Name: Immaginare la sinapsi immunologica umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Impara a generare e visualizzare sinapsi immunologiche umane tra cellule Raji e linfociti T-helper Jurkat. Questo protocollo di microscopia a fluorescenza consente di osservare il traffico polarizzato e la secrezione cellulare in tempo reale.

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Riconosciamo tutti i membri passati e presenti del laboratorio per il loro generoso contributo. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del ministro spagnolo Econom-a competitividad (MINECO), del Piano Nacional de Investigaciàn Cient-fica (SAF2016-77561-R a M.I., che è stato in parte concesso con il finanziamento FEDER-EC). Riconosciamo Facultad de Medicina (UAM) e Departamento de Audiovisuales della Facultad de Medicina per il loro sostegno e le strutture fornite per produrre il video. Riconosciamo NIKON-Europe per il continuo e superbo supporto tecnico e teorico. L'accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Nikon.

1. Preparazione delle diapositive per aderire alle cellule Raji
<ol><li>Aggiungere 150 l di fibronectina (100 g/mL) per pozzo a uno scivolo a 8 camere a microwell (scivolo a camera inferiore di plastica) e incubarlo per 30 min a 1 h a 37 . Questo substrato di adesione permetterà il legame delle cellule Raji al pozzo inferiore (Fase 2), la formazione di coniugati viventi con cellule Jurkat (Fase 4) cellule, e la cattura di microscopia time-lapse (passaggio 6), ed è anche compatibile in seguito con la fissazione opzionale di paraformaldeide (PFA) (passaggio 7). NOT:</</c0> Per la fissazione dell'acetone, utilizzare vetrini da camera inferiore in vetro e poli-L-lysina (20 g/mL) invece della fibronectina, poiché l'acetone scioglie la plastica. Lo scivolo a 8 camere microwell (1 cm2 pozzetto, 300 litri di volume massimo) o equivalente è un formato flessibile e appropriato.</li>
	<li>Fibronectin aspirare utilizzando una pipetta automatica da 200 gradi e lavare ogni pozzo con 200 luna di PBS per 2 min con agitazione delicata. Ripetere questo lavaggio ancora una volta. Il vetrino a camera può essere conservato in questa fase con PBS per 1-2 settimane a 4 gradi centigradi.</li>
</ol>2. Adesione delle cellule Raji alle diapositive della camera e 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) Etichettatura
<ol><li>Trasferire 10 mL di pre-coltura confluente (1-2 x 106 cellule/mL) di cellule Raji in un tubo v-bottom da 15 mL. Mescolare bene e utilizzare 10 L per contare le cellule sulla camera Neubauer o equivalente.</li>
	<li>Centrifugare le cellule rimanenti a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare e scartare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere delicatamente il pellet cellulare nel mezzo caldo di coltura completa (RPMI 1640 integrato con 10% FCS, 2 mM glutammina, 10 mHe, 100 U/mL penicillina, e 100g streptomicina) ad una concentrazione di 106 cellule/mL. Utilizzare l'equazione riportata di seguito: ([ ]iniziale x V iniziale : [ ]finale x Vfinale), dove [ ]iniziale rappresenta la concentrazione iniziale della cellula, Viniziale - volume iniziale della sospensione cellulare, [ ]finale - concentrazione finale della cella, Vfinale , volume finale della sospensione cellulare. NOT:</</c9> A seconda della concentrazione cellulare della coltura iniziale, è possibile raccogliere più cellule del necessario, ma è importante mantenere le cellule rimanenti nella coltura (37 ) fino alla fine dell'esperimento al fine di prevenire potenziali problemi (vedi Passo 2.6).</li>
	<li>Etichettare le cellule Raji per consentire la loro identificazione durante la formazione di coniugato sinaptico. In questo esperimento, l'etichettatura 7-amino-4-cloromethylcoumarin (CMAC) viene eseguita nel passaggio 2.4.2.<ol>
<li>Trasferire il numero richiesto di cellule Raji nel mezzo di coltura in un tubo da 2 mL. Per lo scivolo a 8 camere microwell, è necessario un totale di 1,6 mL della sospensione cellulare (200 -L per pozzo).</li>
		<li>Aggiungere CMAC a una concentrazione finale di 10 M. Mantenere le cellule al buio coprendo il tubo con un foglio di alluminio poiché CMAC è sensibile alla luce. Sono necessari 200 luna contenenti 2 x 105 celle Raji per 1 cm2 bene. Quindi, se è necessario preparare 8 pozzi, sono necessarie 1,6 x 106 cellule Raji. NOT:</</c4> L'etichettatura delle cellule Raji con il tracker delle cellule blu (CMAC, eccitazione UV ed emissione blu) le distingue dalle cellule Th quando si formano le conjugate sinaptiche. Questo tintura è compatibile con i fissativi PFA e acetone e consente ulteriori procedure di immunofluorescenza. Cercate di evitare l'esposizione della luce. L'etichettatura delle cellule di Raji in una piscina con CMAC seguita da sospensione prima dell'adesione delle cellule Raji ai vetrini della camera rivestita di fibronectin assicura l'etichettatura omogenea delle cellule Raji con CMAC tra diversi pozzi.</li>
	</ol></li>
	<li>Risospendere le cellule macchiate CMAC e, dopo l'aspirazione del PBS nella diapositiva camera dal punto 1.2., trasferire 200 - L della sospensione cellulare in ogni pozzetto dei vetrini della camera rivestiti di fibronectina preparati al passo 1.1-1.2. Incubare lo scivolo della camera a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 per 30 min-1 h. NOT:</</c1> L'adesione e l'etichettatura CMAC si verificheranno contemporaneamente in questo passaggio e ciò consente di risparmiare tempo. Si prega di essere consapevoli del fatto che le cellule Raji si sedimentano rapidamente e deve essere presa cautela per mantenere una concentrazione omogenea nella sospensione cellulare prima della semina. Non è necessario lavare CMAC in questa fase dalla centrifugazione, poiché il lavaggio CMAC sarà più facilmente fatto al passo 2.7 (quando le cellule Raji etichettate sono già aderenti ai vetrini della camera). Poiché CMAC è presente nella sospensione cellulare in grande eccesso, lo sfondo blu della fluorescenza è troppo alto per distinguere le cellule di colore blu. Controllare la fluorescenza cMAC cellulare al punto 2.7 dopo il lavaggio CMAC.</li>
	<li>Assicurarsi che le cellule Raji siano aderenti al fondo dei pozze agitando delicatamente i vetrini della camera al microscopio. Assicurarsi che le celle visualizzino gli spazi vuoti tra di loro e non siano connessi (Figura 1, pannello centrale). Il 50-60% della confluenza cellulare è appropriato.<ol>
<li>Se la maggior parte delle cellule aderiscono in modo efficiente al vetrino camera e non si osservano spazi cellulari, lavare ogni pozzo con un mezzo caldo completo e risospendere il mezzo con un pipet automatico da 200 once per staccare l'eccesso di cellule. Controllare la confluenza dopo ogni passaggio di sospensione.</li>
		<li>Se le cellule non aderiscono, ripetere il passo di adesione e aumentare il tempo di adesione e / o numero di cella. NOT:</</c2> È possibile fermarsi qui, incubare lo scivolo della camera a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 durante la notte (O/N) e continuare con il protocollo il giorno successivo. Si prega di confermare il giorno successivo che le cellule Raji rimangono aderenti e CMAC-etichettato utilizzando microscopia a fluorescenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavare ogni pozzo con attenzione con CALDO integrato RPMI per eliminare l'eccesso di CMAC e controllare l'emissione blu con il microscopio a fluorescenza (Figura 1). NOT:</</c1> Per evitare l'uso di obiettivi di olio da immersione (appiccicoso e viscoso) e di olio ad alta apertura numerica, obiettivi extra-lunga distanza (cioè 20x o 40x) possono essere utilizzati per controllare rapidamente l'etichettatura CMAC utilizzando il microscopio a fluorescenza.</li>
</ol>3. Impulso di CMAC - Etichettato cellule Raji con Staphylococcal Enterotoxin E
<ol><li>Aggiungere in ogni pozzo lo Staphylococcal Enterotoxin E (SEE, 1 g/mL). Il SEE può essere convenientemente diluito nel mezzo di coltura cellulare (soluzione di lavoro a 100 g/mL) dalle scorte congelate SEE (1 mg/mL in PBS). Utilizzare 2 l della soluzione di lavoro 100x per ogni micropolore da 200. ATTENZIONE: Utilizzare i guanti per questo passaggio e smaltire la punta usata nella scatola del rischio biologico.</li>
	<li>Incubare lo scivolo della camera a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 per almeno 30 min. L'effetto SEE dura almeno 3-4 h. NOT:</</c2> See può essere aggiunto ai pozzi in diversi momenti in cui richiesto, se sono state pianificate configurazioni time-lapse distinte (passaggio 5) e/o a seconda del punto di inizio per gli esperimenti del punto finale (passaggio 6).</li>
</ol>4. Preparazione delle cellule Jurkat
<ol><li>Utilizzare una coltura precedentemente crescente di cellule Jurkat (1-2 x 106 cellule / mL) per questo esperimento. Utilizzare celle di un pallone di coltura standard o di una trasfezione precedente seguendo i protocolli di elettroporazione standard, come descritto in precedenza23. La trasfezione delle cellule Jurkat consentirà la visualizzazione del time lapse del traffico di granuli secretori nelle cellule viventi. Ad esempio, quando si esprime GFP-CD63 (un marcatore di MVB), è possibile registrare il movimento delle vesciche decorate con GFP-CD63 (Video 1).</li>
	<li>Osservare le cellule al microscopio a contrasto di fase. Se un eccesso di cellule morte (>20-30%) sono osservati, eseguire la centrifugazione gradiente densità Ficoll utilizzando protocolli standard24, per eliminare l'eccesso di cellule morte (cellule morte presentano una densità maggiore rispetto alle cellule viventi) prima dell'uso (vedi Discussione).</li>
	<li>Trasferire le celle su un tubo da 15 mL, tubo V-bottom, e utilizzare 10 per contare utilizzando l'emocitometro.</li>
	<li>Centrifugare le cellule rimanenti come descritto nel passaggio 2.2. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule alla stessa concentrazione delle cellule di Raji (1 x 106/mL) utilizzando un mezzo di coltura fresco e caldo. Seguire i passaggi 2.2-2.3.</li>
	<li>Mantenere le celle Jurkat in coltura (37 gradi centigradi, 5% CO2)in attesa del passaggio 4. NOT:</</c6> Nella seconda opzione (trasfezione), il numero di cellule viventi sarà molto inferiore a quello della prima. Così, considerare l'utilizzo di un volume di coltura cellulare iniziale superiore al fine di avere abbastanza cellule per l'esperimento. Da 10 x 106 cellule Jurkat per cuvette di elettroporazione e trasfezione, solo 2-4 x 106 cellule Jurkat sopravviveranno dopo 48 h di trasfezione e alcune di queste cellule andranno perse durante la fase di Ficoll. Pertanto, una cuvette di elettroporazione è generalmente sufficiente per sfidare le cellule Raji aderitate da 8 micro pozzi (1,6 x 106 cellule Jurkat trasfette necessarie).</li>
</ol>5. Co-seeding di Raji e Jurkat Cells
<ol><li>Prendere i vetrini da camera contenenti le cellule Raji con etichettatura CMAC, SEE e aderenti, fuori dall'incubatrice dal punto 3.2. Non è necessario lavare il CMAC in questa fase poiché questo è stato precedentemente fatto nel passo 2.7.</li>
	<li>Aspirare con attenzione il mezzo di coltura di ogni pozzo, uno per uno, da un angolo del pozzo utilizzando una pipetta automatica da 200 L. Non lasciare che il mezzo nel pozzo si asciughi completamente.</li>
	<li>Sostituire immediatamente il mezzo con 200 celle Jurkat risospese nel mezzo di coltura cellulare (1 x 106/mL) preparate nel passaggio 4.5. Se viene eseguita l'imaging time lapse, andare al passaggio 6 immediatamente dopo questo passaggio, poiché le cellule Jurkat tendono a sedimentare e formare coniugati sinaptici molto rapidamente. Per comodità, i micropozzi contenenti cellule Raji aderenti a SEE che non ricevono la semina con cellule Jurkat in questa fase devono essere mantenuti con il mezzo di coltura cellulare fino alla successiva sfida con le cellule Jurkat. Ciò consentirà in modo flessibile una sfida successiva con le celle Jurkat per ulteriori approcci sperimentali cinetici o cediti finali.</li>
	<li>Se si desidera eseguire un intervallo di tempo, procedere rapidamente al passaggio 6. Ciò comporta la co-cultura per 1-2 h sull'incubatore dello stadio del microscopio o equivalente a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per consentire la formazione di coniugato sinaptico e l'acquisizione simultanea dell'immagine. Se l'analisi dell'estremità, ma nessun lasso di tempo, è prevista la formazione coniugata dopo il periodo di co-coltura utilizzando il microscopio (come nella Figura 1) prima di fissare le cellule (passaggio 7).</li>
</ol>6. Immagine time lapse di coniugati sinaptici emergenti
<ol><li>Preparare il microscopio e la camera di incubazione prima dell'imaging. Per l'esempio illustrato nel Video 1, le impostazioni di microscopia dettagliate sono illustrate nella Figura 2. NOT:</</c1> Se è previsto un esperimento time lapse, tutte le impostazioni del microscopio e i complementi (camera di coltura delle cellule ambientali, ecc.) devono essere preparati prima di aggiungere la sospensione Jurkat al vetrino della camera con cellule Raji aderitate. I seguenti passaggi sono descritti per un microscopio commerciale (Tabella dei materiali). Tuttavia, può essere utilizzato qualsiasi microscopio a fluorescenza invertita dotato di un incubatore di coltura cellulare.<ol>
<li>Utilizzare un microscopio con un'immersione ad olio 60x, un'apertura numerica elevata quando si analizza il traffico polarizzato.</li>
		<li>Assicurarsi che il sistema di messa a fuoco automatica sia acceso e regolare l'offset per mettere a fuoco le celle Raji legate alla superficie inferiore. Si prega di fare riferimento a Figura 1, Video 1 e Video 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'aggiunta di Jurkat ad ogni pozzo contenente le cellule Raji aderenti al passaggio 5.3, individuare rapidamente la diapositiva della camera di microwell sull'incubatore dello stadio del microscopio preriscaldato (1-2 h) e selezionare alcune posizioni XY con il microscopio, campi in cui è probabilmente registrerà una formazione IS emergente fatta, per esempio, da una cellula trascurata Jurkat che cade nel mirino.</li>
	<li>Utilizzare un'incubatrice preriscaldata dello stadio del microscopio poiché è stato osservato che uno stadio stabilizzato a temperatura mantiene posizioni stabili X,Y, z. I criteri per un comodo campo XY sono: cellule Raji ben focalizzate e non confluenti (cioè, che mostrano lacune tra le celle) e la presenza di cellule Jurkat transfected (questo può essere controllato combinando la trasmissione e canali UV o GFP). Le cellule Jurkat si sedimentano molto rapidamente (pochi minuti) sullo scivolo della camera, e le possibilità di immaginare le sinapsi emergenti diminuiranno con il tempo (Figura 1). È possibile terminare l'esperimento dopo il lasso di tempo definito o procedere al passaggio 7 e fissare i coniugati per la successiva immunofluorescenza e analisi. NOT:</</c8> È possibile selezionare fino a 16 diversi campi del microscopio da un massimo di 4 micropozzi diversi per l'acquisizione simultanea, multi-pozzo time-lapse con la corretta risoluzione temporale (1-2 min per fotogramma). La limitazione si basa sia sul numero che sull'intensità (esposizione della fotocamera) dei diversi fluorocroche da immaginare (a seconda del numero di proteine fluorescenti espresse, a parte il CMAC). Un modo per aumentare la frequenza fotogrammi è la registrazione per il canale CMAC in un solo intervallo di tempo "n" per GFP (ad esempio, n - 8, come mostrato nella Figura 2), poiché le celle Raji sono aderenti al fondo del pozzo e non si muovono facilmente come celle Jurkat. Inoltre, questo avvantaggia la vitalità cellulare, poiché l'esposizione frequente alla luce UV può danneggiare le cellule. Provare a regolare la frequenza temporale in un fotogramma ogni 1 minuto al massimo (ad esempio, 20 s per fotogramma nel Video 1, Figura 2) poiché la polarizzazione di MVB richiede alcuni minuti a ore per essere completata. Per eseguire questa cattura multicanale è necessario un microscopio dotato di torretta a epi-fluorescenza motorizzata e di opportuni filtri di fluorescenza a bande.</li>
</ol>7. Formazione del punto finale di coniugati sinaptici e fissazione
<ol><li>Se è previsto solo un esperimento endpoint (1-2 ore di incubazione per consentire la formazione di coniugato sinaptico è appropriata), incubare lo scivolo della camera a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 1-2 h. Controllare la formazione coniugata dopo il periodo di coltura (come nella Figura 1)e, successivamente, fissare i coniugati con aceteno o PFA (la fissazione dipenderà dagli antiflugeni e dagli anticorpi). In questo caso l'incubazione non richiede un'incubatrice a fase di microscopio. Per un esempio, fare riferimento al Video 3.</li>
	<li>Per fissare le cellule, lavare il pozzo agitando delicatamente con caldo RPMI (37 gradi centigradi) medio senza FCS (albumin dal siero può precipitare con fissazione acetone). Aspirare e aggiungere 200 l of PFA o acetone pre-freddo ad ogni pozzo. Incubare lo scivolo da camera a temperatura ambiente (RT) o sul ghiaccio, rispettivamente, per 20 min. NOT:</</c3> Per la fissazione dell'acetone, pre-raffreddare l'acetone a -20 gradi centigradi e pre-raffreddare lo scivolo della camera a 4 gradi centigradi. Rimuovere i coperchi di plastica quando l'acetone viene utilizzato per fissare le cellule coltivate negli 8 vetrini della camera con fondo di vetro.</li>
	<li>Lavare ogni due volte con PBS e aggiungere 200 l-l di soluzione di spegnimento (PBS, 50 mM NH4Cl). Incubare lo scivolo della camera a 4 gradi centigradi. NOT:</</c5> In questa fase lo scivolo da camera può rimanere per almeno un mese a 4 gradi centigradi prima di eseguire il protocollo di immunofluorescenza, come descritto8. Il coperchio previene l'evaporazione.</li>
</ol>8. Elaborazione delle immagini
<ol><li>Eseguire la deconvoluzione dell'immagine post-acquisizione (cioè la deconvoluzione di Huygens o equivalente, Tabella dei materiali) di serie time-lapse e/o foto di celle fisse. Deconvolue impiegando un software appropriato (cioè utilizzando l'opzione ottica "wide field" in Huygens) e i parametri ottici corretti. La deconvoluzione richiede l'elaborazione dell'immagine della funzione di diffusione del punto misurato (PSF) del microscopio4.</li>
	<li>In alternativa, utilizzare il software per calcolare il PSF idealizzato caricando automaticamente i parametri ottici inclusi tra i metadati dei file del microscopio. Questi parametri ottici comprendono lunghezza d'onda fluorocro, indice di rifrazione, apertura numerica dell'obiettivo e la tecnica di imaging (confocale, ampio campo, ecc.) 4.</li>
	<li>Successivamente, il software di imaging utilizza il PSF e diversi algoritmi di deconvoluzione (cioè QMLE e CMLE nel software Huygens) in un processo di calcolo graduale, i cui risultati possono essere continuamente visualizzati e interrotti (o ripresi) quando richiesto dall'utente. In questa fase l'utente può modificare il numero di convoluzioni e/o il rapporto segnale-rumore e riprendere la deconvoluzione. Il software di deconvoluzione funziona bene con le serie time lapse (X,Y,T) (Video 2) e gli stack z (X, Y, z) (Video 3). I canali deconvoluted sono stati successivamente fusi al CMAC, canale grezzo, poiché citosolico, fluorocro diffuso non migliorano con la deconvoluzione4,9.</li>
</ol>

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Una limitazione di questo protocollo è che non tutte le sinapsi saranno idealmente orientate perpendicolarmente all'asse ottico. Utilizzando questa tecnica, non c'è modo di prevedere e/o influenzare l'orientamento ideale per l'imaging a sinapsi immunitaria. Per risolvere questo problema, escludiamo dalle analisi successive tutte le sinapsi catturate casualmente che alla fine non soddisfano i criteri ideali. Queste sinapsi, opportunamente, non sono molto frequenti. Tuttavia, è possibile aggirare questa limitazione utilizzando diversi approcci sperimentali4.
Il rilascio polarizzato CD63 (degranulazione) può essere quantificato da altre tecniche complementari come la colorazione della superficie cellulare di CD63 (rilocalizzazione del CD63 alla superficie cellulare) nelle cellule viventi (non fisse e non permeabilizzate), dopo il passaggio 6, e il successivo lavaggio e fissazione, come mostrato in precedenza8. Inoltre, è possibile eseguire il rilascio di CD63 sugli esosomi8,9 e la quantificazione degli esosomi mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle9,25. Questi approcci sono certamente compatibili con il nostro protocollo, a condizione che la fissazione venga eseguita dopo l'immunofluorescenza della superficie cellulare delle cellule viventi.
Abbiamo trovato il numero ideale di cellule (per un pozzo di 1 cm2 nella diapositiva a camera a 8 benazzo) è 4 x 105 cellule (2 x 105 cellule Raji e 2 x 105 cellule Jurkat) dal momento che aderiscono in modo efficiente al fondo del pozzo. Legare l'efficienza alla plastica (utilizzando la fibronectina), o il fondo di vetro (utilizzando la poli-L-lisina) microdiapositive non è di solito un problema. Numeri di cellule più elevate possono non produrre spazi tra le cellule aderenti e, successivamente, coniugati sinaptici complessi (Figura 1); entrambe le situazioni non sono desiderabili quando i coniugati da cellula a cellula devono essere immagini, ad esempio, in MTOC o negli esperimenti di polarizzazione del granulo secretoria. Un minor numero di cellule può diminuire le probabilità di trovare coniugati, soprattutto quando le cellule Jurkat transfected sono sfidate con APC per generare sinapsi. Si prega di notare che abbiamo osservato che un incubatore di stadi stabilizzato a temperatura in atto sullo stadio X/Y del microscopio prima dell'inizio del protocollo (cioè 1-2 h in anticipo per stabilizzare la configurazione dello stadio /microscopio) mantiene stabili parametri X,Y, , che è fondamentale per una corretta imaging. Il sistema di messa a fuoco automatica alla fine compenserà le piccole variazioni.
Quando alcune tecniche di trasduzione genica come l'elettroporazione vengono utilizzate per esprimere proteine chimeriche fluorescenti (ad esempio, GFP-CD63) nei cloni Di Jurkat (Video 1), una frazione considerevole di cellule può morire dopo l'elettroporazione. Questo può essere un problema poiché anche se le cellule morte non formano sinapsi, quando sono in eccesso rispetto alle cellule viventi e trasfetate, possono interferire con la formazione di coniugati fatti dalle cellule Th viventi. Abbiamo scoperto che un'attenta eliminazione delle cellule morte dalle colture trasfetate utilizzando un mezzo di sfumatura di densità seguendo i protocolli standard prima che la fase di formazione coniugata possa effettivamente aumentare le possibilità di coniugare correttamente l'immagine. Inoltre, bassa efficienza trasfusionale (<20%) può essere un avvertimento importante poiché questo, combinato con una moderata efficienza di formazione coniugata (circa 60%)25, diminuirà la probabilità di trovare coniugati realizzati da cellule trasfette. Questo non è un problema quando le cellule non trasfette vengono utilizzate per ottenere coniugati negli esperimenti dell'estremità e nella successiva fissazione. Gli 8 vetrini a camera microwell sono compatibili con i protocolli di immunofluorescenza convenzionali. Ciò aumenta la flessibilità del protocollo di cui sopra con scopi diversi. La fissazione con acetone può essere un problema da considerare quando si utilizzano vetrini da camera con pozze in plastica inferiore. Tuttavia, ci sono disponibili in commercio 8 vetrini da camera al microscopio con tengono fondi in vetro, che sono compatibili con la fissazione dell'acetone. Rimuovere i coperchi di plastica quando l'acetone viene utilizzato per fissare le cellule coltivate in 8 vetrini della camera con fondo di vetro microwell.
Si raccomanda che il microscopio sia dotato di uno stadio XY motorizzato, di una torretta a epi-fluorescenza motorizzata e di un sistema di messa a fuoco automatico (ad esempio, Perfect Focus System) o di integratori equivalenti. Quando è richiesta l'acquisizione multi-bene25, il sistema di messa a fuoco automatica garantirà una messa a fuoco stabile lungo tutto l'esperimento. L'esperienza precedente indica che stabilendo un offset di messa a fuoco appropriato sulle cellule Raji, sia il movimento delle cellule T (Video 1) che i movimenti dello stadio/camera del microscopio negli esperimenti multipunto XY, possono essere compensati. Questo è davvero conveniente per la cattura multi-lapse time-lapse.
È stata utilizzata una fotocamera CDD (dispositivo accoppiato carica in bianco e nero e raffreddata), ma è stata utilizzata una fotocamera di maggiore sensibilità scientifica, a fluorescenza scientifica complementare al semiconduttore di ossido di metallo (sCMOS), poiché questo ridurrà i tempi di esposizione della fotocamera e migliorerà la risoluzione temporale. I tempi di esposizione brevi della telecamera che abbiamo utilizzato (classificando forma da 100 ms a 500 ms) combinati con l'otturatore automatico a fluorescenza consentono una prolungata acquisizione time lapse (fino a 24 h) con una risoluzione di tempo adeguata (1 fotogramma al minuto o meno, per un massimo di 16 posizioni XY) senza sbiancamento a fluorescenza significativo e/o perdita di sopravvivenza cellulare. La fase motorizzata permette di catturare multipunto (XY) e aumenta la possibilità di trovare e immaginare le sinapsi emergenti e in via di sviluppo nell'orientamento ideale, ma permette anche l'acquisizione di immagini in diapositive multi-well camera quando diversi cloni Jurkat devono essere rincongito contemporaneamente25. Alta apertura numerica dell'obiettivo (cioè 60x, 1.4) è necessaria per ottenere i migliori risultati quando si analizza il traffico di granuli secretori.
Il RAJI-SEE-Jurkat costituisce un modello di sinapsi immunologica ben consolidato che è stato utilizzato da una miriade di ricercatori da quando è stato originariamente descritto11. Abbiamo adattato il nostro protocollo a questo modello per immaginare correttamente le prime fasi della formazione dell'IS. Il nostro obiettivo era quello di migliorare i primi approcci20 seguiti in precedenza per studiare la polarizzazione dell'MTOC e la macchina secretoria verso l'IS. È notevole che i coniugati realizzati con questo protocollo producano la riorganizzazione F-actin alla sinapsi, configurando un SMAC canonico, in concomiticamente al traffico polarizzato MVB25. Questi eventi cruciali sono stati analizzati e convalidati anche dalla microscopia confocale25.
Differenze cinetiche nel traffico polarizzato esistono tra i diversi tipi di IS. Ad esempio, il trasporto polarizzato di granuli littici da CTL avviene in pochi secondi o pochissimi minuti, mentre diverse vescicoli contenenti citochine dai linfociti Th durano da minuti fino a diverse ore per finire. Queste dissimilità temporali devono essere prese in considerazione in anticipo, al fine di progettare la migliore strategia e selezionare l'approccio sperimentale e di imaging più appropriato, poiché per alcuni stratagemmi di imaging (cioè, la microscopia confocale di scansione laser (LSCM) ), il tempo può essere un fattore limitante poiché il tempo di cattura è molto superiore alla risoluzione temporale appropriata (1 min o meno)4. Questa non è una limitazione quando viene utilizzata la microscopia a fluorescenza a campo largo (WFFM) come descritto nel protocollo precedente. Dal momento che nei CTL, la polarizzazione di MTOC verso la sinapsi dura solo pochi minuti3,6,17, diversi approcci specifici dello stato dell'arte microscopia diversa da quella descritta qui (ma che ospita una maggiore risoluzione spaziale e temporale) sono necessari al fine di immagine correttamente queste sinapsi26,27, principalmente quando diversi campi al microscopio (cattura multipunto) sono immagine. Questi nuovi approcci ad alta risoluzione possono essere utilizzati anche per l'imaging delle sinapsi fatte dai linfociti Th, anche se motivi economici e/o logistici (cioè, l'apparecchiatura di base necessaria per alcune di queste tecniche di imaging costa 6-7 volte di più di quello qui descritto) potrebbe certamente costituire una limitazione per questi metodi di imaging all'avanguardia4. Il fatto che i linfociti siano realizzati da Th e la circostanza che nei linfociti MTOC, le vesciche secretorie contenenti linfocite e MVB richiedono da diversi minuti fino a ore per trasportare e attraccare all'IS22,rende questo protocollo un approccio ideale e conveniente per l'imaging dell'IS Th-APC.
WFFM in combinazione con la deconvoluzione dell'immagine post-acquisizione costituisce un approccio interessante e non solo ragioni economiche sostengono questa strategia. La scarsa risoluzione intrinseca nell'asse z (l'avvertenza più importante della tecnica) può essere migliorata utilizzando la deconvoluzione dell'immagine post-acquisizione4 (confrontare il Video 1 con il Video 2). La deconvoluzione utilizza un approccio basato sul calcolo di elaborazione delle immagini in grado di migliorare il rapporto segnale/rumore e la risoluzione dell'immagine e il contrastoda 27 a 20 volte, fino a 150-100 nm nell'asse XY e 500 nm nell'asse4.
L'uso di maggiore sensibilità, alta velocità di lettura e ampia gamma dinamica, nuove telecamere sCMOS a fluorescenza migliorerà la qualità delle immagini e ridurrà lo sbiancamento a fluorescenza. La flessibilità offerta dal protocollo di coniugazione da cellula a cellula descritta qui consente la combinazione dell'approccio cellulare descritto con diverse tecniche di microscopia all'avanguardia, sia nelle cellule viventi che nelle cellule fisse, e il risultato atteso migliorerà infatti la nostra conoscenza della sinapsi immunologica.
Anche se abbiamo implementato e convalidato il protocollo utilizzando linee cellulari facili da gestire e ben stabilite, il potenziale dell'approccio può consentire la visualizzazione di interazioni più fisiologiche quando vengono utilizzate cellule T primarie e diversi tipi di cellule che presentano antigeni (come le cellule dendritiche dei macrofagi)5. In questo contesto, questo protocollo è stato anche esteso e convalidato utilizzando la linea cellulare EL-4 con pulsazione di topi superantigeno (SEB) utilizzata come APC, per sfidare i linfoblasti T del topo primario9. Infatti i linfociti T primari, in particolare CTL, rendevano i contatti sinaptici più longevi e dinamici (vedi Video supplementare 8 in riferimento9) a quelli visti con il modello SEE-Raji e Jurkat. La variabilità delle modalità di contatto sinaptiche può essere vista meglio per le interazioni delle cellule T primarie con cellule dendritiche o cellule B in equivalenti bidimensionali del tessuto in vitro che possono anche essere registrati e analizzati utilizzando questo protocollo. Inoltre, a parte i superantigeni, la tecnica può essere utilizzata per immaginare altri tipi di sinapsi. Ad esempio, potrebbe essere utilizzato in un modello di cellule T transgenico, specifico dell'antigene, ad esempio utilizzando il sistema murine OT1/OT2 specifico della ovalbumina o per trasfezione delle cellule T con recettori cellulari T specifici dell'antigene. Questo apre una miriade di possibilità sperimentali per l'immediato futuro.

L'obiettivo principale del metodo è quello di generare coniugati da cellula a cellula immunologica (IS) formati da una cellula che presenta l'antigene (APC) pulsata con superantigeni SEE e una cellula effector Th, e di registrare le immagini corrispondenti alle prime fasi della formazione di sinapsi immunologiche e ai successivi eventi di traffico (che si verificano sia nell'APC che nella cellula Th), che alla fine porteranno alla secrezione polarizzata. La creazione della IS da parte dei linfociti T al legame del loro recettore cellulare (TCR) agli antigeni legati a MHC-II sull'APC organizza un'istanza estremamente dinamica, malleabile e critica coinvolta nelle risposte immunitarie specifiche dell'antigene, umorali e cellulari1,2. L'IS è definito dalla formazione di uno speciale complesso di attivazione sopramolecolare (SMAC) modello caratterizzato da un processo di riorganizzazione dell'actina3. Dopo la costruzione dell'IS da parte dei linfociti A T con un APC, la polarizzazione delle vesciche secretoriche verso l'IS sembra essere implicata nella secrezione polarizzata al divario sinaptico. Questo meccanismo mirato sembra fornire inequivocabilmente al sistema immunitario uno stratagemma superbamente regolato per migliorare l'efficacia dei ruoli critici degli efficaci secretori dei linfociti T, riducendo al contempo la stimolazione non specifica e arbitrata di cellule al pinzanti, l'uccisione di cellule bersaglio irrilevanti e l'attivazione apoptotica del suicidio tramite la morte cellulare indotta da cellule (AICD)4.
La conseguenza dell'IS varia sulla natura sia del linfocito T che dell'APC. Il contatto sinaptico delle cellule Th (tipicamente cellule CD4) con l'APC che visualizza l'antigene associato a MHC-II produce l'attivazione della cellula T (secrezione di citochina, proliferazione, ecc.) e, in alcuni casi, l'apoptosi tramite AICD4. Per i linfociti Tocitotossici (CTL) (principalmente cellule CD8) che interagiscono con l'APC che presenta l'antigene associato a MHC-I, il risultato differisce sulla pre-stimolazione o meno dei CTL con antigene. Pertanto, i CTL ingenui che identificano i complessi antigene-MHC-I sull'APC sono "innescati" per distruggere le cellule bersaglio e dividersi. I CTL primitivi stabiliscono anche sinapsi con cellule bersaglio (cioè cellule infettate da virus o cellule tumorali) producendo lo sterminio cellulare specifico dell'antigene5,6.
La secrezione polarizzata degli esosomi alla sinapsi immunologica è un'area di ricerca in via di sviluppo e impegnativa coinvolta nelle risposte immunitarie pertinenti7. È stato dimostrato che i corpi multivessicolari (MVB) che trasportano vescicoli intraluminali (ILV) sperimentano il trasporto polarizzato verso l'IS8,9 ( Video1) sulla stimolazione TCR con antigene. La fusione di questi MVB alla membrana sinaptica induce la loro degranulazione e il rilascio degli ILV come esosomi alla fessura sinaptica8,10. Questo si verifica in IS formato da cellule Jurkat di tipo Th che sono state sfidate con cellule Raji rivestite in superantigeno SEE che agiscono come APC11, CD4 stimolato TCR- linfoblasti e CTL innescati. Così, le sinapsi fatte dalle cellule Jurkat costituiscono un valido modello per studiare il traffico di esosomi secretoria polarizzato. Inoltre, diversi decenni di indagine hanno dimostrato che molte intuizioni fondamentali sulla segnalazione TCR provenivano da studi con linee di cellule T trasformate, e in effetti il più noto di questi sistemi modello è la linea tcellulare T12di Jurkat.
La formazione di un IS completamente sviluppato produce diversi esiti biologici cruciali, tra cui l'attivazione di cellule Th, l'attivazione di CTL ingenui o l'uccisione di cellule bersaglio da parte di CTL innescati, oltre all'anergia oall'AICD 5. Pertanto, ci sono due tipi principali di secretoria è stabilito da linfociti T che si traducono in funzioni effettore immunitario molto diverse, ma allo stesso modo critiche, funzioni effettore immunitario1,6,13. Da un lato, l'IS da linfociti T citotossici innescati (CTL) induce una rapida polarizzazione (che va da secondi a pochi minuti) di granuli littici (chiamati "linfosomi segreti") verso l'IS. La degranulazione dei granuli littici induce la secrezione perforina e granzymes alla sinaptica sinapticasiccia 14, che sono molecole pro-apoptotiche. Il perforin e i granzi seminati, successivamente, inducono l'uccisione delle cellule bersaglio15,16. I CTL sviluppano sinapsi temporanee, della durata di pochi minuti, poiché le cellule bersaglio vengono uccise3,17. Ciò è probabilmente dovuto alla circostanza che il compito CTL ottimale richiede un contatto rapido e temporaneo al fine di distribuire il maggior numero possibile di attacchi letali a numerose celle bersaglio3,17. Al contrario, I linfociti come le cellule Jurkat generano IS stabile e di lunga data (da 10-30 min fino ad ore), poiché questo sembra essere necessario sia per la secrezione direzionale che per l'incessante di stimolando le citochine3,17. Le citochine sono anche racchiuse in vesciche secretorie e alcune di esse (ad esempio, IL-2, IFN-z) sperimentano il trasporto polarizzato verso l'IS17 e la secrezione. Una caratteristica essenziale dell'IS è la formazione di contatti esplorativi, deboli e transitori tra la cellula T e l'APC (Video 1) che possono produrre un'interazione più forte e la creazione di un IS maturo, a condizione che il TCR identifichi i complessi antigene-MHC cognati e che siano stabilite appropriate connessioni di co-stimolatori5 . Sia l'inizio dei contatti iniziali che la fondazione di un IS maturo, totalmente produttivo, sono processi intrinsecamente stocastici, veloci e asincroni5,18. Inoltre, vi è una frequenza scarsa nella creazione di coniugati da cellula a cellula19, che possono costituire una sfida per le tecniche di imaging (si prega di fare riferimento alle sezioni Risultati e Discussione).
Un'altra sfida principale nell'esame della polarizzazione del centro di organizzazione dei microtubuli (MTOC) e dei granuli secretori nei linfociti T è che l'intero processo è veloce (secondi a pochi minuti), in particolare nei CTL. Considerando questi fatti, la maggior parte degli approcci iniziali si confrontava con una strategia di fine punto in cui le cellule APC/target e i linfociti T sono mescolati congiuntamente e convergenti con una centrifugazione a bassa velocità, per favorire la creazione di coniugati da cellula a cellula, incubati per diversi minuti, fissati e successivamente valutati per il trasferimento di MTOC e/o vesciche secretorie verso l'IS20. Questo approccio ha due limitazioni significative: non sono stati raggiunti dati di tratta vivaci e sono stati ottenuti alti livelli di polarizzazione di granuli MTOC/secretory di sfondo, probabilmente a causa del carattere stocastico dell'IS stabilimento18. Inoltre, qualsiasi correlazione tra gli eventi di segnalazione iniziale stimolati dal TCR (ad esempio, l'aumento del calcio intracellulare, la riorganizzazione dell'atto) e la polarizzazione della vescicolo vessea secretoriale è problematica da indagare. Pertanto, disposizioni imperative per un'adeguata imaging dell'IS nelle cellule viventi si combinano per migliorare la materializzazione coniugata da cellula a cellula, per sincronizzare la generazione dell'IS e, quando possibile, per garantire la creazione di coniugati cellulari in campi XY al microscopio definito e in posizioni . Sono state sviluppate diverse strategie per evitare tutti questi problemi. È fuori dall'ambito di questo documento spiegare questi metodi, i loro benefici e le loro debolezze. Si prega di fare riferimento alle recensioni pubblicate in precedenza che affrontano questi punti importanti1,4,5,21.
Il fatto che i linfociti siano realizzati da linfociti di Th sono di lunga durata, e la circostanza che nei linfociti Th l'MTOC, i granuli secretori cimeli contenenti linfocini e MVB prendano da diversi minuti fino a ore per spostarsi e attraccare all'IS22 rende il Th-APC è un candidato ideale per l'imaging utilizzando il protocollo descritto qui.

<table><tbody><tr><td>Fotocamera Nikon DS-QI1MC</td><td>Nikon</td><td>MQA11550</td><td>Testa della fotocamera raffreddata</td></tr><tr><td>CMAC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C2110</td><td>Cell tracker blu</td></tr><tr><td>cellule JURKAT</td><td>ATCC ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Linfociti T effettori</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 pozzetti ibiTreat, &mu;-Slide 8 pozzetti Glass-Bottom</td><td>IBIDI</td><td>Cat.No: 80826, 80827</td><td>Colture cellulari e supporti per l'imaging cellulare</td></tr><tr><td>Microscopio NIKON Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td>NIKON Eclipse Ti-E</td><td>Microscopio completamente motorizzato a fluorescenza ad ampio campo, dotato dell'opzione Perfect Focus System (PFS)</td></tr><tr><td>Incubatore a tavolino per microscopio con miscelatore di gas manuale a 3 canali e gorgogliatore di gas/modulo di umidità</td><td>OKOLAB</td><td>H201-NIKON-TI-S-ER</td><td>Atmosfera per colture cellulari</td></tr><tr><td>Cellule Raji</td><td>ATCC ATCC</td><td>CCL-86</td><td>APC</td></tr><tr><td>RPMI medio GIBCO</td><td>ThermoFisher Scientific 21875034</td><td></td><td>Terreno di coltura</td></tr><tr><td>Streptococcus Enterotossina E (SEE)</td><td>Toxin Technology, Inc</td><td>EP404</td><td>Software per tossine batteriche</td></tr><tr><td>Huygens Essential</td><td>SVI</td><td>Huygens Essential</td> Software per la <td>deconvoluzione delle immagini</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>NIH</td><td>Image J</td><td>Software per immagini</td></tr><tr><td>Nikon NIS-AR</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements AR</td><td>Software di acquisizione e analisi delle immagini</td></tr></tbody></table>

immaginare la sinapsi immunologica umana

Imaging the Human Immunological Synapse

Lo scopo del metodo è quello di generare una sinapsi immunologica (IS), un esempio di coniugazione da cellula a cellula formata da una cellula che presenta l'antigene (APC) e da una cellula di tipo T e aiutante dell'effetto, e di registrare le immagini corrispondenti ai primi stadi della La formazione dell'IS e i successivi eventi di traffico (che si verificano sia nell'APC che nella cellula Th). Questi eventi alla fine porteranno alla secrezione polarizzata all'IS. In questo protocollo, le cellule Jurkat sfidavano con cellule Raji con cellule Raji pulsate da Staphylococcus mentre pulivano le cellule di Raji come modello di sinapsi cellulare, a causa della vicinanza di questo sistema sperimentale alla realtà biologica (coniugati sinaptici cellula-APC). L'approccio qui presentato prevede la coniugazione da cellula a cellula, acquisizione time-lapse, microscopia a fluorescenza ad ampio campo (WFFM) seguita dall'elaborazione delle immagini (deconvoluzione post-acquisizione). Questo migliora il rapporto segnale-rumore (SNR) delle immagini, migliora la risoluzione temporale, consente l'acquisizione sincronizzata di diversi fluorocromi nelle coniugati sinaptiche emergenti e diminuisce lo sbiancamento a fluorescenza. Inoltre, il protocollo è ben abbinato ai protocolli di fissazione delle cellule finali (paraformaldeide, acetone o metanolo), che consentirebbero ulteriori colorazioni e analisi dell'immunofluorescenza. Questo protocollo è anche compatibile con la microscopia confocale a scansione laser (LSCM) e altre tecniche di microscopia all'avanguardia. Come avvertenza principale, solo i confini T cell-APC (chiamati interfacce IS) che si trovavano all'angolo destro di 90 gradi rispetto al piano di messa a fuoco lungo l'asse z potevano essere correttamente immagine e analizzati. Esistono altri modelli sperimentali che semplificano l'imaging nella dimensione s e le seguenti analisi dell'immagine, ma questi approcci non emulano la superficie complessa e irregolare di un APC e possono promuovere interazioni non fisiologiche nell'IS. Pertanto, l'approccio sperimentale qui utilizzato è adatto a riprodursi e ad affrontare alcune complessità biologiche che si verificano all'IS.

Abbiamo seguito il protocollo descritto al fine di generare coniugati di sinapsi immunitaria Jurkat-Raji e di immaginare correttamente le prime fasi della formazione dell'IS. Il nostro obiettivo era quello di migliorare i primi approcci20 seguiti in precedenza per studiare la polarizzazione dell'MTOC e la macchina secretoria verso l'IS. Questi approcci si basavano su una strategia di punto finale che non permetteva l'imaging della formazione dell'IS o dei primi eventi sinaptici, poiché in queste strategie la formazione IS si è verificata nel pellet di cellule miste e centrifuse, ma non al microscopio. Il nostro protocollo è stato progettato per evitare questo avvertimento principale, poiché l'approccio si basava sull'uso di una concentrazione cellulare appropriata (passaggi 2 e 3), per favorire la formazione del coniugato IS da cellula a cellula sui propri vetrini della camera al microscopio (8 micro camera) montati sull'incubatore dello stadio preriscaldato (nel passaggio 4). Questa strategia induce la formazione IS, contemporaneamente alla cattura dell'imaging time-lapse (Video 1).
La figura 1 rappresenta il coniugato sinaptico Jurkat-Raji ottenuto dopo il protocollo (passaggio 5.2). L'immagine rappresenta il primo fotogramma di un esperimento rappresentativo time-lapse. 2 x 105 celle Raji e 2 x 105 cellule Jurkat sono state aggiunte a un pozzo di 1 cm2. Il pannello superiore mostra il canale di trasmissione, il pannello centrale è costituito da canali CMAC (blu) (celle Raji) e il pannello inferiore mostra sia la trasmissione che i canali fusi CMAC. Le frecce gialle etichettano alcuni coniugati sinaptici, come riferimento, mentre le frecce verdi indicano coniugati sinaptici fatti da una cellula Jurkat e diverse cellule Raji (coniugati complessi). La diminuzione delle concentrazioni delle cellule (105 o meno cellule nel pozzo di 1 cm2) eluderà la formazione di coniugati cellulari complessi, ma potrebbe non esserci abbastanza coniugato cellulare per la successiva analisi del traffico polarizzato (vedi sotto), che a sua volta diminuirà anche le possibilità di trovare e di immaginare coniugati sinaptici emergenti.
La figura 2 rappresenta le schermate corrispondenti ai parametri di imaging utilizzati per l'acquisizione simultanea dei due diversi fluorocromi (CMAC e GFP-CD63) utilizzando il software appropriato (ad esempio, NIKON NIS_AR) in un esperimento time lapse rappresentativo corrispondente al Video 1.
Il video 1 (sinapsi immunologiche, grezzo) rappresenta un linfocito Jurkat T che esprime GFP-CD63 (un marcatore di corpi multivessicolari-MVB, vescicoli verdi) e la formazione di una doppia sinapsi tra 1 cellula Jurkat e 2 cellule Raji etichettate con CMAC, in blu (uno di loro subisce un inghiottimento). È stato registrato il movimento simultaneo di MVB all'interno della cella Jurkat verso le aree sinapsi (frequenza fotogrammi di cattura: 1 fotogramma ogni 20 secondi per GFP-CD63; velocità di riproduzione video: 2 fotogrammi per s). I coniugati sinaptici sono stati ottenuti e immaginati seguendo il protocollo descritto in precedenza (Passaggio 6.2), che ha permesso l'imaging di sinapsi emergenti (Video 1). L'acquisizione simultanea dei canali di fluorescenza GFP-CD63 e CMAC è stata eseguita utilizzando un software appropriato (ad esempio, NIS-AR, Table of Materials). Il video rappresenta i dati grezzi di un esperimento rappresentativo time-lapse. Il sistema di messa a fuoco automatico è stato definito con un offset appropriato rispetto alle celle Raji legate al fondo di vetro, per assicurare una messa a fuoco stabile lungo l'esperimento.
Il video 2 (sinapsi immunologiche, dopo la deconvoluzione) corrisponde al Video 1, ma la deconvoluzione delle immagini del canale di fluorescenza GFP-CD63 è stata eseguita utilizzando un software di deconvoluzione appropriato (cioè Huygens), utilizzando l'opzione ottica "wide field" e i parametri ottici appropriati (passaggio 8). Questo canale deconvoluto è stato successivamente fuso al CMAC, canale grezzo. Il miglioramento del rapporto segnale-rumore e la nitidezza dell'immagine è evidente. La deconvoluzione è stata eseguita dopo l'acquisizione, come descritto sopra. Per dettagli specifici relativi al software di deconvoluzione si prega di fare riferimento a4.
Il video 3 (sinapsi immunologica, dopo la fissazione e la colorazione dell'immunofluorescenza) rappresenta una pila di z (dimensione del passo z è 0,8, 5 fotogrammi) di un coniugato IS fisso dopo il passaggio 6 del protocollo (fissazione dell'acetone). Dopo la fissazione, l'immunofluorescenza è stata eseguita seguendo i protocolli standard25 utilizzando Phalloidin per visualizzare la F-actin (verde), anti-CD63 per visualizzare MVB (magenta), anti-z-tubulina per visualizzare MTOC (rosso). CMAC (blu) etichetta la cella Raji. Successivamente il coniugato è stato rappresentato dall'epifluorescenza e diversi canali deconvoluiti utilizzando l'opzione ottica "wide field" e i parametri ottici appropriati (passaggio 7). I canali deconvolutizzati sono stati successivamente fusi al CMAC, canale grezzo, come indicato nei diversi pannelli (CMAC più Transmittance-TRANS, CMAC più Phallodin, CMAC più anti-CD63 e CMAC più anti-z-tubulina, rispettivamente). La freccia bianca etichetta la sinapsi, mentre la freccia verde etichetta l'MVB e la freccia gialla etichettano come MTOC. La quantificazione dettagliata della polarizzazione MVB e MTOC è stata spiegata altrove25.
L'approccio qui presentato prevede la formazione di coniugati da cellula a cellula e, contemporaneamente, l'acquisizione di time-lapse mediante microscopia a fluorescenza ad ampio campo (WFFM) seguita dall'elaborazione delle immagini (deconvoluzione post-acquisizione). Questa tattica ha migliorato il rapporto segnale-rumore (SNR) delle immagini, migliorato la loro risoluzione temporale e ha permesso l'acquisizione sincronizzata di diversi fluorocromi in coniugati sinapticiemergenti 4. Inoltre, il protocollo è ben abbinato ai successivi metodi di fissazione delle cellule dell'estremismo (paraformaldeide, acetone o metanolo), che consentirebbero ulteriori colorazioni e analisi dell'immunofluorescenza e analisi25 (Video 3). Questo protocollo è compatibile anche con la microscopia confocale a scansione laser e altre tecniche di microscopia all'avanguardia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60312/60312fig1.jpg"> Figura 1: Rappresentante campo di microscopia a doppia dimensione di coniugati sinaptici. L'immagine rappresenta il primo fotogramma di un esperimento di time-lapse rappresentativo che segue il protocollo. Il pannello superiore mostra il canale di trasmissione, il canale CMAC del pannello centrale (celle Raji) e il pannello inferiore entrambi i canali uniti. Le frecce gialle etichettano alcuni coniugati sinaptici, come riferimento. Le frecce verdi indicano coniugati sinaptici complessi (cioè una cellula Jurkat che stabilisce sinapsi con più di una cellula Raji). Catturato con un obiettivo EWD 40x (0,6 NA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/60312fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60312/60312fig2a.jpg"> Figura 2: Impostazioni del microscopio time lapse. L'immagine corrisponde a diverse schermate corrispondenti ai parametri di imaging utilizzati per l'acquisizione simultanea dei due diversi fluorocromi (CMAC e GFP-CD63) utilizzando un software appropriato (ad esempio, NIKON NIS_AR) in un esperimento di time lapse rappresentativo corrispondente al Video 1. Ogni frame per il canale GFP-CD63 è stato acquisito ogni 20 s. Solo un fotogramma per un canale UV su otto fotogrammi per il canale GFP è stato catturato al fine di mantenere la vitalità cellulare lungo l'esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/60312fig2alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/60312/60312vid1.jpg"> Video 1: Sinapsi immunologiche fatte da una cellula Jurkat che esprime GFP-CD63, dati grezzi. Le cellule Raji B etichettate con il tracker cellulare blu (CMAC, blu) sono state pulsate con SEE per 30 min e sinapsi con cellule Jurkat che esprimono GFP-CD638. Sono stati acquisiti intervalli corrispondenti ai canali GFP-CD63 e CMAC (20 s per fotogramma; velocità di riproduzione video - 2 fotogrammi per s) e viene mostrato un esempio rappresentativo. Catturato con un obiettivo 60x PLAN APO (1.4 NA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/Video_1.mov" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/60312/60312vid2.jpg"> Video 2: Sinapsi immunologiche fatte da una cellula Jurkat che esprime GFP-CD63, dopo la deconvoluzione. Uguale al Video 1,ma le immagini sono state deconvoluted utilizzando un software di deconvoluzione. Il miglioramento del rapporto segnale-rumore e la maggiore nitidezza, dovuta all'eliminazione del contaminante dalla fluorescenza di messa a fuoco, è evidente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/Video_2.mov" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/60312/60312vid3v2.jpg"> Video 3: Sinapsi immunologica fissa e immunostaina. L'immagine mostra un coniugato sinaptico fisso rappresentativo dopo il passaggio 7 del protocollo e la successiva immunofluorescenza. CMAC (blu) etichetta le celle raji, la trasmissione (TRANS) per mostrare il coniugato sinaptico (freccia bianca), le etichette di Phalloidin F-actin (verde), etichette anti-CD63 MVB (magenta, freccia verde) e le etichette anti-z-tubulina MTOC (freccia rossa, gialla), rispettivamente. Questi canali sono stati immagini per epifluorescenza, deconvoluted e fusi come indicato. Il video include uno stack z (dimensione del passo z è 0,8 m, 5 fotogrammi). La freccia bianca etichetta l'area di contatto sinaptica, mentre la freccia verde etichetta l'mVB e la freccia gialla etichettano l'MTOC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/Video_3.mov" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).</a>

Questo protocollo immagini sia la formazione di sinapsi immunologica che il successivo traffico secretoria polarizzato verso la sinapsi immunologica. I coniugati cellulari si formarono tra una cellula Raji dal polso superantigeno (che fungeva da cellula che presenta l'antigene) e un clone di Jurkat (che fungeva da aiutante echeggiatore del linfocito T).

Immaginare la sinapsi immunologica umana

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Lo scopo del metodo è quello di generare una sinapsi immunologica che è un esempio di coniugazione cellula-cellula formata da una cellula che presenta antigene e da un linfocita di aiuto t. Il nostro obiettivo è registrare le prime fasi della formazione della sinapsi immunitaria e registrare gli eventi di traffico che si verificano nel linfocita T-helper. Questi alla fine porteranno alla secrezione polarizzata alla sinapsi immunitaria.L'approccio qui presentato prevede coniugazione da cellula a cellula, acquisizione time-lapse, microscopia a fluorescenza a campo largo e successiva elaborazione delle immagini. Ciò migliora il rapporto segnale-rumore delle immagini, migliora la risoluzione temporale e consente l'acquisizione simultanea di diversi fluorocromi nei coniugati sinaptici emergenti e diminuisce lo sbiancamento della fluorescenza. Inoltre, il protocollo è compatibile con i protocolli di fissazione delle cellule del punto finale che consentiranno la colorazione e l'analisi dell'immunofluorescenza.Questo protocollo è anche compatibile con la microscopia fluorescente a scansione laser e altre tecniche di microscopia all'avanguardia. A dimostrare la procedura saranno Ana Bello, una studentessa laureata, Alejandro Garrido, un tecnico, e Solange Moreno, una studentessa laureata. Per iniziare questa procedura, aggiungere 150 microlitri di fibronectina a ciascun pozzo di uno scivolo a camera a otto microwell e incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti a un'ora.Dopo il periodo di incubazione, aspirare la fibronectina e lavarsi ogni bene con 200 microlitri di PVS per due minuti con delicato scuotimento. Ripetere ancora una volta questo lavaggio e lasciare il secondo lavaggio nel pozzo. Trasferire 10 millilitri di una precoltura confluente di cellule Raji in un tubo a V-bottom da 15 millilitri.Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare delicatamente il pellet cellulare in mezzo caldo e completo ad una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro. Per etichettare le cellule Raji, trasferire il numero richiesto di cellule nel mezzo di coltura in un tubo a due millilitri.Per lo scivolo a camera a otto microwell, è necessario un totale di 1,6 millilitri di sospensione cellulare. Aggiungere il localizzatore di celle blu a una concentrazione finale di 10 micromolari. Rimospendare le celle macchiate di blu del localizzatore di cellule e trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo delle diapositive a camera rivestite di fibronectina preparate.Incubare lo scivolo della camera a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica per 30 minuti o un'ora. Successivamente, agitare delicatamente le diapositive della camera al microscopio per assicurarsi che le cellule Raji siano rispettate. Lavare bene ciascuno con cura con un mezzo di coltura cellulare caldo e completo per eliminare il blu del tracker di cellule in eccesso.Assicurarsi che le cellule Raji siano rispettate sul fondo delle piastre e mostrano spazi tra loro e non sono confluenti. Il 50-60% della confluenza cellulare è appropriato. In primo luogo, aggiungere l'enterotossina E stafilococco ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro ad ogni pozzo.Assicurarsi che le cellule Raji siano pulsate con superantigeno altrimenti il recettore delle cellule T delle cellule Jurkat non riconoscerà l'SCE e la sinapsi non si formerà. Incubare lo scivolo della camera a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica per almeno 30 minuti. Successivamente, ottenere una coltura precedentemente in crescita di cellule di Jurkat ad una concentrazione compresa tra 1 e 2 milioni di cellule per millimetro.Osservare le cellule al microscopio a contrasto di fase e quindi trasferire le cellule in un tubo con fondo a V da 15 millilitri. Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare delicatamente le cellule in un mezzo di coltura caldo e completo ad una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro.Quindi mantenere le cellule di Jurkat in coltura a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica fino a quando non sono pronte per l'uso. Recuperate le diapositive della camera contenenti le cellule Raji con etichetta blu Staphylococcus Enterotoxin E dall'incubatrice. Aspirare con cura il mezzo di coltura da ogni pozzo uno per uno con una pipetta posta in un angolo del pozzo.Sostituire immediatamente il mezzo con 200 microlitri delle cellule di Jurkat rimorsiate nel mezzo di coltura cellulare. Se viene eseguito un time lapse, procedere rapidamente al microscopio. Individuare la diapositiva a camera sul cameriere di staging al microscopio e selezionare alcuni campi appropriati.Preparare il microscopio e la camera di incubazione prima dell'imaging. Dopo che le cellule di Jurkat sono state aggiunte a ciascun pozzo contenente le cellule Raji, individuare rapidamente lo scivolo della camera microwelled sull'incubatore a fasi del microscopio preriscaldato e selezionare alcune posizioni XY. Se è previsto solo un esperimento endpoint, incubare lo scivolo della camera a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del cinque per cento per una o due ore.Dopo il periodo delle impostazioni cultura, verificare la formazione coniugata e successivamente correggere i coniugati come delineato nel protocollo di testo. Per fissare le cellule, aggiungere RPMI caldo senza FCS e agitare delicatamente. Aspirare l'RMPI e aggiungere 200 microlitri di PFA o acetone prechilled ad ogni pozzo.Incubare lo scivolo della camera a temperatura ambiente o sul ghiaccio per 20 minuti. Quindi lavare ogni bene due volte con PVS e aggiungere 200 microlitri di soluzione di tempra. In questo studio, vengono generati coniugati di sinapsi immunitaria Jurkat-Raji e le prime fasi della formazione di sinapsi immunologica sono correttamente immagini.Questa strategia induce la formazione di sinapsi immunologica eseguendo contemporaneamente l'imaging time lapse. Qui sono mostrati i coniugati sinaptici rappresentativi Jurkat-Raji ottenuti da questa tecnica, tra cui un'immagine del canale di trasmittanza, il canale blu del localizzatore di celle ed entrambi questi canali uniti. Si possono vedere alcuni coniugati sinaptici, inclusi quelli fatti di una sola cellula di Jurkat e diverse cellule Raji, che sono coniugati complessi.La diminuzione delle concentrazioni cellulari eluderà la formazione di coniugati cellulari complessi, ma potrebbe non fornire abbastanza coniugati cellulari per la successiva analisi del traffico polarizzato, che a sua volta ridurrà le possibilità di trovare e di individuare coniugati sinaptici emergenti. Una deconvoluzione delle immagini del canale di fluorescenza GFP-CD63 viene eseguita con un software di deconvoluzione appropriato utilizzando l'opzione ottica wide field e i parametri ottici appropriati. Questo canale deconvoluto è stato successivamente fuso al canale largo blu del localizzatore di celle.Vi è un miglioramento sia del rapporto segnale-rumore che della nitidezza. Qui viene mostrata una pila Z rappresentativa di un coniugato fisso di sinapsi immunologica. L'immunofluorescenza viene eseguita usando la phalloidina per visualizzare l'F-actina, l'anti-CD63 per visualizzare l'MVB e l'anti-gamma-tubulina per visualizzare l'MTOC mentre il localizzatore di cellule blu etichettava le cellule Raji.Il trasfisso opzionale delle celle di Jurkat consentirà la visualizzazione del traffico dei granuli secretori nelle cellule viventi. Ad esempio, quando viene espresso GFP-CD63, è possibile registrare il movimento delle vescicole decorate con GFP-CD63. Il protocollo è compatibile con i protocolli di fissazione del punto finale che consentiranno ulteriori protocolli e analisi di colorazione dell'immunofluorescenza.Esistono modelli sperimentali di produttività che possono semplificare l'imaging nella sinapsi immunitaria, ma questi modelli non emulano la superficie complessa e irregolare sulle cellule antigene-presentatore che possono produrre interazioni non fisiologiche alla sinapsi immunitaria. L'approccio qui descritto è adatto a riprodurre e confermare alcune complessità biologiche che si verificano alla sinapsi immunitaria. Superantigen è una tossina pericolosa, quindi assicurati di indossare i guanti e lascia cadere la punta usata sulla scatola pericolosa.

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Formazione immunologica di sinapsi tra le cellule T helper e le cellule presentanti l'antigene

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Valutazione della topologia immunologica delle sinapsi attraverso l'imaging di cellule vive

Qui illustriamo il protocollo per l'imaging a due colori STED nanoscopia il citotossica sinapsi immunitaria delle cellule NK ricapitolato su vetro. Usando questo metodo si ottiene nm risoluzione sub-100 di proteine ​​sinaptiche e il citoscheletro.

Visualizzazione della immunologica Synapse da Dual Color Time-gated emissione stimolata Depletion (STED) Nanoscopia

Descriviamo qui una combinazione della tecnica del doppio strato lipidico supportato da vetro per formare sinapsi immunologiche con la tecnica di imaging a super-risoluzione della microscopia STED (Stimulated Emission Depletion). L'obiettivo di questo protocollo è fornire agli utenti le istruzioni necessarie per eseguire con successo queste due tecniche.

Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

L'immunità adattativa è controllata da 'sinapsi immunologiche' dinamiche formate tra le cellule T e le cellule presentanti l'antigene. Questo protocollo descrive i metodi per studiare le cellule endoteliali sia come APC fisiologiche poco studiate sia come un nuovo tipo di "modello di APC cellulare planare".

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Qui, descriviamo un completo flusso di lavoro per l'analisi qualitativa e quantitativa del sistema immunitarie sinapsi tra cellule T umane primarie e cellule presentanti l'antigene. Il metodo si basa su imaging citometria a flusso, che permette l'acquisizione e la valutazione di diverse immagini di migliaia di cellule all'interno di un periodo di tempo relativamente breve.

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di microscopia STED contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine dei microtubuli in cellule di B che si sono diffuse sulle lamelle rivestite con gli anticorpi per il recettore delle cellule B, un modello per la fase iniziale di formazione della sinapsi immuni.

Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

Impara a generare e visualizzare sinapsi immunologiche umane tra cellule Raji e linfociti T-helper Jurkat. Questo protocollo di microscopia a fluorescenza consente di osservare il traffico polarizzato e la secrezione cellulare in tempo reale.

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