Abbiategrasso Brain Bank Protocol per la raccolta, l'elaborazione e la caratterizzazione dei cervelli di invecchiamento

Poiché la prevalenza di un disturbo neurocognitivo è in continuo aumento, il nostro obiettivo è quello di ottenere, caratterizzare e conservare campioni di tessuto cerebrale di qualità per ottenere una diagnosi accurata e far luce sui meccanismi neurodegenerativi. Considerando l'assimetria cerebrale, la nostra metodologia di campionamento consente di eseguire tutti i meta studi su tessuti istologicamente ben definiti da entrambi gli emisferi e i numerosi dati possono essere raccolti e correlati attraverso il deep learning. Gli effetti additivi sul danno cerebrale da più patologie sono frequentemente osservati.

La diagnosi definitiva richiede la combinazione della sindrome clinica con i risultati neuropatologici per scoprire la patogenesi della malattia e possibili terapie. Le nuove procedure di taglio e la gestione delle sezioni macro sono difficili, ma sono anche essenziali per ottenere buoni risultati. Una squadra allenata e affiatata è fondamentale per superare queste difficoltà.

Il nostro protocollo include una serie di passaggi che sono necessari destrezza dei mammiferi, quindi la dimostrazione visiva può essere più utile dei testi descrittivi per i ricercatori che desiderano padroneggiare queste tecniche. Dopo aver confermato la thanatografia, utilizzare un bisturi affilato per fare un'incisione del cuoio capelluto attraverso la pelle dei capelli e il tessuto sottocutaneo sulla piastra coronale dalla punta del processo mastoideo da un lato all'altro, passando sopra il vertice. Separare attentamente le due pieghe del cuoio capelluto dal cranio e continuare l'incisione fino a quando il grasso super orbitale giallo diventa visibile.

Riflettere il cuoio capelluto anteriormente e tirare l'altra sezione del tessuto posteriormente. Utilizzando bisturi e forcep, raccogliere un piccolo campione del muscolo temporale su ciascun lato del cranio, posizionando un campione in formaldeide al 4% e l'altro campione a quattro gradi Celsius. Usando una sega elettrica tagliare il cranio in un taglio a V sul lato frontale e rimuovere la calotta cranica.

Dopo aver tagliato le meningi, raccogliere un pezzo di dura per la fissazione e un altro per il congelamento. Inserire un ago da 3,5 pollici calibro 20 attaccato a una siringa da 10 millilitri attraverso il corpo calloso per raggiungere il terzo ventricolo e ritrarre lo stantuffo per ottenere circa 10 millilitri di liquido spinale cerebrale. Valutare il colore dell'aspetto e la torbidità del fluido e misurare il pH.

Tirare delicatamente entrambi i lobi frontali per sollevare il cervello e tagliare entrambi i nervi ottici infundibulum, le arterie carotide interne e il terzo, quarto, quinto e sesto nervo cranico. Tagliare il tentorio per raggiungere la fossa posteriore e tagliare le arterie vertebrali e i nervi cranici inferiori. Quindi inserire il bisturi il più profondo possibile attraverso il foramen magnum per tagliare la porzione più caudale della medula e rimuovere con cura l'intero cervello.

Usa il bisturi per apparere fino all'osso sopra la grotta di Meckel e raccogliere il ganglio gassario da ogni lato per fissarlo e congelarlo. Utilizzare un maglio chirurgico e uno scalpello per fratturare l'ossea sella turcica e rimuovere la ghiandola pituitaria per la fissazione in formaldeide al 4%. Ispezionare il cranio e l'intero cervello da alterazioni macroscopiche e cambiamenti vascolari.

Utilizzare un metro per misurare i diametri trasversali e della postura anteriore del cervello e pesare il cervello su una scala. Recupera attentamente il cerchio di Willis per la valutazione macroscopica per la presenza di varianti anatomiche, lesioni o stenosi dei vasi. Separare e ispezionare il cerebro, il cervelletto e il tronco encefalico prima di pesare i tessuti singolarmente.

Rimuovere da uno a due, da due a quattro centimetri pezzi quadrati di leptomeninges dalla convessità e conservare i campioni in un mezzo di coltura DMEM ad alto contenuto di glucosio completo a quattro gradi Celsius. Raccogliere la ghiandola pineale per la fissazione in formaldeide al 4% e rimuovere i bulbi olfattivi e i nervi ottici per la fissazione e il congelamento di una di ciascuna coppia. Posizionare il cerebro, il cervelletto e il tronco encefalico sul ghiaccio a quattro gradi Celsius.

Quando tutti i tessuti di interesse sono stati raccolti, utilizzare una colla super adesiva per riattaccare l'osso e utilizzare un ago chirurgico e suture non assorbibili per riricucire il cuoio capelluto. Per la dissezione della banca cerebrale utilizzare un coltello sezionato per tagliare il tronco encefalico assialmente e fare il primo taglio a livello del midbrain rostrale attraverso il collicolo superiore per ottenere due fette per esporre la substantia nigra. Tagliare il tronco encefalico in fette da 10, otto millimetri facendo attenzione a includere tagli che passano attraverso i pons rostrali vicino ai margini superiori del quarto ventricolo per osservare il locus caeruleus e attraverso il midollo oblongata inferiore alla striata acustica, appena sopra l'apice inferiore del quarto ventricolo per ottenere fette tra cui il nucleo motorio dorsale del vago.

Etichettare tutte le fette in modo caudale rostrale come BS per il tronco encefalico seguito da numeri arabi. Dopo l'ultima sezione del tronco encefalico, utilizzare la designazione SC per il midollo spinale seguita da numeri arabi. Tagliare il cervelletto sul piano sagittale per separare i due emisferi cerebellari a livello dei parassiti ed eseguire sezionamenti sagittali per ottenere cinque fette da ogni emisfero.

Assegnare a tutte le fette dei vermi il nome CBR o CBL rispettivamente per il cervelletto destro e sinistro e utilizzare i numeri arabi per identificare ogni sezione. Successivamente, separare i due emisferi del cerebro attraverso il corpo calloso sul piano sagittale prima di affezionare l'emisfero singolarmente lungo il piano coronale passando tra il chiasmo ottico e i corpi mammillari attraverso il polo temporale del lobo frontale, il cingolato anteriore, la commissure anteriore, il nucleo di gangli minori e basali. Fai un secondo taglio circa un centimetro posteriormente passando attraverso i corpi mammillari ed esponendo i gangli basali, il talamo anteriore sub talamo e l'amigdala.

Continuare a sezionare le regioni anteriore e posteriore fino a ottenere fette da 15 a 21 centimetri per ogni emisfero. Posizionare la fetta su una superficie piana man mano che vengono raggiunte seguendo la loro posizione originale nella direzione posteriore anteriore dal polo frontale a quello occipitale, con la porzione continua con le diapositive precedenti rivolte verso l'alto. Una volta posizionate tutte le fette, selezionare le sezioni principali da fissarsi per l'istopatologia, comprese le sezioni precedentemente acquisite e le sezioni ippocampali, parietali e occipitali, ed etichettare le fette come L o R seguite da numeri arabi, inclusa un'etichetta che indica se la fetta deve essere fissa o congelata.

Quando tutti i tessuti sono stati sescati ed etichettati, ottenere un'immagine per ogni serie di sezioni prima della loro fissazione o congelamento. Per congelare i campioni posizionare le sezioni di tessuto alternative riservate su un vassoio di alluminio precongelato e coprire le sezioni con una piastra di alluminio ad incastro per mantenerle piatte. Quindi congelare le fette in azoto liquido per tre minuti prima di posizionare i campioni congelati all'interno di un sacchetto di plastica etichettato con i corrispondenti codici identificativi e i numeri delle fette per una conservazione nella scatola criogenica appropriata a 80 gradi Celsius.

Per fissare i campioni posizionare le sezioni di tessuto alternative riservate in singoli pezzi di garza e posizionare le fette in soluzione di formalina tamponata al fosfato al 10% per cinque giorni in una stanza fredda di quattro gradi Celsius. 24 cervelli su 27 raccolti hanno ricevuto la caratterizzazione neuropatologica completa con una diagnosi patologica clinica definita. L'analisi quantitativa preliminare dell'elettroencefalogramma di una serie di 36 donatori cerebrali indica che la percentuale principale di ritmo alfa è significativamente inferiore nei principali disturbi neurocognitivi rispetto ai normali disturbi neurocognitivi lievi anziani.

Qui viene mostrato un esempio di patologia asimmetrica con un'atrofia laterale destra evidente macroscopicamente con le gravi dilatazioni ventricolari osservate nella sezione coronale destra rispetto a sinistra. Un altro caso mostra un infarto dell'emisfero destro, mentre un altro esemplare mostra una chiara atrofia del corpo mammillario destro. Le macro sezioni possono essere macchiate per identificare la perdita di mielina o la distribuzione dell'immunoreattività all'interno degli emisferi.

Questi campioni provengono da gemelli che hanno avuto un'insorgenza clinica del morbo di Alzheimer in diversi tempi a causa di fattori epigenetici e ambientali. Tuttavia, l'analisi microscopica ha rivelato un quadro neuropatologico molto simile che indica un'elevata patologia del morbo di Alzheimer e angiopatia amiloide. In questi due pazienti, tuttavia, la stessa diagnosi clinica del morbo di Alzheimer non corrispondeva esattamente alle caratteristiche neuropatologiche, che hanno rivelato un duo di demenza in eziologie multiple.

In effetti, il primo caso ha presentato i corpi di Lewy nel giro singola bugia e substantia nigra. E il secondo caso ha mostrato corpi di Lewy associati a neuriti Lewy nell'amigdala e nel nucleo minori. La fotografia delle fette è attentamente per un'accurata identificazione delle aree anatomiche durante l'analisi microscopica.

La fissazione e il congelamento delle singole fette sono importanti anche per preservare la microstruttura tissutale Omics la topografia dell'attivazione genica e della distribuzione proteica e correlare questi dati con l'istopatologia. Colture cellulari da tessuti ben caratterizzati, anche un'indagine sulla patogenesi della malattia. Indossare sempre adeguati dispositivi di protezione individuale in quanto un tessuto cerebrale acquisito è considerato potenzialmente infettivo e perché è richiesto l'uso di strumenti pericolosi come strumenti affilati e azoto liquido.