Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse

Questo protocollo è significativo per la creazione e la determinazione delle mutazioni desiderate mente-corpo nel genoma di Pseudomonas aeruginosa, così come il test dell'effetto delle mutazioni sulla riduzione della virulenza in un modello di topo riproducibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è una convalida del cromo e una riproducibilità del modello di infezione del mouse. I batteri lavorano costantemente, cambiano continuamente.

Per rallentare questo processo, usiamo arresti congelati, li insaccamo, li appendiamo su più rung alla modifica prima di testarli nel modello di mouse. Qualcuno che non ha familiarità con questi metodi molto probabilmente avrà difficoltà con lo sviluppo e la selezione di possibili ricombinanti crossover da testare. Inoltre, la gestione dei topi per l'infezione sarà difficile per qualcuno che non ha familiarità con il lavoro degli animali.

Questo metodo può essere applicato per testare altri agenti patogeni e i loro mutanti, così come la virulenza infettare nei topi. Rispetto ai modelli attuali, le procedure con riproducibilità più la convalida dei cloni prima e dopo l'infezione possono avvantaggiare altri investigatori sul campo. La dimostrazione visiva di questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su procedure estese che possono essere difficili da comprendere o comprendere solo attraverso la lettura.

Inizia coltivando singole colonie crossover e ricombinanti in Pseudomonas Isolation Broth o PIB. Inoculare e striare 10 microlitri di ogni coltura su piastre PIA preri warmed, integrati con saccarosio al 10%. Quindi incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, rimuovere le piastre dall'incubatore e ispezionarle per la crescita. La colonia resistente al saccarosio dovrebbe essere doppio ricombinante crossover. Utilizzare stuzzicadenti sterili per rattoppare almeno 20 colonie su piastre prerifapidate di PIA, PIA integrata con saccarosio al 10% e PIA integrata con carbenicillina.

Incubare le piastre durante la notte ed esaminarle per la crescita il giorno successivo. I veri ricombinanti a doppio crossover saranno sensibili alla carbenicillina e al saccarosio. Schermo da 10 a 20 colonie per la cancellazione, utilizzando la PCR della colonia.

Raccogliere la crescita di un sospetto doppio crossover ricombinante con uno stuzzicadenti sterile e sospenderlo in 50 microlitri di PBS. Far bollire la sospensione a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugarlo per tre minuti a 13.000 volte G e posizionare sul ghiaccio.

Quindi, eseguire la PCR in base alle indicazioni manoscritte. Una volta terminata la PCR, eseguire l'elettroforesi in gel di agarosio sui prodotti. I prodotti di amplificazione più piccoli indicano colonie in cui la regione di interesse è stata eliminata.

La mattina delle iniezioni, scongelare i crioviali delle cellule batteriche a quattro gradi Celsius per tre o quattro ore. Tenere le fiale sul ghiaccio dopo lo scongelamento e iniettare i topi entro due ore. Trasferire il contenuto di ogni crioviale in un nuovo tubo a due millilitri e centrifugarlo a 4.500 volte G per 10 minuti.

Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in un millilitro di PBS. Ripetere la centrifugazione e sospendere di nuovo le cellule in PBS a una concentrazione finale di 2,5 per 10 alla nona colonia formando unità per millilitro. Prelevare tre campioni dalla sospensione finale di ogni ceppo per convalidare concentrazione, genotipo e fenotipo.

Per ogni ceppo, aliquota 1,5 millilitri della sospensione cellulare in un tubo da due millilitri e preparare il PBS per le iniezioni di controllo. Raccogliere i topi e i materiali necessari per le iniezioni in una stanza chirurgica sterile per animali e pulire tutte le superfici con salviette igienizzante prima di iniziare. Indossare due paia di guanti di lattice per limitare il rischio di puntura, se morsi, così come un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e maschera facciale.

Rimuovere il mouse dalla gabbia e pesarlo, contrassegnando la coda con marcatore permanente per il tracciamento post-iniezione. Aprire una nuova siringa da un millilitro con un ago calibro 27 e redigere 200 microlitri di PBS sterile. Afferrare il mouse dietro le orecchie, usando il pollice e l'indice, e pizzicare per creare una piega della pelle sulla nuca.

Quindi, fissare la coda nel palmo usando il mignolo per tenere il topo piatto e immobile. Inserire l'ago con un angolo di 30 gradi nella cavità peritoneale a sinistra o a destra della linea mediana. Sollevare leggermente l'ago per assicurarsi che non sia stato inserito negli organi.

Quindi, iniettare lentamente il PBS e ritirare l'ago. Un bolo nel sito di iniezione è tipico. Posizionare l'ago nel contenitore di smaltimento degli affilati designato e spostare il mouse in una gabbia separata.

Ripeti la procedura con il topo successivo e dopo che tutti i topi di una gabbia sono stati iniettati, riportali alla loro gabbia originale. Dopo aver iniettato il gruppo di controllo, iniettare i gruppi di test utilizzando la stessa procedura. Una volta completate tutte le iniezioni, riportare i topi nella stanza di alloggio e pulire l'area di lavoro con salviette igienizzante.

Per immaginare gli animali, preparare il sistema di imaging impostando i parametri della fotocamera e riscaldando il palco. Impostare il flusso di ossigeno su 1,5 litri al minuto e isoflurane al 3,5% e spostare il mouse nella camera anestetica, quindi allo stadio stabilizzato della temperatura, dopo l'anestesia. Posizionare il mouse sulla schiena con le braccia distese e montare un cono nasale per la somministrazione del 2,5% di isoflurane durante l'imaging.

Chiudi la porta e scatta immagini bioluminescenti e raggi X del mouse. Al termine dell'imaging, riportare il mouse nella gabbia e monitorarlo. Dovrebbe riprendere conoscenza entro tre o cinque minuti.

Le eliminazioni genomiche mirate sono state confermate dalla COLONIA PCR con primer specifici che hanno amplificato la regione di interesse. Le colonie con la cancellazione genomica producono una banda PCR più corta rispetto alle colonie di tipo selvaggio. L'iniezione intraperitoneale del ceppo attenuato di P aeruginosa, PGN cinque, ha provocato una mortalità dello 0%, equivalente alla mortalità osservata con E.coli BL 21.

L'iniezione del ceppo genitore, tuttavia, è stata fatale per l'80% dei topi. La progressione dell'infezione è stata monitorata utilizzando ceppi genitori e attenuati marcati a bioluminescenza. Il ceppo attenuato è rimasto localizzato nel sito di iniezione fino a quando la bioluminescenza non è sbiadita, il che probabilmente ha coinciso con la clearance dell'infezione.

Il metodo presentato ha esaminato solo la mortalità prodotta dal ceppo. Aspetti immunologici e tossicologici più approfonditi potrebbero essere utilizzati per determinare la dinamica dell'infezione e l'effetto finale che l'infezione ha che non si traducono in morte. La cosa più importante nella procedura è l'ampia convalida effettuata, tra vari passaggi dall'identificazione iniziale alla sperimentazione animale.

La mancanza di determinati passaggi di convalida potrebbe potenzialmente portare a risultati errate, in quanto i ceppi testati possono subire mutazioni e selezioni o essere contaminati. Con lo sviluppo di queste due tecniche, pensiamo che questo permetterà ai nostri ricercatori nel campo dell'immunologia delle infezioni di indagare in modo più efficace come la potente interazione del pacchetto porta al fenotipo estremo, alla sepsi e alla mortalità. L'impatto di diversi nutrienti sulle varianti può essere confrontato attraverso il dosamento delle dimensioni dei batteri.