Name: Approccio sperimentale per esaminare la segnalazione di Leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Scopri come esaminare la segnalazione della leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione utilizzando modelli murini e tecniche di denervazione chirurgica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (MO18M211).
1. Infusione di Leptina
 NOT:</</c0> Al fine di esaminare l'effetto della leptina sulla respirazione, abbiamo infuso leptina sottocutaneamente in topi magri C57BL/6J da una pompa osmotica per aumentare i livelli di leptina circolante a quelli osservati nei topi obesi.
<ol><li>
Preparazione della pompa osmotica
	<ol>
<li>Pesare la pompa vuota per verificare il peso netto della soluzione caricata.</li>
		<li>Aggiungere la leptina (5 mg/mL) alla pompa osmotica (1 l/h per 3 giorni). Riempire la pompa con una piccola siringa (1 mL). Dopo il riempimento, chiudere la pompa con il tubo di riempimento con smussato fornito a 27 calibro. NOT:</</c2> La siringa e il tubo collegato devono essere privi di bolle d'aria.</li>
		<li>Dopo il riempimento, pesare nuovamente la pompa per verificare il peso netto della soluzione.</li>
		<li>
Inserire la pompa di leptina sottocutaneamente nell'area interscapulare. NOTA: Se si desidera avviare immediatamente l'infusione, incubare la pompa pre-riempita nella salina sterile a 37 gradi centigradi per almeno 4-6 h (preferibilmente durante la notte).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Risposta Ventilatoria ipossica (HVR)
 NOT:</</c0> Le condizioni termoneutrali eliminano i fattori stressanti imposti dalla temperatura ambiente fredda e modificano significativamente il metabolismo nei topi. Pertanto, tutte le misurazioni respiratorie devono essere eseguite in condizioni termoneutrali (t - 30 gradi centigradi) utilizzando un'incubatrice neooatale12 (Figura 1A). La camera di pletismografia di tutto il corpo (WBP) è stata utilizzata per tutte le misurazioni. Tutti gli animali devono essere acclimatati alla camera di pletismografia barometrica e a un collare finto per la successiva registrazione dell'ossimetria dell'impulso per 3-5 giorni prima delle misurazioni dell'HVR. HVR viene registrato tra 10 AM e 5 PM. HVR viene soppresso durante il sonno, quindi può essere misurato separatamente durante il sonno e la veglia tranquilla13. Per garantire lo specifico stadio sonno-veglia dell'animale durante la misurazione HVR, gli elettrodi EEG/EMG devono essere impiantati come un headmount EEG/EMG come descritto in precedenza14. Gli animali devono essere autorizzati a recuperare per almeno 72 h dopo il headmount. La messa in scena del sonno deve essere eseguita in epoche 5 s. Il sonno NREM è riconosciuto dall'attività EEG a onde lente che occupa più del 50% dell'epoca. La veglia tranquilla si manifesta con l'attività alfa EEG in assenza di movimenti. Il sonno REM è identificato dall'attività alfa e theta EEG predominante in presenza di tono muscolare ridotto su EMG. Tipicamente, il sonno REM non viene osservato durante le sfide del gas HVR.
<ol><li>Il protocollo di registrazione HVR
	<ol>
<li>Utilizzare la camera WBP delle seguenti dimensioni: diametro interno di 80 mm, altezza di 50,5 mm e volume di 0,4 L. La camera WBP è composta da due camere, camere sigillate e di riferimento, e una piattaforma circolare per posizionare il mouse14 (Figura 1B). L'afflusso e il deflusso all'interno della camera sono controllati da fonti di pressione positive e negative che mantengono la pressione atmosferica. Questo controllo crea un flusso di distorsione costante nella camera e previene la ritenzione di CO2. Per ulteriori informazioni sull'impostazione WBP, vedere Hernandez e i colleghi15.</li>
		<li>Misurare la temperatura all'interno della camera e l'umidità relativa nella stanza prima di posizionare il mouse nel WBP.</li>
		<li>Misurare il peso corporeo e la temperatura rettale.</li>
		<li>Posizionare il collare ossidato intorno al collo del mouse (l'area deve essere precedentemente rasata).</li>
		<li>Posizionare il mouse all'interno del WBP e assicurarsi che la camera sia completamente sigillata per evitare perdite d'aria.</li>
		<li>Attendere circa 30 min fino a quando il mouse è silenzioso e la camera è ad un volume costante.</li>
		<li>Normoxia: dopo 30 min, se il mouse è silenzioso, iniziare a registrare i segnali respiratori e la saturazione dell'ossigeno periferico (SpO2)alla fase normossia (21% FiO2 a 1 atm di pressione) per 20 min, utilizzando LabChart 7 Pro (versione 7.2).</li>
		<li>Ipossia: dopo 20 min di nodi di nodia di nodia di normsione, iniziare a registrare il primo ciclo di ipossia acuta e SpO2. Per la fase di ipossia, esporre gli animali a un flusso costante di gas misto composto da 10% O2 e 3% CO2 per 5 min.<ol>
<li>Durante i primi 30 secondi di ipossia, il gas misto scorre attraverso la camera attraverso 2 piccoli porti laterali alla base permettendo al FiO2 di scendere dal 21% (a 1 atm di pressione) al 10%.</li>
			<li>Dopo i 30 s iniziali, chiudere uno dei piccoli porti laterali della camera WBP e continuare a registrare presso l'ipossia costante al 10% FiO2 per 5 min. NOTA: La miscela di 10% O2 e 3% CO2 a ipossia viene utilizzata al fine di mantenere eucapnea11.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dopo i 5 min di ipossia, esporre nuovamente il mouse all'aria ambiente (21% FiO2 a 1 atm di pressione) commutando la sorgente di afflusso.</li>
		<li>Attendere almeno 30 min fino alla successiva registrazione della normsia per recuperare dalla precedente esposizione ipossica per evitare il fenomeno del roll-off del ventilatore (cioè la soppressione centrale della respirazione durante l'ipossia16). NOT:</</c20> Ripetere i cicli di normossia/ipossia tre volte in ogni topo per assicurare la riproducibilità delle misurazioni. Secondo la nostra esperienza, ulteriori (più di 3 volte in un dato giorno) esposizioni ipossiche dovrebbero essere evitate, a causa dell'adattamento ventilatorio (il fenomeno del roll-off).</li>
		<li>Alla fine dell'esperimento, calibrare la camera WBP (con il mouse è ancora all'interno) iniettando 1 mL di aria ambiente 3 volte con una siringa collegata a una delle piccole porte laterali alla base della camera.</li>
		<li>Misurare nuovamente la temperatura nella camera con l'animale al suo interno.</li>
		<li>Aprire la camera e misurare la temperatura rettale del mouse prima di riposizionarlo nella sua gabbia di casa.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcolo HVR
	<ol>
<li>Digitalizza tutti i segnali per il calcolo HVR a 1.000 Hz (frequenza di campionamento per canale). NOT:</</c2> L'analisi del volume delle maree WBP viene eseguita nel grafico di laboratorio 7 sulla base dell'equazione di Drorbaugh e Fenn17. Le variabili richieste comprendono la temperatura rettale del topo e la temperatura della camera (prima e dopo la misurazione dell'HVR), l'umidità relativa e la costante del gas camera. Questa costante risulta dalla deflessione della pressione WBP dopo le iniezioni di 1 mL dell'aria nella fase di calibrazione. Per ulteriori dettagli, vedere Hernandez e colleghi15.</li>
		<li>Dopo aver calcolato l'equazione Drorbaugh e Fenn, moltiplicare il canale della camera del volume di marea (Vt) per la costante.</li>
		<li>
Selezione delle registrazioni per l'analisi
		<ol>
<li>Normoxia: selezionare solo le sezioni di respirazione costante con volume di marea costante. Evitare le sezioni in prossimità dei movimenti del mouse.</li>
			<li>Ipossia: scartare i primi 30 s quando i livelli di O2 sono in calo dal 21% al 10%, selezionare le sezioni da 30 s a 2 min di 10% O2 esposizione (un intervallo di 90 s). All'interno di questo intervallo, selezionare solo le sezioni con respirazione costante con volume di marea costante. Evitare le sezioni in prossimità dei movimenti del mouse. L'analisi è affidabile se almeno 10 s di ipossia è selezionata in ogni ciclo. NOT:</</c9> La componente periferica di chemoreflex governata da CB predomina durante i primi 1-2 min di esposizione16,18,19. Durante la seconda fase, tra 2 min e 5 min di esposizione ipossica, sia la periferica che la componente centrale svolgono un ruolo. Infine, la terza fase, > 5 min, è caratterizzata da ipoventilazione (il fenomeno del roll-off) governata prevalentemente da chemorecettori centrali. La nostra esperienza dimostra che i topi sono spesso svegli durante l'esposizione ipossica a causa degli interruttori manuali nella fonte del flusso d'aria.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dopo la selezione, calcolare la ventilazione media minuto (VE) in condizioni di normossiche e ipossiche utilizzando la formula VE : frequenza respiratoria X volume di marea.</li>
		<li>Calcolare lo SpO2 medio a condizioni di normossia e ipossia.</li>
		<li>Calcolare manualmente l'HVR utilizzando la formula HVR (VE (10% O2) - VE (21%O2)) / (SpO2 (10% O2) – SpO2 (21% O2)). NOT:</</c26> Nei topi C57BL/6J, la pompa osmotica per l'infusione di leptina può compromettere l'accurata rilevazione del segnale SpO2 da parte del collare del collo. In questo caso, l'HVR viene calcolato in base ai valori fiO2 in condizioni di normossiche e ipossiche come HVR , che è il valoreDi V , E / FiO211.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Denervazione del corpo Carotide o dissezione del nervo del sinus carotide (CSND)
 NOT:</</c0> Abbiamo eseguito la denervazione chirurgica e chimica combinata una settimana a parte, perché la denervazione chirurgica da sola non abolisce il chemoreflex ipossico.
<ol><li>
Preparazione chirurgica
	<ol>
<li>Eseguire tutte le procedure su topi adulti maschi C57BL/6J. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici. Utilizzare guanti chirurgici sterili, siringhe e applicatori con punta di cotone.</li>
		<li>Anestesizzare i topi maschi C57BL/6J con 1-2% isoflurane utilizzando un cono naso e posizionare una coperta calda per prevenire l'ipotermia. L'Isoflurane è attentamente titolato per mantenere la frequenza respiratoria a 1 Hz (60 respiri/min). L'adeguatezza dell'anestesia prima dell'inizio degli interventi chirurgici sarà valutata dalla frequenza respiratoria, dall'assenza di movimenti e rumori udibili, dall'assenza di risposta agli stimoli tattili e dal riflesso del pedale dell'arto anteriore o dell'arto posteriore.</li>
		<li>Somministrare buprenorfine (0,05 mg/kg) intraperitonealmente per prevenire il disagio da dolore. Rimuovere i capelli nella regione ventrale del collo e disinfettare l'area con betadine e alcol.</li>
		<li>Per prevenire l'desiccazione corneale, lubrificare gli occhi dei topi con unguento oftalmico sterile durante l'anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedure CSND Fase 1: denervazione chirurgica<ol>
<li>Dopo l'incisione della linea mediana, esporre la biforcazione delle arterie carotidecomuni comuni rimuovendo i tessuti connettivi e il tessuto adiposo.</li>
		<li>Identificare il nervo ipoglossale, che di solito è molto prominente, e poi sollevarlo per esporre il nervo glossofangeal immediatamente sotto. I nervi del peccato carotideti seziosto si legano bilateralmente utilizzando forbici a micro molla.</li>
		<li>Chiudere l'incisione con una sutura di seta 6-0.</li>
		<li>Somministrare 1 mL di normale solista salina sottocutaneamente per prevenire la disidratazione.</li>
		<li>Casa i topi in una camera di recupero e monitorare il loro comportamento ogni 15 min per iniziale 1 h fino a quando i topi riacquistano coscienza per mantenere la recumbency sternale. Riportare i topi alle gabbie di casa dopo che sono stati completamente recuperati. Continuare a monitorare i topi due volte al giorno per i prossimi 3 giorni. Dare ulteriore buprenorfina se i topi mostrano segni di dolore (ad esempio, ridotto appetito, irrequietezza). Fase 2: denervazione chimica</li>
		<li>Una settimana dopo l'intervento, dipingere l'arteria carotide con una soluzione del 2% fenolo diluito in etanolo nei punti di ramificazione dal nervo glossofagiongeale al polo cranico del CB. La stessa cura post-operatoria deve essere fornita dopo la denervazione chimica come descritto sopra nella sezione di denervazione chirurgica. NOTA: Per un gruppo di chirurgia fittizia, vengono eseguite le stesse procedure ad eccezione della dissezione del nervo carotidese del seno.</li>
		<li>Lasciare che gli animali si riprendano per 5-7 giorni prima delle misurazioni HVR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Espressione di LepRb nel CB utilizzando un vettore adenovirale (Ad-LepRb) vs controllo (Ad-Lac)
<ol><li>
Sospensioni Ad-LepRb e Ad-Lac
	<ol>
<li>Trasfecare i topi con adenovirus (Ad-LepRb-GFP, 2-5x1010 pfu/mL per la sovraespressione, Ad-Lacz, 1 x 1010 pfu/mL per il controllo) all'area CB.</li>
		<li>Scongelare la matrice Matrigel immergendo la fiala nel ghiaccio in un frigorifero a 4 gradi durante la notte.</li>
		<li>Sospendere delicatamente l'adenovirus nella matrice di Matrigel liquido a 1:5 (1 -L di matrice Di Matrigel e 4 -L di adenovirus applicato bilateralmente).</li>
		<li>Mantenere sempre la sospensione virale sul ghiaccio fino a quando non viene applicato nel CB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione chirurgica
	<ol>
<li>Utilizzare gli stessi strumenti chirurgici del protocollo CSND.</li>
		<li>Anestetizza resthetico LepRb-deficient db/db topi con 2-2,5% isoflurane utilizzando un cono naso e posizionare gli animali su una coperta calda per prevenire l'ipotermia. L'Isoflurane è attentamente titolato per mantenere la frequenza respiratoria a 1 Hz (60 respiri/min). L'adeguatezza dell'anestesia sarà valutata dalla frequenza respiratoria, dall'assenza di movimenti e rumori udibili, dall'assenza di risposta agli stimoli tattili e dal riflesso del ritiro del pedale dell'arto anteriore o posteriore.</li>
		<li>Somministrare buprenorfine (0,05 mg/kg) per via intraperitonele.</li>
		<li>Rimuovere i capelli nella regione ventrale del collo e disinfettare l'area con betadine e alcol come nel protocollo CSND.</li>
		<li>Per prevenire l'desiccazione corneale, lubrificare gli occhi dei topi con unguento oftalmico sterile durante l'anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trattamento dell'adenovirus del CB
	<ol>
<li>Esporre i CB come descritto nel protocollo CSND e applicare 5 ll della sospensione virale all'area CB bilateralmente.</li>
		<li>Attendere 2-3 min fino a quando la matrice liquido Matrigel diventa un gel. Dopo aver confermato che la sospensione virale è stata congealed, chiudere l'incisione con 6.0 sutura di seta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dopo l'intervento chirurgico
	<ol>
<li>Casa i topi in una camera di recupero e monitorare il loro comportamento ogni 15 min per iniziale 1 h fino a quando i topi riacquistano coscienza per mantenere la recumbency sternale. Riportare i topi alle gabbie di casa dopo che sono stati completamente recuperati. Continuare a monitorare i topi due volte al giorno per i prossimi 3 giorni. Dare ulteriore buprenorfina se i topi mostrano segni di dolore (ad esempio, ridotto appetito, irrequietezza).</li>
		<li>Somministrare Buprenorfina (0,05 mg/kg) intraperitonealmente come necessario per prevenire il disagio del dolore durante il periodo post-operatorio.</li>
		<li>Misurare l'HVR 9 giorni dopo la trafezione dell'adenovirus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>O'donnell, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+prevents+respiratory+depression+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Leptin prevents respiratory depression in obesity.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).</li>
<li>Polotsky, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+gender+exacerbates+respiratory+depression+in+leptin-deficient+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).</li>
<li>Bassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+leptin+replacement+enhances+chemorespiratory+responses+in+leptin-deficient+mice+independent+of+changes+in+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Pflu%CC%88gers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).</li>
<li>Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+respiratory+activity+of+leptin+at+the+level+of+the+solitary+tract+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).</li>
<li>Considine, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+immunoreactive-leptin+concentrations+in+normal-weight+and+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans.</a> New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).</li>
<li>Maffei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+levels+in+human+and+rodent%3A+measurement+of+plasma+leptin+and+ob+RNA+in+obese+and+weight-reduced+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects.</a> Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).</li>
<li>Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+serum+leptin+with+hypoventilation+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity.</a> Thorax. 57, 75-76 (2002).</li>
<li>Berger, S., Polotsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+Leptin+Resistance+in+the+Pathogenesis+of+Obstructive+Sleep+Apnea%3A+A+Possible+Link+to+Oxidative+Stress+and+Cardiovascular+Complications%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947(2018).</li>
<li>Ribeiro, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+blunts+the+effects+of+leptin+on+ventilation+and+on+carotid+body+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity.</a> The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+signaling+in+the+carotid+body+regulates+a+hypoxic+ventilatory+response+through+altering+TASK+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression.</a> Frontiers in Physiology. 9, 249(2018).</li>
<li>Caballero-Eraso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+acts+in+the+carotid+bodies+to+increase+minute+ventilation+during+wakefulness+and+sleep+and+augment+the+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response.</a> The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).</li>
<li>Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoneutrality+modifies+the+impact+of+hypoxia+on+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).</li>
<li>Polotsky, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+interrupted+leptin+pathways+on+ventilatory+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control.</a> Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).</li>
<li>Pho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+replacement+on+sleep-disordered+breathing+in+the+leptin-deficient+ob%2Fob+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse.</a> Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).</li>
<li>Hernandez, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+whole+body+plethysmography+system+for+the+continuous+characterization+of+sleep+and+breathing+in+a+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse.</a> Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).</li>
<li>Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+domains+of+the+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time domains of the hypoxic ventilatory response.</a> Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).</li>
<li>Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+barometric+method+for+measuring+ventilation+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A barometric method for measuring ventilation in newborn infants.</a> Pediatrics. 16, 81-87 (1955).</li>
<li>Duffin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+ventilatory+response+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measuring the ventilatory response to hypoxia.</a> The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).</li>
<li>Teppema, L. J., Dahan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ventilatory+Response+to+Hypoxia+in+Mammals%3A+Mechanisms%2C+Measurement%2C+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis.</a> Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).</li>
<li>Nurse, C. A., Fearon, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotid+body+chemoreceptors+in+dissociated+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture.</a> Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).</li>
<li>Kumar, P., Prabhakar, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+chemoreceptors%3A+function+and+plasticity+of+the+carotid+body%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body.</a> Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).</li>
<li>Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilatory+and+central+neurochemical+reorganisation+of+O2+chemoreflex+after+carotid+sinus+nerve+transection+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat.</a> The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi o divulgazioni contrastanti.

L'obiettivo principale del nostro studio è stato quello di esaminare gli effetti respiratori della segnalazione della leptina nel CB. Diversi protocolli sono stati sviluppati per valutare il ruolo della leptina in modo meccanicistico. In primo luogo, il contributo specifico di CB all'HVR è stato analizzato da un'attenta quantificazione dell'HVR durante i primi 2 min di esposizione ipossica. In secondo luogo, la rilevanza della CB nell'up-regolazione del controllo della respirazione mediata dalla leptina è stata esaminata...

Un adipocito prodotto ormone leptina agisce nell'ipotalamo per sopprimere l'assunzione di cibo e aumentare il tasso metabolico. Studi condotti nel nostro laboratorio1,2 e da altri ricercatori3,4 hanno mostrato che la leptina aumenta la risposta ventilatoria ipercapnica (HVR) prevenendo l'ipoventilazione dell'obesità nella leptina obesità carente. Tuttavia, la maggior parte degli individui obesi hanno alti livelli di leptina plasmatica e dimostrano resistenza agli effetti metabolici e respiratori dell'ormone5,6,7,8. La resistenza alla leptina è multifattoriale, ma la permeabilità limitata della barriera emato-encefalica (BBB) alla leptina svolge un ruolo importante. Proponiamo che la leptina agisca al di sotto della BBB in un organo chiave di sensibilità ipossica periferica, i corpi carotidi (CB), per difendere la respirazione in individui obesi. Le CB esprimono la lunga isoformazione funzionale del recettore della lepina, LepRb, ma il ruolo della CB negli effetti respiratori della leptina non è stato sufficientemente chiarito9,10.
L'obiettivo del nostro metodo era quello di esaminare l'effetto della segnalazione di leptina nel CB sull'HVR. La nostra logica era quella di eseguire (a) esperimenti di perdita di funzione infondendo leptina nei topi con corpi carotidi intatti e corpi carotidi denervati seguiti da misurazioni HVR; (b) guadagno di esperimenti di funzione in topi db/db privi di LepRb, in cui abbiamo misurato l'HVR al basale e dopo l'espressione di LepRb esclusivamente in CB. Il vantaggio delle nostre tecniche era che abbiamo eseguito tutti i nostri esperimenti su topi non adeguatamente svincolati durante la sonnoenza e la veglia. I ricercatori precedenti hanno eseguito i loro esperimenti in anestesia9 o non hanno misurato gli effetti della leptina durante il sonno10. Inoltre, il nostro studio è il primo a utilizzare un approccio unico di guadagno di funzione con espressione LepRb selettiva in CB descritto sopra.
In generale, il nostro approccio può essere generalizzato ad altri recettori espressi in CB e il loro ruolo nella sensibilità ipossica. I ricercatori possono infondere un ligando a un recettore di interesse e misurare l'HVR al basale e dopo la denervazione CB. Come approccio complementare, un recettore di interesse può essere sovraespresso nelle misurazioni CB e HVR può essere eseguito prima e dopo la sovraespressione utilizzando la nostra tecnologia descritta in questo manoscritto.

<table><tbody><tr><td>1 mL Siringhe da insulina</td><td>BD Biosciences</td><td>309311</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Ad-Lacz</td><td>Dr. Christopher Rhodes (Università di Chicago)</td><td></td><td>1 x 1010 pfu/mL</td></tr><tr><td>Ad-LepRb-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-263380</td><td>2-5 x 1010 pfu/mL</td></tr><tr><td>Carrello per anestesia</td><td>Atlantic Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57Bl/6J</td><td>Jackson laboratory</td><td>000664</td><td>Tope Strain</td></tr><tr><td>Cotton Garza Spugne</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>db/db</td><td>Jackson laboratory</td><td>000697</td><td>Tope</td></tr><tr><td>Strain Ethanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Vetone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Lab Grafico</td><td>Data Science International (DSI)</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spring Scissors</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ox Plus</td><td>STARR Life Sciences Corp.</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Mouse Ox Plus Collare Sensore</td><td>STARR Life Sciences Corp.</td><td>015022-2</td><td>Clip per colletto medio Special 7"</td></tr><tr><td>Camera di pletismografia per tutto il corpo del topo</td><td>Data Science International (DSI)</td><td>PLY3211</td><td></td></tr><tr><td>Ohio Care Plus Incubatore</td><td>Ohmeda</td><td>HCHD000173</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operative</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501753-G</td> Pompa osmotica <td>diritta</td></tr><tr><td></td><td>Alzet</td><td>1003D</td><td>1 &mu; L/h, 3 giorni</td></tr><tr><td>Fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Proteina di leptina di topo ricombinante</td><td>R & D systems</td><td>498-OB-05M</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>soluzione salina</td><td>RICCA Chemical</td><td>7210-16</td><td>Cloruro di sodio allo 0,9%</td></tr><tr><td>Sutura chirurgica sterile</td><td>DemeTech</td><td>DT-639-1</td><td>Seta, misura 6-0</td></tr><tr><td>Termometro</td><td>Soluzioni di calibrazione innovative (INNOCAL)</td><td>EW 20250-91</td><td></td></tr></tbody></table>

approccio sperimentale per esaminare la segnalazione di leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

Un ormone prodotto da adipociti leptina è un potente stimolante respiratorio, che può svolgere un ruolo importante nella difesa della funzione respiratoria nell'obesità. I corpi carotidi (CB), un organo chiave di sensibilità ipossica periferica, esprimono la lunga isoformazione funzionale del recettore leptina (LepRb), ma il ruolo della segnalazione della leptina nel controllo della respirazione non è stato completamente chiarito. Abbiamo esaminato la risposta di ventilazione ipossica (HVR) (1) nei topi C57BL/6J prima e dopo l'infusione di leptina al basale e dopo la denervazione CB; (2) in mouse LepRb-deficienti db/db obesi al basale e dopo la sovraespressione LepRb in CB. Nei topi C57BL/6J, la leptina ha aumentato l'HVR e gli effetti della leptina sull'HVR sono stati aboliti dalla denervazione della CB. Nei mouse db/db, l'espressione LepRb in CB ha aumentato l'HVR. Pertanto, concludiamo che la leptina agisce in CB per aumentare le risposte all'ipossia.

L'infusione continua di leptina ha aumentato significativamente l'HVR nei topi magri C57BL/6J da 0,23 a 0,31 mL/min/g/SFiO2 (P &lt; 0.001, Figura 2)11. Il CSND ha abolito l'aumento indotto dalla leptina dell'HVR (Figura 2), mentre non sono stati osservati effetti attenuanti della CSND sull'HVR in finto gruppo di chirurgia dopo l'infusione di leptina.
L'espressione LepRb nei topi LepR</...

Il nostro studio si concentra sugli effetti della segnalazione della leptina nel corpo carotide (CB) sulla risposta di ventilazione ipossica (HVR). Abbiamo effettuato esperimenti di "perdita di funzione" che misurano l'effetto della leptina sull'HVR dopo la denervazione della CB e gli esperimenti di "guadagno di funzione" che misurano l'HVR dopo la sovraespressione del recettore della leptina nel CB.

Approccio sperimentale per esaminare la segnalazione di Leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Il nostro protocollo può essere utilizzato per esaminare gli effetti respiratori della leptina sul corpo carotideo nel controllo della respirazione chemoreflex periferica e le risposte fisiologiche all'ipossia. Possiamo anche valutare gli effetti della perdita e del guadagno della funzione corporea carotide usando rispettivamente la denervazione chirurgica e chimica e la trasfezione da adenovirus. Prima di iniziare la procedura, misurare la temperatura all'interno di una camera di plastemagrofia di tutto il corpo su misura e misurare l'umidità relativa del laboratorio.Quindi, misurare il peso corporeo e la temperatura rettale del mouse sperimentale. Posizionare il mouse all'interno della camera e posizionare un collare ossimetro attorno al collo rasato dell'animale. E assicurati di sigillare completamente la camera per evitare perdite d'aria.Attendere circa 30 minuti fino a quando il mouse non è silenzioso e la camera è a volume costante. Prima di iniziare a registrare i segnali respiratori e la saturazione periferica dell'ossigeno alla normoxia. Dopo 20 minuti di normoxia, esporre l'animale a un flusso costante di gas misto del 10% di ossigeno e del 3% di anidride carbonica.E iniz

experimental-approach-to-examine-leptin-signaling-carotid-bodies-its

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Lo scopo è quello di presentare un nuovo metodo, respirazione-controllo stimolazione elettrica (BreEStim) per il trattamento del dolore neuropatico e spasticità.

Respirazione controllata stimolazione elettrica (BreEStim) per la gestione del dolore neuropatico e spasticità

La segnalazione vagale afferente trasmette informazioni importanti al sistema nervoso centrale dai recettori situati negli organi dell'addome e del torace. I gangli nodosari dei nervi vagi contengono molti tipi di recettori che modulano l'attività vagale. Questo protocollo descrive un metodo di iniezioni locali di sostanze neurochimiche nei gangli nodos.

Un metodo di nodose Ganglia iniezione in Sprague-Dawley Rat

L'unità respiratoria centrale si trova nel tronco encefalico. L'output motorio respiratorio spontaneo da un midollo encefalico isolato viene registrato posizionando un elettrodo sulla quarta radice ventrale. Questo approccio sperimentale è prezioso per indagini farmacologiche o per la valutazione di sfide respiratorie e manipolazioni genetiche sul comportamento motorio ritmico.

Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla rilevazione immunoistologica della proteina c-FOS, una tecnica classica utilizzata per l'identificazione di popolazioni neuronali coinvolte in specifiche risposte fisiologiche in vivo ed ex vivo.

La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Il metodo di trattamento del sangue RAPID può essere utilizzato negli esseri umani e produce livelli di peptide superiori e consente la valutazione della forma molecolare corretta. Pertanto, questo metodo sarà uno strumento prezioso nella ricerca del peptide.

Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano

Questo manoscritto descrive protocolli di video microscopia in vitro per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale del ratto. Il manoscritto descrive anche tecniche per la valutazione di densità del microvessel con aspersione di lectine e tessuto fluorescente contrassegnato utilizzando flussometria del Laser Doppler.

Valutazione dei meccanismi di controllo vascolare utilizzando Video microscopia del arterie di resistenza isolata dei ratti

L'incidenza dell'obesità è in aumento e aumenta il rischio di malattie polmonari croniche. Per stabilire i meccanismi sottostanti e le strategie preventive, animale ben definiti modelli sono necessari. Qui, mettiamo a disposizione tre metodi (prova di tolleranza di glucosio, pletismografia corporea e fissazione del polmone) per studiare l'effetto dell'obesità sui risultati polmonari nei topi.

Prova di tolleranza di glucosio intraperitoneale, misura della funzione polmonare e la fissazione del polmone per studiare l'impatto dell'obesità e metabolismo alterato sugli esiti polmonare

La pletismografia barometrica non vincolata viene utilizzata per quantificare il modello di respirazione nei topi svegli. Mostriamo che 15 segmenti s sotto un protocollo standardizzato visualizzano valori simili a una durata prolungata di respirazione silenziosa. Questa metodologia consente anche la quantificazione di apnea e respiri aumentati durante la prima ora nella camera.

Metodo per ottenere il modello di respirazione nei topi senescenti attraverso Pletimografia Barometrica Sfrenata

Il protocollo descrive l'uso della Miografia dei fili per valutare la tensione isometrica transmurale delle arterie mesenteriche isolate dai topi, con particolare attenzione alla modulazione da fattori rilasciati da cellule endoteliali e tessuti adiposi perivascolare.

Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare

Il baroriflesso è un meccanismo di regolazione della frequenza cardiaca da parte del sistema nervoso autonomo in risposta ai cambiamenti della pressione sanguigna. Descriviamo una tecnica chirurgica per impiantare trasmettitori di telemetria per la misurazione continua e simultanea dell'elettrocardiogramma e della pressione sanguigna nei topi. Questo può determinare la sensibilità baroriflessa spontanea, un importante marker prognostico per le malattie cardiovascolari.

Impianto combinato di ECG telemetrico e trasmettitori di pressione sanguigna per determinare la sensibilità baroriflessa spontanea in topi coscienti

Scopri come esaminare la segnalazione della leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione utilizzando modelli murini e tecniche di denervazione chirurgica.

Approccio sperimentale per esaminare la segnalazione di Leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione (Video) | JoVE Journal

Approccio sperimentale per esaminare la segnalazione di Leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione

Esplora altri video