Name: Infezione da HIV cronica, acuta e riattivata in modelli di topo immunodeficienti umanizzati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri tre modelli di topi immunodeficienti umanizzati per studiare l'infezione da HIV cronica, acuta e riattivata. Questo metodo consente di analizzare la dinamica virale e le risposte immunitarie in vivo.

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Questo lavoro è stato supportato dai fondi interni della divisione clinica IHV a JC .

In questo lavoro, tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite secondo protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la University of Maryland School of Medicine (numeri di protocollo 1018017, 1018018 e 0318009).
1. Human CD34- Innesto HSC di topi neonati
<ol><li>Utilizzare sempre attrezzature di protezione personale usa e getta (PPE), tra cui scrub sterili, guanti, scarpe dedicate, copriscarpe, maschera, occhiali, capelli / barba cofano, e cappotti da laboratorio sterili.</li>
	<li>Sospendere nuovamente 1 x 106 dei CD34congelati - HSC (vedi Tabella dei materiali)in 10 mL di supporti RPMI 1640 10% FBS sotto un armadio di biosicurezza certificato e mantenere condizioni sterili.</li>
	<li>Utilizzare 10 l della sospensione per contare (per assicurare la presenza del numero previsto di cellule) e controllare la vitalità delle cellule digitando l'esclusione blu trypan in un emocitometro.</li>
	<li>Centrifuga a 400 x g per 15 min a temperatura ambiente (RT). Scartare il supernatante e risospendere a freddo 1x PBS alla concentrazione richiesta (1,4 x 105 di CD34- HSC in 50 . Tenere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione.</li>
	<li>Collocare i cuccioli (NS - acatenanulli di entrambi i sessi da 1 a 4 giorni) in un piatto sterile di 100 mm2 Petri insieme a una piccola quantità di materiale da letto dalla gabbia dell'allevatore. Inoltre, strofinare biancheria da letto pulita tra le mani per mascherare ulteriormente eventuali odori stranieri sui cuccioli destinatario. NOTA: Questo riduce al minimo gli odori estranei che vengono impregnati sui cuccioli, migliorando così le possibilità che le madri accettino i loro cuccioli di nuovo in gabbie dopo la procedura.</li>
	<li>Mettere il piatto Petri in una gabbia di trasporto pulita e mettere la gabbia in una gabbia pulita di microisolatore di topo per proteggere i cuccioli dall'ambiente. Coprire la gabbia di trasporto con un coverpad per evitare l'esposizione degli animali alla luce esterna durante il transito verso la sala di irradiazione.</li>
	<li>Irradia cuccioli con 100 cGy irradiazione dell'intero corpo (WBI) per esposizione a una fonte di 137 C. Pulire l'interno dell'irradiatore con soluzione disinfettante, posizionare i topi nell'irradiatore e accendere il giradischi in modo che tutti i cuccioli siano irradiati in modo omogeneo. Chiudere l'irradiatore e premere l'interruttore di alimentazione per avviare il processo di irradiazione. Attendere il completamento del tempo di irradiazione e rimuovere immediatamente i topi. NOTA: Poiché l'irradiazione non genera stress nei topi, non è necessaria l'anestesia precedente.</li>
	<li>2–4 h dopo la procedura di irradiazione, mettere i cuccioli in un armadio di biosicurezza all'interno di un piatto Petri sterile refrigerato coperto di garza sterile sul ghiaccio, fino ad anestesizzare (5-10 min). Si ottiene un'anestesia sufficiente quando i movimenti lordi cessano.</li>
	<li>Caricare la siringa con un ago attaccato (29 G, 0,5") con 50 gradi l della sospensione cellulare e 1,4 x 105 di CD34: HSC sotto l'armadietto di biosicurezza certificato.</li>
	<li>Per l'innesto tramite iniezione epatica, restringere i cuccioli con il pollice e le dita indice. Per ridurre al minimo il sistema di ritenuta del topo (30-45 s), lasciare che uno sperimentatore tenga il cucciolo e somministra l'iniezione e che il secondo sperimentatore carichi la siringa con le sospensioni HSC. Pulire il sito di iniezione con il 70% di alcol e fornire 50 -L di cellule direttamente nel fegato. Utilizzare un angolo di ago poco profondo durante l'iniezione per evitare completamente perforare il fegato. Come controllo, iniettare i topi con 50 -L di 1x PBS nel fegato.</li>
	<li>Disporre i cuccioli su un piatto Petri sterile preriscaldato ricoperto di garza sterile per 1-5 min per consentire il recupero. Preriscaldare il piatto utilizzando un pad di riscaldamento a infrarossi per i roditori a 20 gradi centigradi per garantire che i cuccioli non siano surriscaldati.</li>
	<li>Immediatamente prima di restituire i cuccioli ai loro genitori, applicare una piccola quantità di unguento a base di mentolo ed eucalipto, usando il pollice e le dita indice, al muso di entrambi i genitori per evitare il cannibalismo o il rifiuto dei cuccioli.</li>
	<li>Controllare le gabbie ogni giorno, alla ricerca di eventuali segni di malattia innesto-ospite (GVHD) nei cuccioli come pelle secca, nessuna alimentazione, eruzione cutanea, ealopecia. Eutanasia gli animali se si osserva uno di questi segni.</li>
	<li>Topi di svasare a 3 settimane di età, raggruppandoli per sesso. Non mettere più di 5 animali per gabbia. Verificare l'innesto nel sangue periferico da citometria di flusso a 14 settimane di età. NOTA: il tasso di successo dell'innesto è compreso tra l'80%-100%.</li>
</ol>2. Innesto di pGRI umani di topi giovani
<ol><li>Per i modelli acuti e di riattivazione, iniettare 6-8 topi NS - a catenanulla intraperitonealmente con PCR umani derivati da un donatore sano o da un paziente infetto da HIV che era sotto ART, rispettivamente. In entrambi i modelli, includere i topi iniettati con pCSV da un donatore sano senza infezione da HIV (sham) come controlli.</li>
	<li>Strato 15 mL di sangue intero in 5 mL di grado di gradiente di densità sterile in un tubo conico da 50 mL.</li>
	<li>Centrifuga a 400 x g per 30 min a RT, senza freni, per evitare che il buffy coat venga mescolato con il mezzo di pendenza densità di densità.</li>
	<li>Raccogliere con attenzione la frazione di celle mononucleari (tra il gradiente di densità medio e supernatante) e trasferire il pelo di bufala in un tubo di centrifuga di 15 mL contenente 10 mL di 1x PBS. Centrifuga a 300 x g per 10 min a RT.</li>
	<li>Eliminare il supernatante e rimuovere i globuli rossi rimanenti eseguendo il lising con 5 mL di tampone ACK aggiunti alle cellule pellettate. Incubare per 4 min a RT.</li>
	<li>Centrifuga a 300 x g per 10 min a RT. Scartare il supernatante e risospendere in 10 mL di 1x PBS o RPMI 1640 medio.</li>
	<li>Utilizzare 10 l della sospensione cellulare per contare le cellule e verificare la vitalità digitando l'esclusione blu trypan in un emocitometro. Tipicamente, 1–2 x 106 cellule si ottengono per ogni 1 mL di sangue, con più di 95% vitalità.</li>
	<li>Centrifuga a 300 x g per 10 min a RT. Scartare il supernatante e regolare il numero di cellulare alla concentrazione richiesta (in questo caso, 3,5 x 106 cellule in 200 - L di 1x PBS).</li>
	<li>Caricare la siringa con un ago annesso (28 G, 0,5") con 3,5 x 106 di PBMC in 200 - L di 1x PBS sotto un armadio di biosicurezza certificato.</li>
	<li>Togliere il mouse dalla gabbia e tenerlo per la coda in modo che possa afferrare la maglia, applicando una leggera trazione all'indietro. Quindi, posiziona l'indice e le dita del pollice sulle spalle dell'animale, afferrando la pelle sciolta del collo e usando il dito medio per stabilizzare la schiena.</li>
	<li>Far scorrere la testa del mouse indietro in modo che la sua schiena è sopra la testa. Questo permette di spostare i visceri nella cavità addominale all'indietro e riduce il rischio di forare gli organi interni durante l'iniezione.</li>
	<li>Pulire il sito di iniezione con il 70% di alcol.</li>
	<li>Penetrare la siringa utilizzata nel passaggio 2.9 attraverso la parete addominale e aspirare prima di iniettare le cellule, se viene aspirato del materiale, rimuovere la siringa e scartarla. In caso contrario, iniettare lentamente le cellule nella cavità intraperitoneale, rimuovere la siringa e scartarla. Iniettare 1x PBS per controllare i topi.</li>
	<li>Riportare l'animale alla sua gabbia.</li>
	<li>Verificare l'innesto nel sangue periferico da citometria di flusso a 3 settimane dopo l'iniezione.</li>
</ol>3. Assistenza post-innesto
<ol><li>Identificare i topi mediante l'etichettatura dell'orecchio.</li>
	<li>Osservare i topi utilizzati in questi esperimenti da vicino 2 volte al giorno dopo ogni procedura per i segni clinici di disagio.</li>
	<li>Dopo il trapianto di cellule umane, monitorare i topi per il GVHD. Per monitorare i sintomi di GVHD nei topi neonati, giovani e adulti, valutare gli animali per la comparsa di malattie della pelle (ad esempio, colore, secchezza, eruzione cutanea, alopecia), oltre alla misura del peso corporeo. Valutare gli animali che mostrano questi segni da un veterinario per considerare l'eutanasia precoce.</li>
</ol>4. procedura di infezione da HIV e procedura di infezione fittizia
NOTA: Per i modelli cronici e acuti, i topi sono infettati dal ceppo di riferimento HIV BaL rispettivamente alla settimana 14 e alla settimana 3 dopo l'innesto. Le iniezioni con HIV vengono somministrate per via intraperitaneiale nei quadranti addominali inferiori.
<ol><li>Eseguire il processo di caricamento del virus/PBS in siringhe, utilizzando un ago da 28 G 0,5", negli armadi BSL2 seguendo le procedure ABSL2. La quantità totale di virus iniettato è 15.000 dose infettiva di coltura mediana (TCID50) in 200 - L di RPMI sterile 1640.</li>
	<li>Togliere il mouse dalla gabbia e tenerlo per la coda in modo che possa afferrare la maglia, applicando una leggera trazione all'indietro. Quindi, posiziona l'indice e il pollice sulle spalle dell'animale, afferrando la pelle sciolta del collo e usando il dito medio per stabilizzare la schiena.</li>
	<li>Far scorrere la testa del mouse indietro in modo che la sua schiena è sopra la sua testa. Questo permette di spostare i visceri nella cavità addominale all'indietro e riduce il rischio di foratura degli organi interni durante l'iniezione.</li>
	<li>Pulire i topi con un'alcol tampone pre-bagnata nel quadrante inferiore sinistro/destro dell'addome. Iniettare 15.000 TCID50 del virus HIV BaL contenuto in 200 - L di RPMI sterile 1640.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, riportare il topo alla sua gabbia di casa.</li>
</ol>5. Raccolta di sangue per puntura retroorbitale
NOTA: Il sanguinamento retroorbitale consente la rapida raccolta di sangue, riducendo così il tempo complessivo di raccolta e aumentando la stabilità dei marcatori linfociti umani. Utilizzare tubi EDTA per raccogliere il sangue dei topi.
<ol><li>Nel modello cronico, a 14 settimane dopo l'iniezione HSC, raccogliere il sangue tramite vena retroorbitale. Nei modelli acuti e di riattivazione, eseguire questa procedura a 3 settimane dopo l'iniezione PBMC.</li>
	<li>Anestesizzagli gli animali usando 250 l di inalazione di isofilurano prima della raccolta del sangue in una cappa di biosicurezza di classe B2 che viene dotti esternamente.</li>
	<li>Distribuisci l'Isoflurane in batuffoli di cotone sotto una rete metallica in un barattolo trasparente da 1 L in un armadio di biosicurezza ventilato all'esterno dell'edificio. L'uso della rete assicura che gli animali non contattino il cuscinetto imbevuto di isoflurane, che può causare irritazione cutanea e potenziale sovradosamento poiché l'ioflurane viene assorbito anche attraverso la pelle. Inoltre, mettere un asciugamano di carta morbida tra la maglia e l'animale per evitare lesioni agli arti.</li>
	<li>Una volta che il barattolo è saturo di isoflurane (circa 1 min dopo l'aggiunta), introdurre l'animale e osservare la frequenza respiratoria, che aumenterà quindi diminuire. Controllare l'indicazione clinica di un piano profondo di anestesia, che include la mancanza di un riflesso di raddorziamento (su barattolo ribaltamento delicatamente) e la mancanza di movimenti grossolani. Avviare la procedura di sanguinamento non appena l'animale è completamente rilassato e manca il riflesso pizzico della dita dei impideli. NOTA: Poiché l'Isoflurane evapora, dispensa più droga se non si osservano segni di anestesia.</li>
	<li>Per il sanguinamento retroorbitale, premere la vena giugulare esterna del topo caudal alla mandiboriera con il pollice e, con la stessa mano, elevare delicatamente la palpebra superiore con l'indice.</li>
	<li>Inserire un tubo ematocrato nel canto mediale dell'occhio e dirigerlo in direzione ventrolaterale fino a quando il sangue inizia a fluxare.</li>
	<li>Raccogliere almeno 100 l di sangue. Una volta ottenuto il volume di sangue desiderato (un volume non superiore all'1% del peso corporeo dell'animale), interrompere la pressione giugulare esterna e rimuovere il tubo di ematocrit.</li>
	<li>Assicurarsi che l'emostasi sia completa applicando la pressione diretta sull'occhio utilizzando una garza sterile per un minimo di 30 s.</li>
	<li>Applicare gocce di tetracaina nell'occhio. Monitorare l'animale fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia e rimetterlo nella gabbia. NOTA: Il 100 L di sangue raccolto viene utilizzato per la valutazione del livello di innesto delle popolazioni umane CD45e di altre cellule del sangue, nonché per la valutazione del carico virale al plasma.</li>
</ol>6. Screening del livello di innesto e dell'analisi della citometria di flusso
<ol><li>Seguire un protocollo di colorazione della citometria di flusso convenzionale per il sangue intero, che include l'incubazione di anticorpi anti-umani con etichetta fluorocro (per il pannello di flusso suggerito, vedi Tabella dei materiali), seguito dalla lisi dei globuli rossi e dai passaggi di lavaggio13,15. NOTA: Per lo screening del livello di innesto, includere un anticorpo CD45 anti-umano. Per il confronto, può essere utilizzato anche un anticorpo CD45 anti-topo. Includere controlli di compensazione e un campione di sangue umano macchiato con la stessa miscela di anticorpi, campioni di topo e sangue umano incontaminati e controllo non umanizzato per testare la reattività incrociata dei reagenti. Dopo la colorazione, c'è sempre qualche segnale di fondo; tuttavia, tutti i segnali positivi sono chiaramente distinti dai controlli negativi e interreattivi.</li>
	<li>In un citometro di flusso appropriato, acquisire almeno 10.000 eventi sulla porta dei linfociti (FSC-A contro SSC-A). Per l'analisi della citometria di flusso, dopo l'esclusione duplicata, determinare la percentuale di cellule CD45 umanee altre popolazioni di cellule di interesse.</li>
</ol>7. Valutazione del carico virale al plasma
<ol><li>Valutare il carico virale negli animali infetti da HIV 1x a settimana dopo l'infezione.</li>
	<li>Dopo l'emorragia retroorbitale (circa 100 o L), ottenere il plasma raccogliendo il supernatore dopo la centrifugazione del sangue anticoagulato a 3.500 x g per 3 min in una microcentrifuga. Il pellet viene utilizzato per la fenotipizzazione delle cellule del sangue.</li>
	<li>Utilizzare un kit di estrazione dell'RNA virale commerciale (vedi Tabella dei materiali)per ottenere RNA da 40 - L di plasma.</li>
	<li>Convertire l'RNA in cDNA utilizzando il primo mix di sintesi di deformazione (vedi Tabella dei materiali)e il primer del bavaglio dell'HIV SK431.</li>
	<li>Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale utilizzando I primer HIV Gag SK38/SK39 e i coloranti verdi fluorescenti (ad esempio, verde SYBR) come descritto negli studi precedenti13,25.</li>
</ol>8. Somministrazione di terapia antiretrovirale
<ol><li>Somministrare l'ART orale almeno 3 settimane dopo l'infezione, quando si osserva un alto carico virale, nei modelli cronici, acuti e di riattivazione.</li>
	<li>Calcolare le dosi di tenofovir disoproxil fumarate (TDF), emtricitabine (FTC) e raltegravir (RAL), in base ai valori Km di 37 e 3 per gli esseri umani e topi, rispettivamente26. Tipicamente, le dosi umane equivalenti di TDF, FTC e RAL sono rispettivamente 61,7 mg/kg/giorno, 40,7 mg/kg/giorno e 164 mg/kg/giorno, rispettivamente.</li>
	<li>Per la somministrazione in acqua potabile, schiacciare le compresse di droga e aggiungere la rispettiva quantità nella bottiglia d'acqua, assicurando che ogni topo nella gabbia acquisisca la sua dose giornaliera. Dal momento che la polvere di farmaco può formare sedimenti nella bottiglia, scuotere periodicamente la bottiglia d'acqua per ottenere sospensioni omogenee.</li>
	<li>Cambiare la bottiglia d'acqua ogni settimana con farmaci appena disciolti.</li>
	<li>Raccogliere il sangue tramite vena retroorbitale ogni settimana o ogni 2 settimane dopo l'inizio ART per valutare i cambiamenti nel carico virale e rapporto CD4:CD8.</li>
</ol>9. Eutanasia dei topi, raccolta di organi linfoidi secondari e isolamento di cellule mononucleari
<ol><li>L'eutanasia viene eseguita nei tre modelli murini umanizzati, periodicamente lungo il tempo dell'infezione o alla fine dell'esperimento.</li>
	<li>Eseguire l'eutanasia dei topi adulti mediante asfissiaco2, seguita dalla lussazione cervicale. Per l'asfissia, utilizzare una camera non precaricata, erogare CO2 da un cilindro commerciale con regolatore a pressione fissa e in linea che controlla il flusso di gas entro il 20%-30% del volume della camera/minuto per rispettare le linee guida AVMA 2013.</li>
	<li>Mantenere il flusso di CO2 per >60 s monitoraggio arresto respiratorio (che può richiedere fino a 5 min), seguito dalla lussazione cervicale per assicurare l'eutanasia.</li>
	<li>I neonati eutanasi <7 giorni fa con un metodo fisico (ad esempio, utilizzando forbici affilate).</li>
	<li>Visualizza i linfonodi ascellari, mediastinali e mestenei (che sono tipicamente osservati) ed estrali con una pinzetta e forbici affilate. Estrarre anche la milza, situata nella parte superiore sinistra della cavità peritoneale.</li>
	<li>Depositare i tessuti linfoidi in tubi di centrifuga da 1,5 ml contenenti mezzi RPMI 1640 sterili.</li>
	<li>Immediatamente elaborare i tessuti linfoidi in un colino di dimensioni 70 mm colicella di nylon, raccogliendo le cellule in un tubo da 50 mL. Non aspirare i tessuti.</li>
	<li>Lavare le cellule con 5 mL di RPMI 1640 medio integrato con 1% FBS per facilitare il filtraggio delle cellule.</li>
	<li>Dopo la disaggregazione del tessuto, centrifugare la sospensione delle cellule a 3.500 x g per 10 min in una microcentrifuga.</li>
	<li>Scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule con 500 L di 1x PBS.</li>
	<li>Trasferire le sospensioni delle cellule in un tubo di centrifuga di 1,5 mL contenente 500 -L di mezzo di gradiente di densità sterile.</li>
	<li>Centrifuga a 3.500 x g per 3 min in una microcentrifuga, senza freno, per evitare che il buffy coat si mescoli con il gradiente di densità medio</li>
	<li>Raccogliere con attenzione la frazione di celle mononucleari (tra il gradiente di densità medio e supernatale) e trasferire il pelo di bufala in un tubo di centrifuga di 1,5 mL contenente 500 .L di 1x PBS. Centrifuga a 3.000 x g per 3 min.</li>
	<li>Rimuovere i globuli rossi rimanenti lising con 500 l di Tampone ACK, incubando per 4 minuti a RT.</li>
	<li>Centrifuga a 3.000 x g per 3 min. Scartare il supernatante e ripartire in 1 mL di 1x PBS o medio.</li>
</ol>

<ol><li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).</li>
<li>Koboziev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+humanized+mice+to+study+the+pathogenesis+of+autoimmune+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2F%CE%B3cnull+mouse%3A+An+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Ishikawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+human+blood+and+immune+systems+in+NOD%2FSCID%2FIL2+receptor+%7Bgamma%7D+chain%28null%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice.</a> Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).</li>
<li>Kim, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Mouse+Model+for+the+Study+of+Human+Immunodeficiency+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+research+and+human+retroviruses%22%5BJournal%5D)">A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus.</a> AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).</li>
<li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AML+xenograft+efficiency+is+significantly+improved+in+NOD%2FSCID-IL2RG+mice+constitutively+expressing+human+SCF%2C+GM-CSF+and+IL-3%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3.</a> Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).</li>
<li>Billerbeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+human+CD4%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells+in+human+stem+cell+factor-%2C+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-%2C+and+interleukin-3-expressing+NOD-SCID+IL2R%CE%B3null+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice.</a> Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).</li>
<li>Coughlan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Engraftment+in+Humanized+Mice%3A+Impact+of+Granulocyte-Colony+Stimulating+Factor+Treatment+and+Transgenic+Mouse+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain.</a> Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell-Specific+siRNA+Delivery+Suppresses+HIV-1+Infection+in+Humanized+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice.</a> Cell. 134 (4), 577-586 (2008).</li>
<li>Victor Garcia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+HIV+and+AIDS+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for HIV and AIDS research.</a> Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).</li>
<li>Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cellular+and+tissue+replication+patterns+in+infected+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice.</a> Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).</li>
<li>Satheesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+replication+and+latency+in+a+humanized+NSG+mouse+model+during+suppressive+oral+combinational+ART%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART.</a> Journal of Virology. 92 (7), 2118(2018).</li>
<li>Medina-Moreno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+CDK9+with+indirubin+3%E2%80%99-monoxime+safely+and+durably+reduces+HIV+viremia+in+chronically+infected+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice.</a> PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).</li>
<li>Honeycutt, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+sustain+HIV+replication+in+vivo+independently+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).</li>
<li>Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Replication+in+Humanized+IL-3%2FGM-CSF-Transgenic+NOG+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice.</a> Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).</li>
<li>Akkina, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+and+Limitations+of+Humanized+Mouse+Models+for+HIV+Research%3A+NIH%2FNIAID+%22Meet+the+Experts%22+2015+Workshop+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).</li>
<li>Dudek, T. E., Allen, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-Specific+CD8%2B+T-Cell+Immunity+in+Humanized+Bone+Marrow-Liver-Thymus+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).</li>
<li>Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hitchhiker%27s+guide+to+humanized+mice%3A+new+pathways+to+studying+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections.</a> Immunology. 154, 50-61 (2018).</li>
<li>Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearson%2C+T+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).</li>
<li>Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Immunodeficient+Mice+Bearing+Human+Immune+Systems+by+the+Engraftment+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells.</a> Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).</li>
<li>King, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Hu-PBL+model+for+the+study+of+human+islet+alloreactivity+based+on+NOD-scid+mice+bearing+a+targeted+mutation+in+the+IL-2+receptor+gamma+chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene.</a> Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).</li>
<li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li>
<li>Covassin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+CD4+T+cell-engrafted+non-obese+diabetic-scid+IL2rgamma%28null%29+H2-Ab1+%28tm1Gru%29+Tg+%28human+leucocyte+antigen+D-related+4%29+mice%3A+a+mouse+model+of+human+allogeneic+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+immunology%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease.</a> Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).</li>
<li>Heredia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+mTOR+catalytic+site+inhibits+multiple+steps+of+the+HIV-1+lifecycle+and+suppresses+HIV-1+viremia+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).</li>
<li>Nair, A., Jacob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+practice+guide+for+dose+conversion+between+animals+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+and+Clinical+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">A simple practice guide for dose conversion between animals and human.</a> Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).</li>
<li>Miller, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+parameters+that+affect+human+hematopoietic+cell+outputs+in+mutant+c-kit-immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice.</a> Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).</li>
<li>Murphy, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+differentiation+and+lymphomagenesis+in+the+thymus+of+mice+with+severe+combined+immune+deficiency+%28SCID%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID).</a> Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).</li>
<li>Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoluektova%2C+LY+%22Humanized+Mice+for+HIV+Research%22">Humanized Mice for HIV Research</a>. , Chapter 2 15-24 (2015).</li>
<li>Nakata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+anti-R5+human+immunodeficiency+virus+type+1+effects+of+a+CCR5+antagonist%2C+AK602%2FONO4128%2FGW873140%2C+in+a+novel+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+nonobese+diabetic-SCID%2C+interleukin-2+receptor+gamma-chain-knocked-out+AIDS+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model.</a> Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).</li>
<li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Reporter+Signals%2C+EGFP%2C+and+DsRed%2C+Encoded+in+HIV-1+Facilitate+the+Detection+of+Productively+Infected+Cells+and+Cell-Associated+Viral+Replication+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 280(2012).</li>
<li>Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+engineered+to+express+human+IL-3%2C+GM-CSF+and+Steel+factor+constitutively+mobilize+engrafted+human+progenitors+and+compromise+human+stem+cell+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration.</a> Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).</li>
<li>Cyster, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+stromal+cells+and+lymphocyte+homing+to+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles.</a> Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).</li>
<li>Seung, E., Tager, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+Immunity+in+Humanized+Mice%3A+A+Work+in+Progress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress.</a> Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).</li>
<li>Wahl, A., Victor Garcia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+BLT+humanized+mice+to+investigate+the+immune+reconstitution+of+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+humoral+immune+responses+in+a+novel+HLA-DR-expressing+transgenic+NOD%2FShi-scid%2F%CE%B3c+null+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse.</a> International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+Graft-versus-Host-Disease+in+NOD-scid+IL-2R%CE%B3null+Mice+Display+a+T-Effector+Memory+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype.</a> PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).</li>
<li>Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+improved+humanized+mouse+models+for+human+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases.</a> Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).</li>
<li>Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency%3A+experimental+systems+and+molecular+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">HIV latency: experimental systems and molecular models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM5%CE%B1+Restriction+Affects+Clinical+Outcome+and+Disease+Progression+in+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Rhesus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques.</a> Journal of Virology. 89 (4), 2233(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Importanti progressi sono stati raggiunti nello sviluppo di ceppi di topi immunodeficienti per l'umanizzazione, con una serie di diverse opzioni che possono essere utilizzate in base all'interesse della ricerca1. Fornito qui è un protocollo generale per l'umanizzazione dei topinulli NS -catena-catena e ceppi geneticamente simili da impiegare in tre diversi modelli per studiare l'infezione da HIV. Nel primo approccio sperimentale, i topi appena nati irradiati vengono iniettati con CD34 u...

Il modello murino umorizzato NOD/SCID/interleukin (IL)-2 receptor-chainnull (qui di seguito indicato come huNS-chainnull) è stato ampiamente utilizzato per studiare la patogenesi delle infezioni, l'autoimmunità e il cancro, così come per gli studi preclinici di farmaci e terapie basate su cellule umane1,2. Questi topi sono basati su un background non obeso diabetico (NOD), con la mutazione scid e mutazione mirata al locus a catena del recettore IL-2 (comune catena z per IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), che provocano una grave compromissione nello sviluppo delle cellule T-, B-, naturali e (NK killer)1. Così, essi sostengono l'innesto di tessuto umano, il CD34 umano- cellule staminali ematopoietiche (HSC) e le cellule mononucleari periferiche umane (PBMC)3,4,5. Inoltre, l'espressione transgenica di fattori ematopoietici umani, come il fattore delle cellule staminali (SCF), il fattore di stimolazione della colonia di granulociti/macrofasi (GM-CSF) e IL-3 promuove l'innesto delle popolazioni mieloidi umane6,7,8.
Per gli studi sull'HIV, sono stati descritti diversi modelli di toponull huNS a catena, che differiscono nel ceppo del topo, nel tipo di cellule umane utilizzate, nel tipo di tessuti per l'innesto e nell'origine delle cellule (cioè sane vs. donatore infetto dall'HIV)9,10. Il ceppo originale, tuttavia, è ampiamente utilizzato a causa degli alti livelli di innesto di cellule umane e della replicazione virale a seguito di infezione con un ceppo HIV di riferimento11,12,13. Ceppi di topi immunodeficienti simili con espressione transgenica di fattori ematopoietici umani (ad es. NOG-EXL o NSG-SGM3) o con impianti di fegato e timo umano (topogonico osseo-fegato-fegato [BLT]) sono utili per valutare il ruolo delle popolazioni mieloidi nella risposta immunitaria anti-HIV, gli effetti dell'HIV su questi tessuti e la loro partecipazione come serbatoi virali14,15. Inoltre, alcuni ceppi con espressione transgenica di molecole di antigene leucocito umano (HLA), così come topi BLT, possono essere utilizzati per studiare la risposta delle cellule T all'infezione da HIV16,17.
In generale, in questi topi, l'umanizzazione dipende dall'origine cellulare, dal percorso di consegna (intraperitonetale, intraepatico, endovenoso, intracardiaco) e dall'età del topo al momento dell'innesto18,19,20. Per quanto riguarda l'origine cellulare, l'uomo CD34- HSC derivato dal sangue cordonale, dal fegato fetale o dal sangue periferico mobilitato può essere iniettato nei neonati o nei giovani topi3,21. Inoltre, i topinulli adulti a catena possono essere umanizzati con l'iniezione di PBMC (qui, indicati come hu-PBL-NS-catena zz), permettendo la circolazione temporale di queste cellule nel sangue, organi linfoidi secondari e tessuti infiammati22,23,24.
Descritto qui è un protocollo dettagliato per la creazione di modelli di toponull huNS -catena per lo studio dell'infezione da HIV. Il primo è il modello cronico, in cui i CD34umani - HSC derivati dal sangue cordonale da un donatore sano vengono iniettati nei topi neonati, seguito da infezione con un ceppo HIV di riferimento dopo 14 settimane di ricostituzione del sistema immunitario umano. Questo modello permette il monitoraggio dei topi fino a 36 settimane dopo l'infezione. Il secondo modello è un modello acuto, in cui i PbMC derivati da un donatore sano vengono iniettati in topinull adulti NS , seguiti da infezione con un ceppo HIV di riferimento dopo 3 settimane di espansione delle cellule T umane nel topo. Infine, il terzo modello è il modello di riattivazione, in cui i PMC derivati da un donatore infetto dall'HIV sottoposto a terapia antiretrovirale soppressiva (ART) vengono iniettati nei topinulli adulti NS - catena. In questo caso, un ambiente privo di farmaci consente la riattivazione virale e l'aumento del carico virale. Questi due ultimi modelli consentono il monitoraggio fino a 9 settimane dopo l'innesto.
Nel complesso, questi tre modelli sono utili per studi virologici, studi preclinici su nuovi farmaci e valutazione degli effetti dell'infezione da HIV sulla risposta immunitaria globale. È inoltre importante considerare che l'uso di topi umanizzati affetti da HIV richiede la revisione e l'approvazione da parte del Comitato di Biosicurezza Istituzionale (IBC) e dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) prima di qualsiasi esperimento. Ciò garantisce che lo studio segua tutte le normative istituzionali interne ed esterne per l'uso di materiale biologico pericoloso e la manipolazione umana di animali sperimentali.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga da 0,5 ml</td><td>Neptune</td><td>3735.S.X</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Provette per microcentrifuga</td><td>Neptune</td><td>3745.S.X</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 10 ml</td><td>sceintifico stellare</td><td>VL-4090-0010</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 ml</td><td>Stellar scientific</td><td>T15-600</td><td></td></tr><tr><td>Pipete sierologiche da 25 ml</td><td>sceintifico stellare</td><td>VL-4090-0025</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipete sierologiche</td><td>stellare sceintific</td><td>VL-4090-0005</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>Stellar scientific</td><td>T50-600</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampone di lisi</td><td>Biologico di qualità</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol</td><td>Fisher scientific</td><td>06-669-62</td><td>Clone</td></tr><tr><td>sterile anti-umano CD3 UCHT1</td><td>Biolegend</td><td>300439</td><td>APC clone</td></tr><tr><td>CD4 anti-umano coniugato OKT4</td><td>Biolegend</td><td>317420</td><td>AF488</td></tr><tr><td>clone CD45 anti-umano coniugato 2D1</td><td>Biolegend</td><td>368522</td><td>BV421</td></tr><tr><td>clone CD8 anti-umano coniugato SK1</td><td>Biolegend</td><td>344710</td><td>PerCP-Cy5.5 armadio</td></tr><tr><td>biosicuro coniugato livello 2</td><td></td><td></td><td>Se possibile collegato a un camino exauste durante la manipolazione dell'isoflurano</td></tr><tr><td>Bonnet</td><td>Fisher scientific</td><td>17-100-900</td><td>Tappo monouso per protezione di base</td></tr><tr><td>Cavicida</td><td>Metrex</td><td>13-1000</td><td>Disinfezione di superficie</td></tr><tr><td>CD34+ cellule</td><td>Lonza</td><td>2C-101</td><td>Tante fiale disponibili da un singolo donatore</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman</td><td>65-6KR</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo trasparente</td><td>Amazon</td><td>77977</td><td></td></tr><tr><td>Garza di</td> <td>cotoneFisher scientific</td><td>22-415-468</td><td>Camici da</td></tr><tr><td>laboratorio monouso</td> sterili <td>Fisher scientific</td><td>19-472-422</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette EDTA</td><td>Greiner bio-one</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Maschera facciale</td><td>Fisher scientific</td><td>17-100-897</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di lisi FACS</td><td>BD</td><td>340202</td><td></td></tr><tr><td>FBS premium HI</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S1115OH</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE health one</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Citometro</td><td></td><td></td><td>a flusso Abbiamo utilizzato provette per citometria a flusso FACS Aria II</td></tr><tr><td></td><td>Falcon</td><td>352054</td><td>5 ml di polistirene e fondo tondo</td></tr><tr><td>HIV BaL</td><td></td><td></td><td>Preparato nella nostra struttura principale uQUANT</td></tr><tr><td>PBMC umani Volontari</td><td></td><td></td><td>HIV positivi e negativi</td></tr><tr><td>Infrarossi cuscinetto riscaldante</td><td>Venet scientific</td><td>DCT-25</td><td>Cuscinetto riscaldante terapeutico temporaneo per piccoli animali</td></tr><tr><td>Isentress (Raltegravir)</td><td>Merck</td><td>NSC 0006-0227061</td><td>Farmaco antiretrovirale per il trattamento del virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-Inibitore dell'integrasi</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Irradiatore</td><td></td><td></td> Mark I <td>Apparecchiatura appartenente all'università di Maryland</td></tr><tr><td>Micro pipette Microcentrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marchi auricolari per topi</td><td>National Band & Tag azienda</td><td>1005-1L1</td><td></td></tr><tr><td>Natelson provette per prelievo di sangue</td><td>Fisher scientific</td><td>02-668-10</td><td></td></tr><tr><td>NOG-EXL</td><td>Taconic</td><td>HSCFTL-13395-F</td><td></td></tr><tr><td>NSG topi</td><td>Jackson</td><td>5557</td><td>Tempo femmine gravide per attecchimento CD34 e Giovani per attecchimento PBMC</td></tr><tr><td>NSG-SGM3</td><td>Jackson</td><td>13062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide 16%</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>100-10-023</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-28</td><td></td></tr><tr><td>Macchina Quantistudio qPCR</td><td>Thermo</td><td>QS3</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di reagenti</td><td>Costar</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>RPMI media 1640 1X</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Scarpa copre</td><td>Fisher scientific</td><td>17-100-911</td><td></td></tr><tr><td>Guanti sterili monouso Microflex</td><td></td><td>SUF-524</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Sintesi del primo filamento SuperMix</td><td>Invitrogen</td><td>10080-400</td><td>Sintesi del cDNA</td></tr><tr><td>Siringhe 28-G x 1/2</td><td>BD</td><td>329-461</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe 29-G x 1/2</td><td>BD</td><td>324-702</td><td></td></tr><tr><td>Truvada (Emtricitabina e Tenofovir</td><td>Gilead</td><td>NDC 61958-0701-1</td><td>Farmaco antiretrovirale per il trattamento del virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-Inibitore analogo-della trascrittasi del nicleoside</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Conta cellulare e vitalità</td></tr><tr><td>Vick Vaporub</td><td>School health</td><td>43214</td><td>Unguento a base di mentolo ed eucalipto</td></tr><tr><td>Grado di biologia molecolare dell'acqua Biologico</td><td>di qualità</td><td>351-029-131</td><td></td></tr></tbody></table>

infezione da hiv cronica, acuta e riattivata in modelli di topo immunodeficienti umanizzati

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

I topinulli umanizzati NOD/SCID/IL-2 ricapitolano alcune caratteristiche dell'immunità umana, che possono essere sfruttate nella ricerca di base e pre-clinica sulle malattie infettive. Qui sono descritti tre modelli di topi immunodeficienti umanizzati per studiare la dinamica dell'infezione da HIV. Il primo si basa sull'iniezione intraepatica di CD34- cellule staminali ematopoietiche nei topi neonati, che consente la ricostituzione di diverse cellule confinate nel sangue e nel linfoide, seguita da infezione con un ceppo HIV di riferimento. Questo modello consente il monitoraggio fino a 36 settimane dopo l'infezione ed è quindi chiamato il modello cronico. Il secondo e il terzo modello sono indicati come modelli acuti e di riattivazione, in cui le cellule mononucleari del sangue periferico vengono iniettate intraperitonealmente nei topi adulti. Nel modello acuto, le cellule di un donatore sano vengono innestate attraverso il percorso intraperitoneale, seguito da infezione con un ceppo HIV di riferimento. Infine, nel modello di riattivazione, le cellule di un donatore infetto dall'HIV sottoposto a terapia antiretrovirale vengono innestate attraverso il percorso intraperitoneale. In questo caso, un ambiente privo di farmaci nel mouse consente la riattivazione del virus e un aumento del carico virale. I protocolli qui forniti descrivono l'approccio sperimentale convenzionale per i modelli murini umanizzati e immunodeficienti dell'infezione da HIV.

Come descritto in precedenza, a 14 settimane dopo l'iniezione HSC (modello cronico) o a 3 settimane dopo l'iniezione pb-POMC (modelli acuti e di riattivazione), i topi vengono dissanguati per lo screening del livello di innesto di cellule umane mediante citometria di flusso. Nella figura 1Aè riportata una strategia rappresentativa di gating per la valutazione di 1) CD45 umano- la ricostituzione delle cellule e 2) di CD4e le celluleT. Tipicame...

Qui sono descritti tre approcci sperimentali per studiare la dinamica dell'infezione da HIV nei topi umanizzati. Il primo consente lo studio di eventi di infezione cronica, mentre i due ultimi consentono lo studio di eventi acuti dopo l'infezione primaria o la riattivazione virale.

Infezione da HIV cronica, acuta e riattivata in modelli di topo immunodeficienti umanizzati

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...

Questa procedura descrive tre modelli di topi immunodifesa umanizzati per lo studio della dinamica dell'infezione da HIV. I topi umanizzati NSG ricapitolano sulle caratteristiche dell'immunità umana. In questo caso, consentendo lo studio dell'infezione cronica, acuta e riattivata dell'HIV in contesti precli clinici.A dimostrare la procedura di preparazione cellulare sarà Sandra Medina-Moreno, supervisore della ricerca di laboratorio del nostro gruppo. Quando si esegue questa procedura, utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale usa e getta tra cui scrub sterili, guanti, scarpe dedicate, copriscarpe, maschera, occhiali, cofani per capelli e barba e un camice da laboratorio sterile. Per il modello cronico, resuspend un milione di cellule staminali umane CD34+ congelate in 10 millilitri di supporti RPMI 1640 con 10%FBS in un armadio di biosicurezza certificato e mantenere condizioni sterili.Utilizzare 10 microlitri della sospensione per contare e controllare la vitalità cellulare mediante la colorazione di esclusione Di Trypan Blue in un emocitometro. Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per 15 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 1X PBS freddo alla concentrazione richiesta.Tenere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione. Strofina la biancheria da letto pulita tra le mani per mascherare qualsiasi altro odore estraneo sui cuccioli riceventi. Quindi metti i cuccioli in una piastra di Petri sterile di 100 millimetri quadrati insieme a una piccola quantità di materiale da letto dalla gabbia dell'allevatore.Mettere la piastra di Petri in una gabbia di trasporto pulita e quindi posizionare la gabbia in una gabbia di trasporto carboy per proteggere i cuccioli dalla luce diretta e dal rumore. Coprire la gabbia di trasporto con un tampone di copertura per evitare l'esposizione di animali all'ambiente durante il transito verso la sala di irradiazione. Dopo l'anestesia come descritto nel protocollo di testo, prepararsi per l'innesto tramite iniezione epatica.Per ridurre al minimo il tempo di ritenuta del topo, lasciare che uno sperimentatore carichi la siringa con la sospensione delle cellule staminali e che il secondo investigatore tenga il cucciolo e somministra l'iniezione. Caricare 50 microlitri della sospensione delle cellule staminali umane CD34+ nella siringa con un ago attaccato sotto l'armadio di biosicurezza certificato. Trattenere i cuccioli con le dita del pollice e dell'indice e pulire il sito di iniezione con il 70% di alcol.Utilizzare un angolo di ago poco profondo per fornire 50 microlitri di cellule direttamente nel fegato in modo da non perforare completamente il fegato. Prewarm il piatto utilizzando un tampone riscaldante a infrarossi per roditori a 20 gradi Celsius per garantire che i cuccioli non siano troppo riscaldati. Posizionare i cuccioli sulla piastra di Petri ricoperta di garza sterile per uno o cinque minuti per consentire il recupero.Immediatamente prima di restituire i cuccioli ai loro genitori, applicare una piccola quantità di mentolo e unguento a base di eucalipto usando il pollice e le dita indice sul muso di entrambi i genitori per evitare cannibalismo o rifiuto dei cuccioli. Controlla le gabbie ogni giorno, alla ricerca di eventuali segni di innesto rispetto alla malattia dell'ospite nei cuccioli come pelle secca, nessuna alimentazione, eruzione cutanea o alopecia. Svezza i cuccioli a tre settimane di età e ospitali in gabbie diverse.Verificare l'innesto nel sangue periferico mediante citometria a flusso a 14 settimane di età. Viene mostrata una strategia rappresentativa per la valutazione della ricostruzione umana delle cellule CD45+ e della percentuale di cellule CD4+ e CD8+T. Il tasso di successo dell'innesto è compreso tra l'80% e il 100%Utilizzare cellule mononucleari del sangue periferico umano derivate da un donatore sano per il modello acuto o da un paziente infetto da HIV che era sotto terapia antiretrovirale per il modello di riattivazione.Strato 15 millilitri di sangue intero in cinque millilitri di mezzo gradiente di densità sterile in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifuga a 400 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente senza pause per evitare che il mantello buffy si mescola con il mezzo gradiente di densità. Raccogliere con cura la frazione di cellule mononucleari tra il mezzo gradiente di densità e il supernatante.Trasferire il mantello buffy su un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente 10 millilitri di 1X PBS. Centrifugare a 300 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e rimuovere i restanti globuli rossi lisciviando con cinque millilitri di tampone di lisi ACK aggiunti alle cellule pellettate.Incubare per quattro minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato di nuovo come prima, scartare il supernatante e resuspend in 10 millilitri di 1X PBS o RPMI 1640 medium. Utilizzare 10 microlitri della sospensione cellulare per contare le cellule e verificare la vitalità della colorazione di esclusione Trypan Blue in un emocitometro.In genere, da uno a due milioni di cellule sono ottenute per ogni millilitro di sangue con una vitalità superiore al 95%. Dopo la centrifugazione come prima, scartare il supernatante e regolare il numero di cella alla concentrazione richiesta. Caricare 3,5 milioni di cellule mononucleari del sangue periferico in 200 microlitri di 1X PBS in una siringa con un ago attaccato sotto un armadietto di biosicurezza certificato.Rimuovere il mouse dalla gabbia e tenerlo per la coda in modo che possa afferrare la rete applicando una leggera trazione all'indietro. Quindi posizionare l'indice e il pollice sulle spalle dell'animale afferrando la pelle sciolta del collo e usando il dito medio per stabilizzare la schiena. Far scorrere la testa del mouse all'indietro in modo che la schiena sia sopra la testa.Ciò consente di spostare i visceri nella cavità addominale all'indietro e riduce il rischio di foratura degli organi interni durante l'iniezione. Pulire il sito di iniezione con il 70% di alcol. Penetrare la siringa preparata attraverso la parete addominale e aspirare prima di iniettare le cellule.Se un materiale è aspirato, rimuovere la siringa e scartarla. Altrimenti, iniettare lentamente le cellule nella cavità intraperitoneale prima di rimuovere la siringa e scartarla. Riportare l'animale nella sua gabbia e verificare l'innesto nel sangue periferico mediante citometria a flusso a tre settimane dopo l'iniezione.Identificare i topi con l'etichetta auricolare. Osservare attentamente i topi utilizzati in questi esperimenti, due volte al giorno dopo ogni procedura per i segni clinici di angoscia. Quindi procedere all'iniezione di HIV come descritto nel protocollo di testo.Dopo l'iniezione di HIV, c'è un rapido aumento della carica virale plasmatica che di solito è rilevabile dopo due o tre settimane dopo l'infezione sia nei modelli cronici che in quello acuto con cinetica simile nel modello di riattivazione. L'aumento della carica virale coincide con una diminuzione del rapporto CD4:CD8. Questi cambiamenti non si osservano nei topi di controllo.Si noti che, nel modello di mouse adulto PBMC NSG umanizzato, viene osservata e ricostituita un'inversione iniziale del rapporto CD4:CD8 lungo il tempo di monitoraggio. Quando la terapia antiretrovirale viene somministrata ai topi infetti da HIV, si è verificata una soppressione della carica virale e il recupero nel rapporto CD4:CD8, come previsto, raggiungendo livelli simili a quelli dei controlli non infetti. Tipicamente, dopo due o tre settimane di trattamento, si osserva una diminuzione della carica virale e un aumento del rapporto CD4:CD8 nei modelli cronici, acuti e di riattivazione.Utilizzare la dose di irradiazione raccomandata per evitare il sovradosaggio letale o il rigetto delle cellule trapiantate. Non perforare completamente il fegato durante l'iniezione e utilizzare biancheria da letto per mascherare gli odori che la diga percepirà come estranei. Questi tre modelli consentono di testare composti antivirali, anticorpi anti-HIV o altre sostanze biologiche che influenzano la replicazione virale.Inoltre, consentono esperimenti di trasferimento adattivo per l'immunoterapia hiv. I topi umanizzati NSG possono essere ricostituiti parzialmente o per intero con cellule umane per rispondere a patogeni o farmaci, imitando la complessità del sistema immunitario umano. Tutte le misure biologiche di base devono essere rigorosamente seguite poiché i topi umanizzati NSG possono essere infettati da agenti patogeni murini e umani, in particolare in questo caso che utilizza la manipolazione del virus HIV.

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