Name: Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Scopri come valutare l'attività di NF-kappa-B e AP-1 in macrofagi reporter su superfici polimeriche con adsorbimento proteico. Questo metodo semplice analizza i supernatanti di coltura tramite saggio enzimatico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori riconoscono con gratitudine il finanziamento operativo del Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), del Queen's University Senate Advisory Research Committee e del sostegno alle infrastrutture della Canadian Foundation for Innovation John Evan's Leadership Fund (Project 34137) e del Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Progetto 34137). L.A.M. è stato sostenuto da una Queen's University R. Samuel McLaughlin Fellowship, da un Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada Canadian Graduate Scholarship Master's Award e da una borsa di studio Ontario Graduate. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Myron Szewczuk per il suo generoso dono della linea cellulare macrofagio reporter NF-B/AP-1 e i dottori Michael Blennerhassett e Sandra Lourenssen per l'uso del loro sistema di imaging gel e lettore di placche.

1. Preparazione dei supporti e dei reagenti
<ol><li>Preparare i supporti fibroblasti. Unire 450 mL di Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), 50 mL di siero bovino fetale (FBS) e 5 mL di penicillina/streptomicina. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.</li>
	<li>Preparare i media di crescita del macrofago reporter in aliquote da 50 mL. Unire 45 mL di DMEM, 5 mL di FBS, 5 reagente di eliminazione del micoplasma/mL(Tabella dei materiali) e 200 fleomycin D1 (Tabella dei materiali). Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.</li>
	<li>Preparare reporter macrophage saggio media in 50 mL aliquots. Unire 45 mL di DMEM, 5 mL di FBS inattivato dal calore (HI-FBS), 5 reagenti a eliminazione del micoplasma e 200 fleomycin D1. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.</li>
</ol>2. Rivestimento colture cellulari con poli (methacritame metileto)
<ol><li>Sciogliere il poli(methacritame metillare) (PMMA) in cloroformio a 20 mg/mL (ad esempio, 100 mg di PMMA in 5 mL di cloroformio) in una fiala di scintillazione di vetro da 20 mL. Mettere una barra magnetica di agitazione nella fiala e lasciare mescolare per almeno 2 h, fino a quando tutti i solidi sono sciolti. ATTENZIONE: Il cloroformio è dannoso se inalato. Assicurarsi di utilizzare il solvente in un cappuccio fumi mentre si indossano guanti PVA.</li>
	<li>Pipette 400 -L di PMMA al centro di un vescopio di vetro borosilicato in un rivestimento di spin, e girare a 3000 rpm per 2 min. Preparare il numero di vetrini necessari per il saggio, così come 3-5 extra per la misurazione dell'angolo di contatto con l'acqua. Conservare i vetrini in una scatola pulita (spruzzata e pulita con 70% di etanolo) per un uso futuro. NOT:</</c0> Il rivestimento a rotazione viene spesso utilizzato per depositare un rivestimento sottile e uniforme su una superficie piana. Un rivestimento di spin ruota un substrato ad alta velocità, utilizzando la forza centrifuga per diffondere la soluzione di rivestimento sulla superficie.<ol>
<li>Misurare l'angolo di contatto dell'acqua in due posizioni casuali sulla superficie di vetrini rivestiti extra (cioè, non i vetrini utilizzati per la coltura cellulare) con un goniometro per garantire che la superficie del vetro fosse completamente rivestita con il polimero. NOT:</</c2> Solo l'acqua di altissima purezza (ad esempio, il triplo vetro distillato) deve essere utilizzata per le misurazioni dell'angolo di contatto con l'acqua.</li>
	</ol></li>
	<li>In un armadietto di sicurezza biologica (BSC) fissare pozzi appiccicosi a 8 camere a vetrini rivestiti PMMA utilizzando pinze sterili e seguendo la tecnica austica. Premere saldamente sulla parte superiore dei pozze appiccicose per assicurarsi che siano fortemente attaccati. Incubare i vetrini con pozzi appiccicosi attaccati a 37 gradi durante la notte per fissare la guarnigioni.<ol>
<li>Testare il sigillo dei pozzi appiccicosi aggiungendo 200 l una l di acqua di grado di coltura cellulare (senza endotossina) ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 60 min e garantire nessuna perdita prima di procedere. Aspirare l'acqua, facendo attenzione a non disturbare il rivestimento PMMA.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire i fusti d'acqua senza endotossina aggiungendo 300 l di acqua endotossina a ogni pozzo e incubando per 1 h (tre volte), 12 h e 24 h prima di essere utilizzato per rimuovere qualsiasi solvente rimanente.</li>
	<li>Testare la concentrazione di endotossina dei vetrini da utilizzare per la coltura cellulare. Incubare 200 -L di acqua reagente senza endotossina (Tabella dei materiali) in un pozzo di ogni diapositiva per 1 h. Misurare la concentrazione di endotossina nell'estratto utilizzando un'onda endotogena endotossina finale ( Tabella deimateriali). NOT:</</c2> Il seguente protocollo è specifico del kit di analisi dell'endotossina elencato nella Tabella dei Materiali.</li>
	<li>Utilizzare solo acqua e materiali di consumo (ad esempio, punte di pipette, tubi di microcentrifuga e piastre di pozzi) certificati senza pirogeni (cioè privi di endotossina) per questo lavoro. Inoltre, qualsiasi vetro utilizzato nella preparazione delle superfici rivestite di polimeri deve essere depyrogenated utilizzando la sterilizzazione del calore secco (250 gradi centigradi per 30 min) prima di utilizzare10. Misurare l'endotossina nella soluzione di estratto, come descritto qui, può provocare una sottovalutazione dell'endotossina sulla superficie del materiale11,12. Di conseguenza, quando si sviluppa un protocollo di rivestimento polimerico, eseguire la reazione di analisi endotossina (cioè, i passaggi 2.5.4.5.5.6 per i campioni di prova [controlli di reagente acqua] o picco) direttamente all'interno di pozzi contenenti il campione rivestito per garantire che nessuna fonte di endotossina venga introdotta inavvertitamente nel sistema durante il processo di rivestimento.<ol>
<li>Portare tutti i campioni di prova (ad esempio, estratti) e i reagenti di analisi dell'endotossina in RT. Ricostituire il reagente cromogenico nel buffer di analisi e nello standard di endotossina nell'acqua di reagente, lasciare sciogliere per 5 min e vortice delicatamente prima dell'uso. Coprire tutte le bottiglie con pellicola di paraffina quando non è in uso.</li>
		<li>Creare una curva di diluizione standard da 5-8 punti dello standard di endotossina che va dal limite inferiore a quello superiore dell'aspetto eseguendo una diluizione seriale dello standard di endotossina nell'acqua reagente.</li>
		<li>Per controllare il miglioramento o l'inibizione del saggio di endotossina nei campioni di prova, preparare un controllo positivo (chiamato anche controllo del picco o campione a spillo) diluindo una quantità nota di endotossina nella soluzione campione di prova inutilizzata. NOT:</</c5> La concentrazione del controllo positivo dovrebbe essere la stessa concentrazione di una norma al centro della curva standard. Se la quantità recuperata del picco di endotossina (cioè la concentrazione del controllo positivo meno la concentrazione del campione di prova non sgualcito) è entro il 50-200% della concentrazione nominale del picco di endotossina, la soluzione di estrazione può essere considerata non interferire in modo significativo con il test.</li>
		<li>Aggiungete 50 -L di standard, campioni o comandi di picco a ogni pozzetto di una piastra di 96 pozzetto o triplicare. Utilizzare l'acqua reagente come controllo negativo.</li>
		<li>Aggiungete 50 l di reagente cromogenico ad ogni pozzo. Aggiungere rapidamente il reagente a tutti i pozzi. Utilizzare un timer per registrare la quantità di tempo necessaria per aggiungere il reagente a tutti i pozzetti. Coprire la piastra con una guarnizione adesiva e incubare a 37 gradi centigradi (il tempo di incubazione è dipendente dal lotto e indicato sul Certificato di Analisi incluso nel kit di reagente cromogenico). In alternativa, controllare sulla piastra ogni 15 min durante l'incubazione fino a quando il cambiamento di colore è osservato in tutti i pozzi standard.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, aggiungere 25 luna del 50% di acido acetico ad ogni pozzo (concentrazione finale di 10% di acido acetico per pozzo) per fermare la reazione. Aggiungere l'acido acetico nello stesso ordine in cui è stato aggiunto il reagente cromogenico. Leggere l'assorbimento della piastra utilizzando un lettore di lamiere a 405 nm. Liquido aspirato e piastra di scarto. NOT:</</c6> L'aggiunta di acido acetico dovrebbe richiedere lo stesso periodo di tempo per aggiungere ad ogni bene come il reagente cromogenico ha preso (30 s).</li>
	</ol></li>
	<li>L'ultravioletto (UV) sterilizza i vetrini per 30 minuti prima degli esperimenti di coltura cellulare.</li>
</ol>3. Rivestimento colture cellulari con polidimetilsiloxane
<ol><li>Mescolare l'elastomer ovulo polidimetilsixane (PDMS) in un rapporto di peso 10:1 (agente base:stagionatura). In un armadietto di sicurezza biologica, pipetta circa 10 mL di base polidimetilsiloxana in un tubo sterile. Pesare il tubo e aggiungere lentamente l'agente di polimerità fino a quando non è stato aggiunto il 10%. ATTENZIONE: Utilizzare i reagenti PDMS in un'area ben ventilata ed evitare il contatto visivo indossando occhiali di sicurezza.</li>
	<li>Mescolare accuratamente l'elastomermescolando con una punta di pipetta sierologica sterile e pipettando su e giù. Aggiungere circa 200 l della soluzione ad ogni pozzetto di una piastra di 48 pozze. Inclinare lentamente la piastra del pozzo per garantire una copertura completa dei pozzi con soluzione elastomer.</li>
	<li>Mettere la piastra del pozzo con elastomero in un forno a vuoto a 50 cmHg, 40 gradi centigradi. Rimuovere il coperchio e coprire con una pulizia a singolo soecco per evitare che altri detriti cadano nei pozze. Lasciare incubare per almeno 48 h.<ol>
<li>Verificare che i pozzi siano completamente rivestiti tramite ispezione visiva. Assicurarsi che l'elastomer sia completamente guarito spingendo delicatamente con una punta sterile pipetta prima di rimuovere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 300 l di 70% di etanolo (realizzato con etanolo assoluto e acqua priva di endotossina) e incubare a RT per 1 h. Rimuovere l'etanolo ed eseguire fuorti d'acqua senza endotossina aggiungendo 300 l of endotoxin-free a ogni pozzo e incubando per 1 h (tre volte), 12 h , e 24 h prima dell'uso per rimuovere il solvente rimanente.<ol>
<li>Incubare 200 L di acqua endotossina senza tre pozze di ogni piastra per 1 h. Misurare la concentrazione di endotossina degli estratti d'acqua utilizzando un'anedi endotossina cromogenica del punto finale (passaggi 2.5.1.2.5.6).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Superfici di coltura delle cellule di rivestimento con polifluurato (tetrafluoroetilene)
<ol><li>Fare una soluzione da 1 mg/mL di poli fluorurato (tetrafluoroetilene) (fPTFE) (ad esempio, aggiungere 10 mg di fPTFE a 10 mL di solvente fluorurato [Tabella dei materiali]) in una fiala di scintillazione di vetro da 20 mL. Mettere una barra magnetica di agitazione nella fiala e lasciare mescolare per almeno 24 h, fino a quando tutti i solidi sono sciolti.</li>
	<li>Aggiungere circa 150 l della soluzione polimerica ad ogni pozzo di una piastra di polistirolo 48 pozze (cioè, non coltura tissutale trattata). Inclinare lentamente la piastra del pozzo per garantire una copertura completa di tutti i pozzi con soluzione polimerica. Sostituire il coperchio.<ol>
<li>Per garantire un efficace rivestimento fPTFE dei pozzi, i rivestimenti in vetro devono essere rivestiti in fPTFE e utilizzati per la misurazione dell'angolo di contatto con l'acqua (passaggio 4.3.1). Posizionare i copricapi all'interno dei pozze di una piastra di 24 pozze. Aggiungere circa 400 l della soluzione polimerica ad ogni pozzo contenente un coperchio. Spingere i copricopertine verso il basso con pinze sterili, assicurandosi che siano completamente coperte in soluzione polimerica, e coprire la piastra del pozzo con un coperchio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collocare la piastra del pozzo con soluzione polimerica e/o copricapi in un forno a vuoto impostato a 50 cmHg, 40 gradi centigradi. Rimuovere il coperchio e coprire con una pulizia a singolo soecco per evitare che altri detriti cadano nei pozze. Lasciare incubare per almeno 48 h.<ol>
<li>Misurare l'angolo di contatto con l'acqua dei coprilabbra rivestiti in fPTFE con un goniometro per garantire un rivestimento efficace. NOT:</</c3> Solo l'acqua di altissima purezza (ad esempio, il triplo vetro distillato) deve essere utilizzata per le misurazioni dell'angolo di contatto con l'acqua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 300 l di 70% di etanolo (realizzato con etanolo assoluto e acqua priva di endotossina) e incubare a RT per 1 h. Rimuovere l'etanolo ed eseguire fuorti d'acqua senza endotossina aggiungendo 300 l of endotoxin-free a ogni pozzo e incubando per 1 h (tre volte), 12 h , e 24 h prima dell'uso per rimuovere il solvente rimanente.<ol>
<li>Incubare 200 L di acqua endotossina senza tre pozze di ogni piastra per 1 h. Misurare la concentrazione di endotossina di estratti d'acqua utilizzando un'anesay endotossina cromogenica del punto finale (passaggi 2.5.1.2.5.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>UV sterilizzare le piastre di pozzo per 30 min prima di esperimenti di coltura cellulare.</li>
</ol>5. Fare Lysate da 3T3 cellule
<ol><li>Far crescere 3T3 cellule in più flaconi T150 fino al 70% di confluenza. Per staccare le cellule, supporti aspirati, lavare la superficie con 5 mL di PBS e PBS aspirato. Aggiungere 5 mL di enzima di dissociazione cellulare ricombinante privo di origine animale (Tabella dei materiali) e incubare a 37 gradi centigradi per 3 o 5 min.</li>
	<li>Staccare le cellule inclinando delicatamente il pallone avanti e indietro. Aggiungere 5 mL di PBS per neutralizzare l'enzima ricombinante utilizzato per la dissociazione cellulare. Trasferire le cellule staccate dai flaconi in un tubo di centrifuga e mescolare tramite pipettaggio. Eseguire un conteggio delle cellule vive utilizzando un emocitometro e un tinrio di vitalità cellulare. NOT:</</c1> È stato selezionato un enzima di dissociazione cellulare che può essere neutralizzato attraverso la diluizione in PBS per evitare l'introduzione di proteine a base di siero nella preparazione del lisone. Se la trypsin viene utilizzata per dissociare le cellule, deve essere neutralizzata con una soluzione contenente siero e deve essere eseguito un ulteriore lavaggio PBS per ridurre la quantità di proteine del siero trasportate nella preparazione del lisato.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min. Aspirate the supernatant and resuspend cells in original volume (es, 10 mL x number of flasks) of PBS to wash off any remaining media. Ripetere.</li>
	<li>Centrifugare nuovamente le cellule a 200 x g per 5 min e aspirare il supernatante. Aggiungere il volume di PBS necessario per ottenere una concentrazione cellulare finale di 1 x 106 cellule / mL. Collocare la soluzione cellulare in un congelatore a -80 gradi centigradi fino a quando il campione non è completamente congelato (almeno 2 h).</li>
	<li>Scongelare la soluzione cellulare in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Una volta completamente scongelato, riporre la soluzione nel congelatore -80 gradi fino a congelare completamente. Ripetere l'operazione per un totale di 3 cicli di congelamento-scongelamento.</li>
	<li>Eseguire un'analisi micro dell'acido bicinchoninico (BCA) sul lisa cellulare a una varietà di diluizioni (ad esempio, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) per determinare la concentrazione proteica. Diluire il lisa toeto cellulare a una concentrazione proteica di 468,75 g/mL, e conservare a -80 gradi centigradi per un uso futuro. NOT:</</c5> La concentrazione finale di proteine in una piastra di 48 pozzetto è 125 g/cm2 (basata sulla superficie di un pozzo, 0,75 cm2).</li>
	<li>Eseguire una macchia occidentale per valutare la presenza di DAPP nel lysato (ad esempio, proteina da urto termico 60 [HSP60], scatola di gruppo ad alta mobilità 1 [HMGB1]) caricando 40-60 g di proteine di lisfatto nel buffer di carico su un gel di poliacilofo 10% di spessore 10% e seguire la macchia occidentale standard Procedure.</li>
</ol>6. Valutazione dell'effetto degli strati proteici adsorbiti e dei ricettivi simili alle attività nF-B dei Macrofagi
 NOT:</</c0> Per uno schema del flusso di lavoro sperimentale e del layout della piastra, fare riferimento rispettivamente alle figure 1A e alla figura supplementare 1.
<ol><li>Coltiva i macrofagi dei reporter in una fiaschetta di dimensioni adeguate al 70% di confluenza. Aspirate supporti, superficie di lavaggio con PBS, e PBS aspirato. Aggiungere l'enzima di dissociazione cellulare ricombinante e incubare a 37 gradi centigradi per 8 min.</li>
	<li>Staccare le cellule toccando saldamente i lati del pallone. Inattivare l'enzima di dissociazione cellulare ricombinante aggiungendo un volume uguale di supporti di crescita (contenente 10% FBS). Eseguire un conteggio delle cellule vive utilizzando un emocitometro e un tinrio di vitalità cellulare. NOT:</</c0> La vitalità prevista per i macrofagi reporter dopo un'incubazione di 8 min nell'enzima di dissociazione cellulare è del 90%.</li>
	<li>Centrifuga cellule a 200 x g per 5 min. Aspirate supernatante e risospensione nel volume originale di PBS per lavare le cellule. Centrifuga di nuovo e risospendere le cellule a 7,3 x 105 cellule / mL nel supporto di saggio (contenente calore inattivato FBS).</li>
	<li>Sospensione cellulare separata in 3 tubi diversi: inibitore TLR4, anti-TLR2 e non trattato. Incubare le cellule con 1 inibitore TLR4 g/mL per 60 min a RT o con 50 g/mL anti-TLR2 per 30 min a RT.</li>
	<li>Aggiungere 200 l di lispetto, 10% FBS, 10% plasma di topo commerciale (Tabella dei materiali) o una miscela delle soluzioni proteiche a una piastra di 48 pozze (o equivalente) e consentire alle proteine di adsorbenti a 37 gradi centigradi per la quantità di tempo desiderata (cioè 30 min, 60 min o 24 h). Soluzioni proteiche aspirati da pozzi, utilizzando una pipetta Pasteur fresca per ogni soluzione proteica, e lavare le superfici con 250 -L di PBS per 5 min. Ripetere per un totale di 3 lavamenti. NOT:</</c4> Questo passaggio potrebbe essere necessario iniziare in precedenza nel protocollo a seconda del tempo di annunci desiderato. Regolare il protocollo di conseguenza.</li>
	<li>Dopo il periodo di incubazione con l'inibitore TLR4 o anti-TLR2, le cellule pipeta da riutilizzare. Aggiungere 200 l di soluzione cellulare ad ogni bene.</li>
	<li>Per la condizione di controllo positivo TLR2, aggiungere Pam3CSK4 a una concentrazione finale di 150 ng/mL. Per la condizione di controllo positivo TLR4, aggiungere il lipopolisaccharide (LPS) a una concentrazione finale di 1,5 g/mL. Incubano cellule a 37 gradi centigradi per 20 ore.</li>
	<li>Campione 20 l di supernatante da ogni pozzo e piastra in duplicata in una piastra da 96 pozze. Includere come controllo in background tre pozze di 20 l. Aggiungete a ogni pozzo 200 di raccordo di saggio del giornalista SEAP. Coprire la piastra con una guarnizione adesiva e incubare per 2,5 ore a 37 gradi centigradi. NOT:</</c5> Il tempo di incubazione può variare a seconda delle condizioni sperimentali e deve essere ottimizzato per una forte differenza di assorbimento tra pozzi di controllo positivi e negativi.<ol>
<li>Trasferire il resto del supernatante in un tubo da 1,5 mL (per pozzo). Centrifuga a 1.000 x g per 10 min a pellet eventuali detriti. Trasferire supernatante in un nuovo tubo da 1,5 mL e conservarlo a -80 gradi centigradi. Analizzare il supernatante per la presenza di citochine infiammatorie (ad es., TNF-z, interleuchina 6) attraverso il saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la guarne della piastra adesiva. Leggere l'assorbimento della piastra utilizzando un lettore di lamiere a 635 nm. Liquido aspirato e piastra di scarto.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Uno degli obiettivi principali del nostro laboratorio è la risposta dell'ospite agli impianti di tessuti molli biomateriali solidi, e in particolare il modo in cui il danno cellulare subito durante la procedura di impianto influisce sulla risposta dell'ospite. Il lavoro qui presentato descrive gli esperimenti preliminari utilizzando una linea cellulare del macrofago reporter e il lisa cellulare contenente DAMP generato in vitro, per studiare l'influenza delle molecole rilasciate durante i danni cellulari (cioè dalla chir...

La reazione del corpo estraneo (FBR) è una risposta cronica dell'ospite che può influire negativamente sulle prestazioni di un materiale o dispositivo impiantato (ad esempio, dispositivi di somministrazione di farmaci, biosensori), attraverso il rilascio persistente di mediatori infiammatori e impedendo l'integrazione tra il materiale impiantato e il tessuto circostante1. Questa risposta immunitaria innata è iniziata dalla procedura di impianto ed è caratterizzata dalla presenza a lungo termine di cellule immunitarie innate e formazione di capsule fibrose intorno all'impianto1. Nel contesto delle risposte materiali dell'ospite, le interazioni macrofago-materiale hanno un impatto significativo sulla progressione della risposta dell'ospite e sullo sviluppo di un FBR1. I macrofagi sono una popolazione di cellule immunitarie innate diversificata, reclutate nel sito dell'impianto sia da popolazioni di macrofagi residenti in tessuto che dal sangue come macrofagi derivati da monociti. Iniziano ad accumularsi nel sito dell'impianto poco dopo l'impianto e in pochi giorni diventano la popolazione cellulare predominante nel microambiente dell'impianto. I macrofagi aderenti ai materiali, insieme alle cellule giganti del corpo estraneo (FBGC) formate attraverso la fusione dei macrofagi, possono persistere sulla superficie materiale per tutta la durata dell'impianto2,3. Di conseguenza, i macrofagi sono considerati attori chiave nella risposta del corpo estraneo a causa dei loro ruoli orchestrando i passi caratteristici della FBR: risposta infiammatoria acuta, rimodellamento dei tessuti e formazione del tessuto fibrotico1.
I recettori a pedaggio (TLR) sono una famiglia di recettori di riconoscimento dei pattern che sono espressi da molte cellule immunitarie, tra cui i macrofagi, e hanno dimostrato di svolgere un ruolo significativo nell'infiammazione e nella guarigione delle ferite. Oltre ai ligandi di derivazione patogena, i TLR sono in grado di legare molecole endogene, note come modelli molecolari associati a i danni (DAMP), che vengono rilasciate durante la necrosi cellulare e attivano vie di segnalazione infiammatoria con conseguente produzione di citochine infiammatorie4. Noi e altri abbiamo proposto che i danni subiti durante le procedure di impianto dei biomateriali dei tessuti molli rilasciano DAMP, che poi adsorbisce alle superfici biomateriali oltre alle proteine del sangue e modulano le successive interazioni cellula-materiale5,6. Quando i macrofagi interagiscono con lo strato proteico adsorbito su un impianto, i loro TLR di superficie possono riconoscere i DAMP adsorbiti e attivare le cascate di segnalazione infiammatorie, portando all'attivazione del fattore di trascrizione NF-B e AP-1 e alla produzione di citochine proinfiammatorie. In precedenza abbiamo dimostrato che i macrofagi murini hanno aumentato significativamente l'attività di NF-B/AP-1 e il fattore di necrosi tumorale citochina infiammatoria) secrezione in risposta agli strati proteici adsorbiti contenenti DAMP su una varietà di superfici polimeriche rispetto alle superfici con siero adsorbito o solo plasma (cioè, nessun DAMP presente), e che questa risposta è in gran parte mediata da TLR2, mentre TLR4 svolge un ruolo minore5.
La linea cellulare macrofagia del reporter NF-B/AP-1 (Tabella dei materiali) utilizzata in questo protocollo è un metodo conveniente per misurare l'attività relativa NF-B e AP-1 nei macrofagi5,7,8. In combinazione con gli inibitori della via TLR, questa linea cellulare è uno strumento utile per studiare l'attivazione della TLR e il suo ruolo nell'infiammazione in risposta a una varietà di stimoli5,7,8. Le cellule del reporter sono una linea cellulare modificata simile a un macrofago murino che può produrre stabilmente fosfosate alcalina embrionale (SEAP) su attivazione del fattore di trascrizione NF-B e AP-19. Il saggio di fosfofosate alcalina enzimatica colorimetrica (Tabella dei materiali) può quindi essere utilizzato per quantificare quantità relative di espressione SEAP come misura indiretta dell'attività NF-B/AP-1. Poiché le molecole di adattatore NF-B e AP-1 sono a valle di molte vie di segnalazione cellulare, è possibile neutralizzare anticorpi e inibitori mirati a TLR specifici (ad esempio, TLR2) o molecole di adattatore TLR (ad esempio MyD88) per verificare il ruolo di una via specifica. La metodologia descritta in questo articolo fornisce un approccio semplice e rapido per valutare il contributo della segnalazione TLR nelle risposte murine dei macrofafi a una varietà di superfici polimeriche con strati proteici adsorbiti contenenti sia proteine ematiche che DAMP come modello in vitro di biomateriali impiantati.

<table><tbody><tr><td>Reagenti per colture cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-topo/umano CD282 (TLR2)</td><td>Biolegend</td><td>121802</td><td></td></tr><tr><td>CLI-095 (inibitore TLR4)</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-CLI95</td><td></td></tr><tr><td>C57 complemento plasma K2 EDTA 10ml, grado innovativo di origine statunitense</td><td>Innovative Research</td><td>IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml</td><td>Plasma di topo</td></tr><tr><td>Terreno dell'aquila modificato di Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>Senza calcio, senza magnesio</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS), grado di ricerca</td><td>Wisent</td><td>98150</td><td></td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-EKLPS</td><td>Lipopolisaccaride da Escherichia coli K12</td></tr><tr><td>Fibroblasti NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>Lipopeptide triacilato sintetico - ligando TLR1/2</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-MPP</td><td>Reagente per l'eliminazione del micoplasma</td></tr><tr><td>RAW-Blue cells</td><td>Invivogen</td><td>raw-sp</td><td>NF-&kappa; Linea cellulare di macrofagi reporter B/AP-1</td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Enzima espresso di TrypLE (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>Enzima di dissociazione cellulare ricombinante privo di origine animale</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-ZN-1</td><td></td></tr><tr><td>Kit e saggi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre prerivestite ELISA, piastre prerivestite IL-6</td><td>Biolegend</td><td>B213022</td><td></td></tr><tr><td>ELISA di topo, TNF-&alpha di topo;</td><td>Biolegend</td><td>B220233</td><td></td></tr><tr><td>Endotossina (Escherichia coli) - Controllo standard endotossina (CSE)</td><td>Associates di Cape Cope Inc.</td><td>E0005-5</td><td>Endotossina per curva standard nel saggio dell'endotossina cromogenica</td></tr><tr><td>LAL acqua, 100 ml</td><td>Associates of Cape Cope Inc.</td><td>WP1001</td><td>Utilizzato con il test dell'endotossina cromogenica</td></tr><tr><td>Saggio della proteina Micro BCA</td><td>Fisher Scientific</td> PI23235 Kit per il test <td></td> dell'endotossina <td></td></tr><tr><td>pirocromo lisato di amebociti (LAL) Associati</td><td>di Cape Cope Inc.</td><td>C1500-5</td><td>Reagente per il dosaggio dell'endotossina cromogenica</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue Terreno di rilevamento della fosfatasi alcalina</td><td>Invivogen</td><td>rep-qb2</td><td>Dosaggio della fosfatasi alcalina per misurare indirettamente NF-&kappa; B/AP-1 attività</td></tr><tr><td>Reagenti di rivestimento polimerici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio, anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico anidro</td><td>Alcoli commerciali</td><td>P006EAAN</td><td>Sigma: Alcool reagente, anidro, 676829-1L</td></tr><tr><td>Pinze diritte a punta fine affusolata</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-113</td><td></td></tr><tr><td>Solvente Fluorinert FC-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9755-100ML</td><td>Solvente fluorurato per fPTFE</td></tr><tr><td>Acqua per colture cellulari (senza endotossine)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30529LS</td><td></td></tr><tr><td>Poli(metilmetacrilato) (PMMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>182230-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit di elastomeri</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822180</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-AF (fPTFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>469610-1G</td><td>Poli[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluorometil)-1,3-diossole-co-tetrafluoroetilene]</td></tr><tr><td>Consumabili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guarnizioni per piastre adesive</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette Axygen, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-155</td><td></td></tr><tr><td>Fiale a scintillazione in vetro borosilicato, con tappi in polipropilene bianco</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>Piastra PS a 48 pozzetti trasparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-52</td><td></td></tr><tr><td>Piastra TCPS a 96 pozzetti trasparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-2C</td><td></td></tr><tr><td>Piastra TCPS a 48 pozzetti</td><td>trasparente Fisher Scientific</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>Copribicchieri, cerchi</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi trattati per colture tissutali Falcon, T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>vetrini adesivi a 8 pozzetti</td><td>Ibidi</td><td>80828</td><td></td></tr><tr><td>vetrini per microscopio Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche trattate per colture tissutali, T150</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr></tbody></table>

un analisi della cella del macrophage reporter per esaminare la segnalazione nf-kb/ap-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

La persistente risposta infiammatoria all'uso di un biomateriale impiantato, noto come reazione del corpo estraneo, è una sfida significativa nello sviluppo e nell'implementazione di dispositivi biomedici e costrutti di ingegneria tissutale. I macrofagi, una cellula immunitaria innata, sono attori chiave nella reazione del corpo estraneo perché rimangono nel sito dell'impianto per tutta la durata del dispositivo e sono comunemente studiati per comprendere questa risposta dannosa dell'ospite. Molti ricercatori di biomateriali hanno dimostrato che gli strati proteici adsorbiti sui materiali impiantati influenzano il comportamento dei macrofafi e successivamente influenzano la risposta dell'ospite. I metodi di questo documento descrivono un modello in vitro utilizzando strati proteici adsorbiti contenenti molecole di danno cellulare su superfici biomateriali polimeriche per valutare le risposte dei macrofagi. Una linea cellulare di macrofasi reporter nF-B/AP-1 e l'addetto altest alcalino metrico sono stati utilizzati come metodo rapido per esaminare indirettamente l'attività del fattore di trascrizione NF-B/AP-1 in risposta a complessi strati proteici adsorbiti contenenti proteine ematiche e modelli molecolari associati ai danni, come modello dei complessi strati proteici adsorbenti formati sulle superfici biomateriali in vivo.

Sono stati testati metodi di pulizia per le superfici rivestite di polimeri per garantire che non vi fosse alcuna interruzione del rivestimento, che sarebbe stato visto come un cambiamento dell'angolo di contatto con l'acqua a una vetrina di vetro non rivestita (Figura 2). L'immergenza di vetrini al microscopio rivestiti pmMA in 70% etanolo per 1 h è stato trovato per rimuovere il rivestimento PMMA (Figura 2, pannello sinistro), probabilmente a causa della solub...

Questo protocollo fornisce ai ricercatori un metodo rapido e indiretto per misurare l'attività del fattore di trascrizione NF-B-B/AP-1 dipendente da TLR in una linea cellulare murina di macrofaci in risposta a una varietà di superfici polimeriche e strati proteici adzuolabili che modellano il microambiente implantare biomateriale.

Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development ...

Questo protocollo consente la rapida valutazione dell'attività NF-kappa-B e AP-1 nei macrofagi reporter coltivati su strati proteici adsorbiti e il contributo delle vie di segnalazione cellulare, come i recettori simili a Toll, a tale risposta. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità, che consente di analizzare rapidamente i supernatici di coltura cellulare per l'attività NF-kappa-B e AP-1 utilizzando un semplice saggio enzimatico. Inizia sciogliendo il PMMA in cloroformio a una concentrazione finale di 20 milligrammi per millilitro in una fiala di scintillazione in vetro da 20 millilitri in una cappa aspirante.Posizionare una barra di agitazione magnetica nel flaconcino e mescolare la miscela per almeno due ore. Una volta sciolti tutti i solidi, trasferire 400 microlitri della soluzione PMMA al centro di ogni vetrino in vetro borosilicato per condizione pianificata su uno spin coater e ruotare il PMMA sullo scivolo per due minuti a 3.000 rotazioni al minuto. Quindi conservare le diapositive rivestite di spin in una scatola pulita spruzzata con etanolo al 70%.Successivamente, in un armadio di sicurezza biologico, utilizzare forcep sterili e tecnica aseptica pe

a-macrophage-reporter-cell-assay-to-examine-toll-like-receptor

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Il test sialidasi è un approccio semplice tecnica che chiarire romanzo meccanismo molecolare (s) di sensori TLR di infezioni microbiche e di coinvolgimento nelle malattie infiammatorie a livello dei recettori sulla superficie cellulare di macrofagi dal vivo.

Rilevazione di attività NEU1 sialidasi nella regolamentazione Toll-like l&#39;attivazione del recettore

Fonte: Barbero, A. M., et.al. Saggi di fluorescenza per lo studio dell'interazione di Mycobacterium tuberculosis con il recettore immunitario SLAMF1. J. Vis. Esp. ( (2025)Questo video mostra un saggio basato sulla fluorescenza per studiare l'interazione tra un recettore dei macrofagi e gli antigeni di Mycobacterium tuberculosis . Gli antigeni marcati fluorescentmente su un coperchio vengono incubati con estratti proteici di macrofagi, reticolati, marcati da anticorpi e visualizzati tramite...

Saggio basato sulla fluorescenza per indagare le interazioni dei recettori dei macrofagi con gli antigeni batterici

Questo video mostra un test per esaminare l'attività dipendente dal recettore toll-like (TLR) dei fattori di trascrizione fattore nucleare-kappa-B (NF-κB) e proteina attivatrice-1 (AP-1) nei macrofagi. I TLR innescano una cascata di segnalazione pro-infiammatoria dopo aver riconosciuto i pattern molecolari associati al danno (DAMP), attivando NF-κB e AP-1. I macrofagi reporter ingegnerizzati producono l'enzima fosfatasi alcalina embrionale (SEAP) secreto dopo l'attivazione di NF-κB e AP-1, che...

Un saggio per la segnalazione del fattore di trascrizione NF-&kcy;B/AP-1 TLR-dipendente nei macrofagi

Questo video mostra un test basato su cellule reporter per lo screening di potenziali nanoparticelle bioattive che inibiscono la segnalazione del recettore Toll-like (TLR). Il test prevede l'introduzione di lipopolisaccaridi (LPS) mescolati con ibridi di nanoparticelle peptidico-oro ai macrofagi reporter che esprimono le proteine reporter: fosfatasi alcalina embrionale secreta (SEAP) e luciferasi. La riduzione del segnale TLR indotto da LPS mediata dagli ibridi è determinata misurando i segnali...

Un test per lo screening di nanoparticelle bioattive per l'inibizione della segnalazione del recettore toll-like

Le cellule dendritiche (DC) secernono IL-1β in risposta al riconoscimento di TLR8 purinico sintetico, R848, seguita dall'attivazione inflammasome NLRP3 con nigericin, dunque, IL-1β può essere utilizzata per misurare l'attività inflammasome NLRP3. Intracellulare colorazione citochina, immunoblotting, ELISA e sono utilizzati per misurare con precisione NLRP3 inflammasome adescamento e l'attivazione tramite l'espressione di IL-1β.

Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

In questo protocollo, descriviamo metodi per trasfettare in modo efficiente linee cellulari di macrofagi murini con siRNA utilizzando il sistema navetta a 96 pozzetti Amaxa Nucleofector, stimolare i macrofagi con lipopolisaccaride e monitorare gli effetti sulla produzione di citochine infiammatorie.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Descriviamo una configurazione sperimentale per visualizzare con un'alta risoluzione senza precedenti la formazione e la chiusura di fagosomi in tre dimensioni in macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Consente il monitoraggio della base della coppa fagocitica, degli pseudopodi estensibili e del sito preciso della scissione fagosomiale.

&quot;Phagosome chiusura Assay&quot; per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

La segnalazione di TLR (Toll-like receptor) ha un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie infiammatorie umane e la regolazione delle risposte TLR mediante nanoparticelle bioattive è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie. Le cellule reporter THP-1 forniscono una piattaforma di screening versatile e robusta per identificare nuovi inibitori della segnalazione TLR.

Screening delle nanoparticelle bioattive in cellule immunitarie fagocitiche per gli inibitori della segnalazione di ricetrasmettitori simili

Scopri come valutare l'attività di NF-kappa-B e AP-1 in macrofagi reporter su superfici polimeriche con adsorbimento proteico. Questo metodo semplice analizza i supernatanti di coltura tramite saggio enzimatico.

Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche (Video) | JoVE Journal

Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche

Esplora altri video