pennarello nero permanente con una punta ultrafine (Figura 1C).</li>
</ol>6. Analisi della migrazione a lunga distanza
<ol><li>Sospendere gli interneuroni GABAergici umani ad una concentrazione di 3 x 104 cellule/70 - L di mezzo neuronale. Seme 70 - L di soluzione cellulare all'interno di ogni inserto di coltura one-well. NOTA: La densità di seeding degli interneuroni è come da raccomandazione del produttore.</li>
	<li>Sospendere le cellule endoteliali periventricolari umane ad una concentrazione di 3 x 104 cellule/70 -L di mezzo di cellule endoteliali periventricolari. Seme 70 - L di soluzione cellulare all'interno di ogni inserto di coltura one-well. NOTA: Il numero di cellule endoteliali periventriculari umane seminato ad un rapporto 1:1 con il numero di neuroni semi.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di mezzo neuronale nella parabola neuronale per riempire l'area intorno all'inserto ed evitare che il rivestimento si allofa. Allo stesso modo, aggiungere 1 mL di mezzo di cellule endoteliali periventricolari nella parabola di cellule endoteliali periventricolari. NOTA: Aggiungere il supporto lentamente lungo il bordo del piatto in modo che l'inserto non sia disturbato.</li>
	<li>Controllare al microscopio per verificare che le cellule non perdano dal vano inserto.</li>
	<li>Incubare le cellule per 24 h a 37 e 5% di CO2. Dopo 24 h incubazione, controllare al microscopio per verificare che le cellule siano attaccate correttamente e che non vi sia alcuna perdita durante la notte.</li>
	<li>Dopo 48 h di seeding, rimuovere delicatamente l'inserto con una pinzetta sterile. Controllare al microscopio per verificare che lo strato cellulare rimanga indisturbato (giorno 0).</li>
	<li>Rimuovere il mezzo dal piatto neuronale e aggiungere 1 mL di mezzo neuronale fresco. Allo stesso modo, rimuovere il mezzo dalla parabola di cellule endoteliali periventricolari e aggiungere 1 mL di mezzo di cellule endoteliali periventricolari fresche. NOTA: Mettere da parte un numero richiesto di piatti e correggere con 4% PFA per le immagini del giorno 0.</li>
	<li>Incubare le cellule per 5 giorni a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2. Dopo 5 giorni, rimuovere il mezzo, fissare le celle con 4% PFA per 10 min, e lavare 3x con 1x PBS.</li>
	<li>Neuroni macchiati con anti-umano z-Tubulino o anti-umano MAP2 anticorpo, e cellule endoteliali con anticorpo CD31 anti-umano. Alla fine dell'immunostaining, aggiungere 1 mL di supporto di montaggio antifade ad ogni piatto.</li>
</ol>7. Analisi migrazioni di co-cultura
<ol><li>Co-sospende 3 x 104 interneuroni GABAergici e 3 x 104 cellule endotiliarie periventriculari umane in 70 - L di mezzo di co-coltura (mezzo di manutenzione periventricolacolare 50% senza GABA e 50% medio neuronale). Semina questa soluzione cellulare all'interno del vano di inserto di un pozzo. Preparare un numero appropriato di tali piatti di esempio. NOTA: GABA non è stato aggiunto nel mezzo di co-cultura per escludere l'effetto di GABA esogeno sulla migrazione.</li>
	<li>Controllare al microscopio per verificare che le cellule non perdano dal vano inserto.</li>
	<li>Aggiungere lentamente 1 mL di mezzo di cocoltura lungo il lato del piatto per evitare che il rivestimento si allievi. NOTA: Aggiungere il supporto lentamente lungo il bordo del piatto in modo che l'inserto non sia disturbato.</li>
	<li>Come primo controllo, seme 3 x 104 interneuroni GABAergici umani solo in 70 - L di mezzo di co-cultura per inserto un-bene. Preparare un numero appropriato di tali piatti.</li>
	<li>Come secondo controllo, co-seme 3 x 104 interneuroni umani GABAergic con 3 x 104 controllare le cellule endoteliali umane in 70 : L di mezzo di co-coltura per un unico bene inserto. Preparare un numero adeguato di piatti.</li>
	<li>Incubare i piatti per 24 h a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2. Dopo 24 h incubazione, controllare al microscopio per verificare che le cellule siano attaccate correttamente e che non vi sia perdita.</li>
	<li>Dopo 48 h di seeding, rimuovere delicatamente l'inserto con una pinzetta sterile. Controllare al microscopio per verificare che lo strato cellulare non sia disturbato (giorno 0).</li>
	<li>Rimuovere il supporto e aggiungere 1 mL di fresco mezzo di co-coltura. NOTA: Mettere da parte un numero appropriato di piatti per l'acquisizione di immagini del giorno 0.</li>
	<li>Incubare le cellule per 5 giorni a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo 5 giorni, rimuovere il mezzo, fissare le celle con 4% PFA per 10 min, e lavare 3x con 1x PBS.</li>
	<li>Macchie con anticorpi MAP2 anti-umani o anti-umani per etichettare i neuroni. Alla fine dell'immunostaining, aggiungere 1 mL di supporto di montaggio antifade ad ogni piatto.</li>
</ol>8. Chemio-attrazione Assay
<ol><li>Posizionare un inserto di coltura a tre ben al centro di un piatto rivestito in poli-L-ornina/laminina da 35 mm utilizzando una pinzetta sterile.</li>
	<li>Capovolgere il piatto. Contrassegnare il contorno intorno al vano centrale dell'inserto utilizzando un pennarello nero permanente con punta ultra fine.</li>
	<li>Seme 3 x 104 interneuroni GABAergici umani nel compartimento medio in 70 : L di mezzo neuronale (Figura 3A).</li>
	<li>Seme 104 cellule endoteliali periventriculari umane in 70 -L di mezzo di cella endoteliale periventricolari e 104 celle endoteliali di controllo in 70 : l di controllo endoteliale medio cella nei due compartimenti esterni rispettivamente (Figura 3A).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di mezzo di co-cultura (50% mezzo di manutenzione periventricolare senza GABA e 50% medio neuronale) lungo il lato del piatto per evitare che il rivestimento sul piatto si asciughi.</li>
	<li>Controllare al microscopio per verificare che le cellule non perdano dal vano inserto.</li>
	<li>Incubare le cellule per 24 h a 37 e 5% di CO2. Dopo 24 h incubazione, controllare al microscopio per verificare che le cellule siano attaccate correttamente e che non vi sia perdita.</li>
	<li>Dopo 48 h di seeding, rimuovere delicatamente l'inserto con una pinzetta sterile. Controllare al microscopio per verificare che lo strato cellulare non sia disturbato (giorno 0).</li>
	<li>Rimuovere il supporto e aggiungere 1 mL di fresco mezzo di co-coltura. NOTA: Mettere da parte il numero richiesto di piatti per le immagini del giorno 0.</li>
	<li>Incubare le cellule per 36 h a 37 e 5% di CO2. Dopo 36 h, mezzo aspirato, fissare le celle con 4% PFA per 10 min, e lavare 3x con 1x PBS.</li>
	<li>Macchia interneuroni gabAergici umani con anti-uomo z-Tubulino o anticorpo MAP2 anti-umano. Alla fine della procedura di colorazione, aggiungere 1 mL di supporto di montaggio antifade in ogni piatto.</li>
</ol>9. Imaging e analisi dei dati
<ol><li>Collocare il pinto di analisi immuno-colorato al microscopio con ingrandimento 4X.</li>
	<li>Mantenere un bordo lungo del contorno rettangolare (realizzato nel passaggio 5.10 sopra) nel campo visivo. Scattare immagini di celle nello spazio senza celle adiacente a tale contorno. Acquisire immagini lungo il bordo lungo destro e il bordo lungo sinistro del contorno rettangolare (Figura 2B). NOTA: le celle posizionate in diagonale rispetto al rettangolo non vengono considerate a causa dell'ambiguità nella selezione del bordo corto o lungo come contrassegno iniziale. Inoltre, il numero di celle che migrano attraverso il bordo corto sono spesso significativamente inferiori (probabilmente a causa del minor numero di celle iniziali lungo il bordo corto) e non vengono considerate.</li>
	<li>Aprire le immagini in ImageJ. Calcolare la distanza tra ogni cella e il segno dicontorno( Figura 2D) utilizzando ImageJ.</li>
	<li>Per valutare la migrazione in termini di numeri di cella, impostare una distanza specifica dal contorno nell'immagine acquisita in ImageJ. Contare il numero di celle presenti entro questa distanza. Calcola il numero medio, la deviazione standard e la significatività statistica utilizzando un software appropriato.</li>
</ol>

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<li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li>
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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Qui, abbiamo descritto tre saggi in vitro che insieme forniscono una valutazione quantitativa delle proprietà endoteliali periventriculari umane. Questi saggi saranno preziosi per ottenere intuizioni meccanicistiche sull'interazione delle cellule endoteliali periventriculari umane con gli interneuroni umani. Gli esperimenti che utilizzano ligandi, inibitori o cellule con knockdown o sovraespressione specifici del gene identificheranno o convalideranno i giocatori molecolari che mediano la migrazione di interneuroni guida...

Le cellule endoteliali formano il rivestimento dei vasi sanguigni e mediano importanti funzioni che includono il mantenimento della permeabilità della parete del vaso, la regolazione del flusso sanguigno, l'aggregazione delle piastrine e la formazione di nuovi vasi sanguigni. Nel cervello, le cellule endoteliali fanno parte di una barriera emato-encefalica critica che controlla strettamente lo scambio di materiali tra il cervello e il flusso sanguigno1. I nostri studi nell'ultimo decennio hanno identificato nuovi ruoli neurogenici delle cellule endoteliali cerebrali che hanno implicazioni significative per lo sviluppo e il comportamento del cervello2,3,4,5. Abbiamo dimostrato che il prosencefalo embrionale del topo è vascolarizzato da due distinti sottotipi di vasi, i vasi di pial e i vasi periventricolari, che differiscono per anatomia, origine e profilo di sviluppo2. Le cellule endoteliali che rivestono questi due sottotipi di vasi mostrano differenze distinte nei loro profili di espressione genica. Mentre le cellule endoteliali piale esprimono per lo più geni legati all'infiammazione e alla risposta immunitaria, le cellule endoteliali periventricolari sono arricchite in modo univoco nell'espressione di geni comunemente associati a neurogenesi, migrazione neuronale, chemiotassi e guida degli assoni3. Le cellule endoteliali periventriculari ospitano anche un nuovo percorso di segnalazione GABA che è distinto dal tradizionale percorso di segnalazione neuronale GABA5. Concomitante con la sua espressione genica, sono state trovate cellule endoteliali periventricolari per regolare la migrazione e la distribuzione di interneuroni GABAergici nella neocorteccia in via di sviluppo. Durante lo sviluppo embrionale, le cellule endoteliali periventriculari subiscono una migrazione a lunga distanza lungo un gradiente ventrale-dorsale per stabilire la rete vascolare periventricolare2,3. Questa rotta migratoria si rispecchia un giorno dopo dagli interneuroni. Gli interneuroni che migrano interagiscono fisicamente con la rete vascolare periventricolare preformata e la usano come guida per raggiungere la loro destinazione finale nella neocorteccia. Oltre ad agire come substrato fisico, le cellule endoteliali periventricolari servono come fonte di segnali di navigazione per i neuroni che migrano. Guide endotiliariche GABA semeggiate da cellule interneuroni e regola i loro schemi di distribuzione finale4. I difetti nella migrazione e distribuzione di interneuroni sono associati a disturbi neuropsichiatrici come autismo, epilessia, schizofrenia e depressione6,7,8,9,10. Pertanto, lo studio delle funzioni endoteliali periventricolari e la loro influenza sulla migrazione interneurone nel contesto umano diventa fondamentale per affrontare la patogenesi di questi disturbi.
Abbiamo generato cellule endoteliali periventricolari umane da cellule staminali embrionali umane nel nostro laboratorio11, utilizzando la tecnologia indotta di cellule staminali pluripotenti (iPSC)12,13. Per verificare se le cellule endoteliali periventriculari umane imitano fedelmente le cellule endoteliali periventricolari del topo e per valutare quantitativamente la loro influenza sulla migrazione interneurone, abbiamo sviluppato tre saggi in vitro: un saggio di migrazione a lunga distanza, un test di migrazione co-culturale e un'attrazione chemio-attrazione. Qui descriviamo i protocolli per questi saggi in dettaglio. Tutti e tre i saggi si basano sull'uso di inserti di coltura del silicone per creare una piccola patch rettangolare di celle (di dimensioni fisse) circondate da spazio senza celle. La distanza di migrazione viene valutata misurando la distanza tra le posizioni finali delle celle dal bordo della patch rettangolare che è stata delineata il giorno 0. Nel test sulla migrazione a lunga distanza, le cellule endoteliali periventricolari umane vengono semimate come patch al centro di un piatto di 35 mm e vengono calcolate le distanze percorse dalle cellule per un lungo intervallo di tempo. Nel saggio di migrazione co-culturale, le cellule endoteliali periventranti umane sono co-semiseme con interneuroni umani come una patch in un piatto da 35 mm. Questa configurazione consente di esaminare l'effetto delle interazioni fisiche dirette di questi due tipi di cellule sul tasso di migrazione degli interneuroni. Il saggio chemio-attrazione misura la migrazione degli interneuroni in risposta a segnali chemio-attraenti secreti dalle cellule endoteliali periventriculari umane. Gli interneuroni sono semi come una macchia rettangolare, con cellule endoteliali periventrapicolari umane e controllano le cellule endoteliali non periventriculari come cerotti di dimensioni simili su entrambi i lati. Ciascuna delle patch cellulari è separata da uno spazio privo di cellule di 500 m. La risposta degli interneuroni viene valutata quantificando il numero di cellule migrate verso cellule endoteliali periventricolari rispetto al controllo delle cellule endoteliali non periventricolari.
Questi saggi forniscono una solida valutazione delle funzioni endoteliali periventricolari umane e della loro influenza sulla migrazione degli interneuroni. La nuova configurazione del saggio a lunga distanza e della analisi della migrazione co-culturale fornisce uno spazio senza cellule nell'intervallo di centimetri (1-1,5 cm) per consentire il rilevamento della migrazione a lunga distanza. Una sintesi delle caratteristiche dei nostri saggi rispetto ad altri saggi popolari è presentata nella Tabella 1. Collettivamente, i saggi qui descritti serviranno come piattaforma per valutare le cellule endoteliali periventricolari "malattie" e gli interneuroni generati da iPSC di disturbi cerebrali come la schizofrenia, l'autismo o l'epilessia. Questi saggi possono anche essere utilizzati per determinare in che modo le diverse condizioni (ad esempio inibitori, ligando, RNAi) influenzano la migrazione cellulare. Infine, questi saggi possono essere ottimizzati per altri tipi di cellule per misurare la migrazione a lunga distanza, la chemio-attrazione o la migrazione mediata cellulare.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di dissociazione accutasi</td>, <td>Millipore Sigma</td><td>SCR005</td>, <td>Soluzione di dissociazione cellulare (per cellule endoteliali periventricolari, fase 1.4)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-umano&beta;-tubulina</td>, <td>Biolegend</td><td>802001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-umano CD31 Anticorpo</td><td>Millipore Sigma</td><td>CBL468</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Anticorps</td><td>Neuromics</td><td>CH22103</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-caspasi 3</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB3623</td><td></td></tr><tr><td>Controllo delle cellule endoteliali umane</td><td>Dinamica cellulare</td><td>R1022</td><td></td></tr><tr><td>Controllo delle cellule endoteliali Integratore di terreno</td><td>Dinamica cellulare</td><td>M1019</td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEMF/12 medio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>E6 medio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Thermofisher Scientific PHG0261</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Neuroni GABAergici umani</td><td>Dinamica cellulare</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>Neuroni GABAergici umani media di base</td><td>Dinamica cellulare</td><td>M1010</td><td></td></tr><tr><td>Neurone GABAergico umano Integratore neurale</td><td>Dinamica cellulare</td><td>M1032</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Matrice a membrana seminterrato</td></tr><tr><td>Montaggio Medio</td><td>Laboratori vettoriali</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-ornitina</td><td>Sigma</td><td>p4957</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Thermofisher 12563011</td> scientifica <td></td><td>Soluzione di dissociazione cellulare (per interneuroni GABAergici e cellule endoteliali, sezioni 3 e 4)</td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Kit completo</td><td>Lifeline Cell Technologies</td><td>LL-0003</td><td>Componente di controllo del terreno di coltura in silicone a 2 pozzetti per cellule endoteliali umane</td></tr><tr><td>- Inserto</td><td>ibidi</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>silicone a 3 pozzetti Inserto per colture</td><td>ibidi</td><td>80369</td><td></td></tr><tr><td>Piastra da 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di PFA al 4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase invertito</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>FSX-100</td><td></td></tr></tbody></table>

migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni gabaergic

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Ruolo della vascolatura cerebrale nello sviluppo del sistema nervoso e nell'eziologia dei disturbi cerebrali sta guadagnando sempre più attenzione. I nostri studi recenti hanno identificato una popolazione speciale di cellule vascolari, le cellule endoteliali periventricolari, che svolgono un ruolo fondamentale nella migrazione e distribuzione di interneuroni GABAergici del prosencefalo cerebrale durante lo sviluppo embrionale. Questo, unito alle loro funzioni autonome alle cellule, allude a nuovi ruoli di cellule endoteliali periventricolari nella patologia dei disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia, l'epilessia e l'autismo. Qui, abbiamo descritto tre diversi saggi in vitro che valutano collettivamente le funzioni delle cellule endoteliali periventriculari e la loro interazione con gli interneuroni GABAergici. L'uso di questi saggi, in particolare in un contesto umano, ci permetterà di identificare il legame tra le cellule endoteliali periventricolari e i disturbi cerebrali. Questi saggi sono semplici, a basso costo e riproducibili e possono essere facilmente adattati a qualsiasi tipo di cellula aderente.

I passaggi per impostare un inserto di coltura a un solo pozzo all'interno di un piatto da 35 mm sono illustrati nella Figura 1. L'analisi della migrazione a lunga distanza e il test sulla migrazione co-culturale hanno utilizzato un inserto monogrado per sedare il numero desiderato di cellule al centro di un piatto rivestito di poli-L-ornina/laminina 35 mm. Il giorno 0, le celle erano presenti come patch rettangolare (Figura 2<st...

Vi presentiamo tre semplici saggi in vitro: il saggio di migrazione a lunga distanza, il saggio di co-cultura sulla migrazione e l'analisi chemio-attrazione-che valutano collettivamente le funzioni delle cellule staminali umane derivate cellule endoteliali periventricolari e le loro interazione con gli interneuroni GABAergic.

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Questo protocollo descrive tre saggi in vitro che valutano collettivamente le funzioni delle cellule endoteliali periventricolari umane e la loro interazione con internatori GABAergici umani. I risultati di questi test forniranno una visione critica del legame tra cellule endoteliali periventricolari e disturbi cerebrali. Questi test sono semplici, a basso costo e consentono la misurazione della migrazione cellulare nell'intervallo di centimetri, che non è ottenuta da altri saggi esistenti.Difetti nella migrazione e distribuzione degli internauri GABAergici sono associati a disturbi psichiatrici, come autismo, epilessia, schizofrenia e depressione. Pertanto, è fondamentale studiare l'interazione delle cellule endoteliali periventricolari con internauri gabaergici nel contesto umano per affrontare la patogenesi di questi disturbi. Inizia preparando le cellule umane per il saggio.Consentire alle cellule endoteliali periventricolari umane di raggiungere il 70-80% di confluenza, quindi dissociarle secondo le indicazioni del manoscritto e contarle usando il metodo di esclusione blu del trypan. Per preparare internauri GABAergici umani, soluzione di dissociazione cellulare calda e un'aliquota di mezzo neuronale a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aspirare il mezzo da ogni cellule ben contenenti e lavarle con un millimetro di PBS per pozzo.Staccare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione di dissociazione prebelliche per pozzo e incubandole a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di mezzo neuronale per pozzo e trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri, triturando delicatamente per dissociare i grumi cellulari. Centrifugare le cellule a 380 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un millilitro di mezzo neuronale.Quindi contare le celle vive usando l'esclusione blu trypan. Preparare il controllo delle cellule endoteliali umane riscaldando la soluzione di dissociazione cellulare e un'aliquota di mezzo endoteliale a 37 gradi celsius, 10 minuti prima dell'uso. Aspirare il mezzo da ogni pozzo e lavarli con un millilitro di PBS per pozzo.Staccare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri della soluzione di dissociazione prebellica ad ogni pozzo e incubando la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo cellulare endoteliale per pozzo per neutralizzare la soluzione di dissociazione e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 200 volte G per cinque minuti, aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di mezzo cellulare endoteliale.Utilizzare quindi il metodo di esclusione trypan per contare le celle. Preparare un inserto di coltura del pozzo tagliando tre lati di un pozzo di un inserto in coltura in silicone a due po po', con una lama sterile. Rimuovere l'inserto con pinzette sterili e posizionarlo al centro di un piatto rivestito in poli-L-ornitina e laminina, quindi premere lungo il bordo dell'inserto per fissarlo alla superficie.Capovolgere con cura il piatto per verificare che l'inserto sia saldamente aderendo e contrassegnare il bordo del vano inserto utilizzando un mercato nero permanente con una punta ultra fine. Sospendere gli internauri gabaergici umani in cellule endoteliali periventricolari neuronali e umane e nel mezzo cellulare endoteliale a una concentrazione di 30.000 per 70 microlitri, quindi seminare 70 microlitri della soluzione cellulare all'interno di ogni inserto di coltura del pozzo. Aggiungere un millilitro di mezzo neuronale al piatto neuronale per riempire l'area intorno all'inserto e impedire l'essiccazione del rivestimento.Allo stesso modo, aggiungere un millilitro di mezzo cellulare endoteliale al piatto cellulare endoteliale periventricolare. Controllare le cellule al microscopio per verificare che non perdano dal vano inserto, quindi incubarle a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo l'incubazione, controllare nuovamente le cellule al microscopio per verificare che siano state correttamente attaccate.48 ore dopo la semina, rimuovere delicatamente l'inserto con pinzette sterili e controllare le cellule al microscopio per verificare che lo strato cellulare rimanga indisturbato. Rimuovere il mezzo sia dal neurone che dai piatti cellulari endoteliali periventricolari e aggiungere un millilitro di mezzo fresco ad ogni piatto. Incubare le cellule a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per cinque giorni.Quindi, rimuovere il supporto, fissare le celle con 4%PFA per 10 minuti e lavarle tre volte con PBS. Per eseguire il saggio di co-coltura, sospendere 30.000 internauri GABAergici e 30.000 cellule endoteliali periventricolari umane in 70 microlitri di mezzo co-coltura, quindi seminare questa soluzione cellulare all'interno di un compartimento ben inserito. Dopo 48 ore, rimuovere l'inserto.Incubare la co-coltura a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per cinque giorni. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo, fissare le cellule con il 4%PFA e lavarle tre volte con PBS. Per eseguire il saggio chemio-attrazione, posizionare un inserto di coltura di tre pozzi al centro di un piatto di 35 millimetri rivestito in poli-L-ornitina e laminina, capovolgere il piatto e contrassegnare il confine intorno al compartimento centrale dell'inserto utilizzando un pennarello permanente con una punta ultra fine.Seme 30.000 internauri GABAergici in 70 microlitri di mezzo neuronale nel compartimento centrale, quindi seme 10.000 cellule endoteliali periventricolari e 10.000 controllano le cellule endoteliali e 70 microlitri del rispettivo mezzo nei due compartimenti esterni. Aggiungere un millilitro di mezzo co-coltura lungo il lato del piatto per evitare che il rivestimento sul piatto si asciughi. Dopo 48 ore, rimuovere l'inserto e incubare le cellule a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per 36 ore.Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo, fissare le cellule e lavarle tre volte con PBS. Test di migrazione a lunga distanza e co-coltura sono stati utilizzati per indagare le interazioni tra le cellule endoteliali periventricolari e i neuroni GABAergici. Nel saggio sulla migrazione a lunga distanza, le cellule sono iniziate come una patch rettangolare il giorno zero, ma di 48 ore, erano migrate nello spazio privo di celle.La colorazione immunocitochimica con anticorpo Anti-Active Caspase-3, un marcatore di apoptosi, non ha mostrato alcun segnale apoptotico nei neuroni seminati. Nel saggio di migrazione della co-coltura, quando gli internauroni venivano co-seminati con cellule endoteliali periventricolari umane, i neuroni percorrevano distanze più lontane rispetto a quando gli internauroni venivano seminati da soli o quando co-seminati con cellule endoteliali di controllo. Nel saggio chemio-attrazione, un numero significativamente più elevato di internauroni migrò verso cellule endoteliali periventricolari rispetto al controllo delle cellule endoteliali, confermando che gli internauri gabaergici rispondono selettivamente a segnali chemio-attraenti secreti dalle cellule endoteliali periventricolari.Questi saggi possono essere modificati usando ligandi, inibitori o areni di dosaggio per ottenere intuizioni meccaniche sulle interazioni delle cellule endoteliali periventricolari umane con internauri umani. Possono anche essere usati per studiare l'interazione delle cellule endoteliali periventricolari umane con altre cellule neurali come riportato dal nostro gruppo e da altri. Quando si tenta questa procedura, è importante fissare saldamente l'inserto sul piatto e tenerlo indisturbato durante tutto il saggio, altrimenti potrebbe portare a perdite cellulari, distacco della cella o disallineamento dell'inserto con il limite disegnato.Il nostro lavoro ha indicato il ruolo autonomo cellulare delle cellule endoteliali periventricolari umane nella patogenesi di disturbi psichiatrici come schizofrenia, epilessia e autismo. Questi test consentiranno quindi la valutazione delle cellule endoteliali periventricolari masate derivate da pazienti con questi disturbi utilizzando la tecnologia IPSC.

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Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic (Video) | JoVE Journal

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

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