Sistema a matrice 3D derivato da fibroblasti applicabile al saggio di formazione di tubi endoteliali
26 dicembre 2019
Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).
Questo protocollo consente di vedere diversi tipi di culture e osservare le loro interazioni con la matrice extracellulare. Il vantaggio principale di questo metodo è che la matrice che si ottiene viene rigenerata da fibroblasti e sarà abbastanza simile a quelle generate in vivo. Crediamo che questa malattia sia irrilevante quando si utilizza il fibroblasto ottenuto dai piatti da forno.
Stabilire una matrice da queste cellule potrebbe illuminarci come può avere effetto, ad esempio, sulla situazione persistente. Questi metodi possono anche essere applicati, ad esempio, agli studi fisici ai sopravvissuti delle proprietà della matrice. Visualizzazione di questo protocollo è importante osservare una tecnica di pipettazione dei passaggi che è necessario reggente.
Quando si provano questi metodi per la prima volta, probabilmente ci vorra' più tempo del previsto. Il nostro consiglio è di prepararti il più possibile in anticipo e utilizzare periodi di durata per prepararti per i prossimi passi. Inizia preparando lo 0,2% di gelatina, l'1% di glutaraldeide e una soluzione di etanolammina molare secondo le indicazioni del manoscritto.
Assicurarsi di eseguire ogni soluzione tramite un filtro da 0,22 micrometri prima dell'uso. Quindi, preparare l'acido ascorbico e il tampone dilisi. Diluire lo streptocoppo PBS come descritto nel manoscritto e preparare DMEM con il 10%FBS.
Preparare il 2%BSA denaturato termicamente aggiungendo 2 grammi di BSA a 100 millilitri di acqua sterile e riscaldarlo in un bagno d'acqua bollente per sette minuti. Quindi, integrare FBS con penicillina, streptomicina, gentamicina e anfotericina B.I telomeri ricombinanti della cultura hanno trasfettato fibroblasti di fronte all'uomo immortalati e DMEM con 10%FBS e li hanno mantenuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per stabilire la coltura primaria di fibroblasti, tagliare i campioni di tessuto in piccoli pezzi di circa due o tre millilitri a cubetti e seminarli in FPS con un'alta concentrazione di antibiotici.
Quando compaiono i primi fibroblasti, sostituire il mezzo con il mezzo FBM per la manutenzione cellulare. Aggiungere due millilitri di soluzione di gelatina allo 0,2% a ciascun pozzo di un piatto di sei potte e incubarlo per un'ora per 37 gradi Celsius o durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare la gelatina e lavarlo bene con due millilitri di PBS.
Aggiungere due millilitri dell'1% di glutaraldeide ad ogni pozzo e incubare la piastra a temperatura ambiente per trenta minuti che collegherà la gelatina. Aspirare la glutaraldeide e lavare i pozzi in due millilitri di PBS per cinque minuti. Per bloccare la glutaraldeide rimanente, aggiungere due millilitri di un'etanolammina molare e incubare la piastra a temperatura ambiente per trenta minuti.
Aspirare l'etanolammina e ripetere i lavaggi con PBS. Aggiungere un millilitro di DMEM con 10%FPS. Se il mezzo diventa immediatamente rosa, rimuoverlo, lavare i pozzetti una volta con due millilitri di PBS e aggiungere un altro millilitro di DMEM.
Seminare un millilitro di sospensione da fibroblasti con 5 x 10 alla quinta colonna in ogni pozzo e colturare le cellule fino a raggiungere il 100% di confluenza. Quindi rimuovere il mezzo e sostituirlo con DMEM con 10%FBS e 50 microgrammi per millilitro acido ascorbico. Sostituire il supporto ogni due giorni per sei giorni.
Due giorni dopo l'ultimo trattamento con acido ascorbico rimuovere il mezzo e lavare i pozzi con due millilitri di PBS. Dopo i lavaggi, aggiungere lentamente un millilitro di tampone di lisi preriscaldata e incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque o dieci minuti fino a quando i fibroblasti non vengono lisciviati. Senza rimuovere il tampone di lisi, aggiungere con cura due millilitri di PBS ad ogni pozzo e quindi aspirare circa 2,5 millilitri.
Ripetere questo processo due volte per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, aggiungere due millilitri di PBS con pen-strep. Sigillare il piatto con pellicola e tenerlo a quattro gradi Celsius per un massimo di tre mesi.
Far crescere le celle HUVEC e L'EMB-2 con 2%FBS fino alla massima confluenza. Quindi sostituire il mezzo con EBM-2 senza FBS per otto ore. Per preparare le matrici per la semina cellulare, rimuoverle dal frigorifero e lasciarle a temperatura ambiente per un'ora.
Bloccare le matrici sommando due millilitri di BSA denaturato termicamente e incubandoli a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, aspirare il BSA e lavarli con due millilitri di PBS. Seme 2 x 10 alla quinta cellule HUVEC in ogni pozzo della piastra rivestita con matrici derivate da fibroblasti.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 16 ore, quindi esaminare le strutture simili a tubi sotto un microscopio a campo luminoso standard con ingrandimento 20-40x. Questo protocollo è stato utilizzato per esaminare gli effetti del trattamento PDGF sulla formazione di matrici derivate da fibroblasti. I tre fibroblasti BGH che sono stati incubati con PDGF hanno mostrato una distribuzione cellulare più allineata nelle matrici rispetto a quelli incubati senza PDGF.
L'espressione del collagene 1 e della proteina fibronectina è stata aumentata in matrici derivate da fibroblasti stimolati dal PDGF e di conseguenza lo spessore della matrice è stato aumentato. Inoltre, gli istogrammi direzionali dimostrano che collagene 1 e fibronecina mostrano modelli paralleli. Quando le cellule HUVEC sono state sezionate su matrici decellularizzate derivate da fibroblasti stimolati dal PDGF hanno sviluppato strutture più capillari che in nessuna condizione stimolata.
Confermando che le matrici derivate da fibroblasti stimolati PDGF-BB promuovono l'attivazione delle cellule endoteliali. Quando si esegue questa procedura, è importante preparare le soluzioni in anticipo e assicurarsi che le celle siano pronte prima di iniziare. Oltre alle cellule endoteliali, le matrici possono anche essere sezionate con cellule epiteliali e può essere osservata la reazione a fattori esterni come la condizione nei media o i farmaci citotossici.
La generazione di matrice extracellulare è fondamentale nella progettazione di esperimenti macroambientali tumorali.
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Panoramica
Questo protocollo consente l'osservazione di diverse colture cellulari e delle loro interazioni con le matrici extracellulari. Le matrici derivate dai fibroblasti sono simili a quelle presenti in vivo, fornendo uno scaffold rilevante per saggi cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Cultura cellulare
- Ricerca sulla matrice extracellulare
- Biologia dei fibroblasti
Sfondo
- I fibroblasti sono cellule chiave nella generazione delle matrici extracellulari.
- Comprendere le interazioni tra cellule e matrice è fondamentale per diversi studi biologici.
- Le matrici rigenerate possono fornire informazioni sulle condizioni fisiologiche e patologiche.
- Questo metodo consente la visualizzazione delle tecniche di pipettaggio essenziali per il protocollo.
Scopo dello studio
- Creare uno scaffold naturale per saggi cellulari utilizzando matrici derivate da fibroblasti.
- Indagare gli effetti di queste matrici su diversi tipi cellulari.
- Migliorare la comprensione delle condizioni persistenti attraverso lo studio delle matrici.
Metodi Utilizzati
- I fibroblasti vengono seminati in piastre di coltura pretrattate.
- L'acido ascorbico viene utilizzato per stimolare la generazione della matrice.
- La descellularizzazione delle matrici viene eseguita per prepararle alla coltura cellulare.
- Cellule pertinenti, come le cellule endoteliali, vengono coltivate sulle matrici.
Risultati principali
- Le matrici generate sono simili a quelle presenti in vivo.
- Le interazioni cellulari con le matrici possono essere osservate efficacemente.
- Il metodo fornisce un approccio affidabile per lo studio del comportamento cellulare in un ambiente rilevante.
- Le tecniche di visualizzazione migliorano la comprensione dell'esecuzione del protocollo.
Conclusioni
- Le matrici derivate dai fibroblasti fungono da scaffold efficaci per saggi cellulari.
- Questo metodo può essere applicato a diversi studi biologici, inclusi studi fisici delle proprietà della matrice.
- Comprendere le interazioni tra le cellule e la matrice extracellulare è fondamentale per far progredire la ricerca in biologia cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo fornisce un modello fisiologicamente rilevante di matrice extracellulare 3D derivata da fibroblasti, che consente una valutazione più predittiva dei fenotipi angiogenici e tumorigenici nella ricerca scoperta. Imitando la composizione e la struttura della matrice in vivo, supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione del rischio meccanicistico nei percorsi di sviluppo di farmaci focalizzati su oncologia e angiogenesi. Il sistema migliora la continuità traslazionale permettendo lo studio dei comportamenti cellulari mediati dalla matrice in condizioni controllate e riproducibili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi degli effetti del rimodellamento della matrice mediato dai fibroblasti sulla formazione di tubuli endoteliali come lettura funzionale del potenziale angiogenico.
- Valore operativo: Permette la verifica di ipotesi riguardo a fattori pro-angiogenici come il PDGF-BB sulla composizione della matrice e sulle risposte endoteliali a valle.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera matrici descelularizzate standardizzate con deposizione quantificabile di collagene e fibronectina per un'agevole semina di cellule endoteliali.
- Valore operativo: Permette la preparazione riproducibile di impalcature bioattive per l'analisi mediante imaging ad alto contenuto di strutture simili a tubuli in microscopia a campo chiaro.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella le alterazioni della matrice extracellulare indotte dai fibroblasti associati al cancro (CAF) che promuovono l'angiogenesi associata al tumore.
- Valore operativo: Consente la valutazione degli effetti farmacologici dipendenti dalla matrice sulla morfogenesi delle cellule endoteliali in un sistema rilevante per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio della matrice derivata dai fibroblasti si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio allo screening fenotipico, fornendo un ponte tra i composti attivi a livello molecolare e l'output angiogenico funzionale prima dell'impegno preclinico.
- Biologia della scoperta: Verifica come gli stati di attivazione dei fibroblasti modulino l'architettura della matrice influenzando il comportamento delle cellule endoteliali.
- Screening: Fornisce letture quantitative basate sull'immagine della formazione di tubuli per confrontare le condizioni della matrice tra gruppi sperimentali.
- Analisi: Permette l'analisi istogramma della direzionalità allineamento di collagene e fibronectina per valutare i fenotipi di rimodellamento della matrice.
- Ricerca traslazionale: Collega le proprietà della matrice derivata dai fibroblasti a vie di segnalazione angiogeniche rilevanti per la modellizzazione del microambiente tumorale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare composti pro- o anti-angiogenici in un saggio contestualizzato fisiologicamente.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione di bersagli angiogenici utilizzando una matrice che riproduce da vicino la composizione e la struttura della matrice extracellulare in vivo.
- Valore operativo: Fornisce un metodo standardizzato e scalabile per generare matrici tridimensionali bioattive, applicabile a diversi tipi cellulari e condizioni sperimentali.
- Valore strategico: Riduce i falsi positivi biologici nei test di angiogenesi introducendo fin dalle prime fasi della scoperta gli effetti della matrice mediati dallo stroma.
- Impatto sul portafoglio: Guida la priorizzazione dei modulatori angiogenici in base al rischio, considerando i loro effetti sulle matrici rimodellate dai fibroblasti e sulle risposte endoteliali successive.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di fibroblasti primari, nella biochimica della matrice extracellulare e nelle tecniche di decellularizzazione.
- Si basa sulla stimolazione controllata con acido ascorbico, sul reticolaggio con glutaraldeide e sulla bloccatura con etanolammina per la stabilizzazione della matrice.
- Necessita di un bloccaggio standardizzato con BSA denaturata termicamente e di protocolli di semina cellulare costanti per saggi riproducibili di formazione di tubuli endoteliali.
- Comporta l'ottimizzazione della densità cellulare e dei tempi di incubazione per HUVEC o altri tipi di cellule endoteliali al fine di ottenere fenotipi angiogenici quantificabili.
- È limitato dal processo intensivo in termini di tempo di generazione della matrice (più di 6 giorni di trattamento con acido ascorbico) e dalla necessità di reagenti sterili e filtrati per prevenire contaminazioni.
