Infezione da pneumococco delle cellule primarie endoteliali nel flusso costante

L'uso di questo sistema di coltura cellulare endoteliale consente l'assimilazione della situazione nel flusso sanguigno. E con questa situazione, possiamo analizzare i processi di infezione batterica includendo anche l'identificazione di vettori batterici e anche di vettori cellulari che sono coinvolti in questo processo. Questa tecnica apre la strada all'esplorazione dell'impatto delle infezioni batteriche sull'integrità vascolare, includendo anche l'impatto sui meccanismi di morfogenesi, sulle risposte all'infiammazione e sulla regolazione immunitaria.

Questa tecnica richiede una gestione speciale delle cellule endoteliali e quindi una descrizione visiva è meglio di una semplice spiegazione verbale. Questo metodo fornisce approfondimenti su diverse altre aree di ricerca correlate con sistemi vascolari perfusi come la differenziazione delle cellule endoteliali, la guarigione delle ferite, la genesi del tumore e l'angiogenesi. Uno dei passaggi chiave è la coltivazione standardizzata delle cellule e la manipolazione accurata delle cellule endoteliali primarie.

Questa tecnica richiede una gestione speciale della coltura cellulare che non potrebbe essere chiara solo con una spiegazione verbale. Per iniziare, lavorare in un ambiente sterile utilizzando un banco pulito. Utilizzare una pipetta per iniettare 100 microlitri di una soluzione PBS di gelatina suina filtrata sterile al 2% in un unico serbatoio di un vetrino a canale equilibrato a temperatura.

Posizionare lo scivolo del canale rivestito di gelatina su una sottile piastra di polistirolo o polistirolo per evitare un calo della temperatura di scorrimento con una siringa Luer millilitro per aggiungere 100 microlitri della sospensione HUVEC quattro volte 10 al quinto per millilitro nello scivolo per seminare e coltivare l'HUVEC. Incubare lo scivolo del canale con l'HUVEC per 60 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, riempire ogni serbatoio medio ad entrambe le estremità dello scivolo del canale con 60 microlitri di mezzo ECGMS.

Incubare per un'altra ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, per regolare la pompa microfluidica, collegare prima la perfusione equilibrata impostata all'unità pompa, riempire con 13,6 millilitri di mezzo ECGMS e avviare il software di controllo della pompa. Nel menu della configurazione dell'unità fluidica, selezionare l'adeguato set di perfusioni e il tipo di diapositiva della camera utilizzando le finestre di scorrimento verso il basso.

Scegli 0,007 dyne secondo per centimetro quadrato nel software per una viscosità media. All'esterno dell'incubatore, collegare una bottiglia di vetro piena di perline di silice essiccanti ai tubi di pressione dell'aria. Selezionare i parametri di flusso nel menu software, impostare la pressione su 40 millibar e lavare i tubi della pompa con il mezzo liquido avviando il flusso medio continuo.

Garantiamo un attacco cellulare stretto utilizzando HUFC coltivati in modo subconfluente e ci concentriamo inoltre sull'uscita delle bolle d'aria dal sistema e sull'utilizzo di un alimentatore indipendente per il sistema di pompaggio. Toccare i collegamenti dei tubi per rimuovere le bolle d'aria e assicurarsi che non circoleranno bolle d'aria nel sistema di pompaggio. Per collegare lo scivolo del canale, interrompere la circolazione del flusso nel software di controllo della pompa e tenere il flusso medio e il tubo di perfusione bloccando i tubi vicino alla connessione Luer.

Collegare lo scivolo del canale evitando così bolle d'aria. Nella scheda avanzata del software di controllo della pompa, utilizzare il creatore del ciclo degli utensili software per programmare i cicli di sollecitazione di taglio desiderati per la coltivazione del flusso. Programmare i livelli di sollecitazione di taglio per la circolazione del flusso e iniziare la perfusione a lungo termine.

Inizia con cinque dyne per centimetro quadrato che corrisponde a una portata di 5,44 millilitri al minuto per 30 minuti seguita da un flusso continuo a sollecitazione di taglio di 10 dyne per centimetro quadrato che corrisponde a una portata di 10,85 millilitri al minuto. Controllare il pompaggio bilanciato del serbatoio. Posizionare l'unità fluidica con lo scivolo del canale collegato in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Avviare il controllo software del microscopio e regolare le impostazioni principali per il monitoraggio microscopico della fluorescenza selezionando le impostazioni del filtro appropriate. Per la visualizzazione microscopica, posizionare l'unità fluidica nella camera di riscaldamento di 37 gradi Celsius. Posizionare lo scivolo del canale sul palco di un microscopio precontevolto.

Controllare la morfologia cellulare e l'integrità dello strato HUVEC prima dell'iniezione di istamina e batteri nella circolazione del flusso. Mantenere l'impostazione del flusso. Indurre il rilascio di VWF da corpi palade endoteliali vitali iniettando 136 microlitri di una soluzione di stock di istamina da 100 millimolare attraverso una porta di iniezione nel mezzo ECGMS che circola nei tubi di perfusione.

Per il rilevamento dell'immunofluorescenza di stringhe VWF multimerizzate, iniettare 20 microgrammi di un anticorpo coniugato FITC specifico VWF in un volume di 200 microlitri di PBS nei 13,6 millilitri circolanti del mezzo ECGMS. Per quantificare l'attacco Pneumococcico alle stringhe VWF generate sulle superfici cellulari HUVEC, iniettare 1,35 volte 10 all'ottavo CFU per millilitro RFP esprimendo Pneumococchi in un volume massimo di un millilitro nel mezzo ECGMS utilizzando la porta di iniezione. Selezionare un obiettivo di immersione dell'olio 63X per l'ingrandimento del microscopio e regolare le impostazioni del filtro a fluorescenza nel software del microscopio sul canale RFP con un filtro di rilevamento da 540 nanometri per il rilevamento di RFP che esprime Pneumococchi.

Per la quantificazione dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF, creare istantanee di pile Z di almeno 30 viste rappresentative sul campo ciascuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatte e contare la quantità di Pneumococchi. Per valutare l'attacco batterico dopo la fissazione prima della colorazione immunofluorescente, interrompere il flusso, rimuovere 10 millilitri di mezzo ECGMS dai serbatoi della pompa e aggiungere 10 millilitri di PBS integrati con paraformaldeide al 5% e procedere secondo il manoscritto. In questo protocollo, i principali passaggi sperimentali iniziano con una pre-coltivazione di cellule endoteliali primarie alla subconfluenza nei contenitori di coltura cellulare.

Le cellule vengono quindi sementi in uno scivolo a canale rivestito di gelatina. I batteri vengono coltivati su piastre di agar seguite dalla coltivazione in una complessa fase di log medio-medio liquido. Per la coltura cellulare microfluidica, uno scivolo di canale con cellule endoteliali è collegato ai tubi di perfusione di un'unità fluidica del sistema di pompaggio e sottoposto a flusso costante per la differenziazione cellulare.

La generazione delle corde VWF è stata indotta dall'iniezione di istamina ad una sollecitazione di taglio di 10 dyne secondo per centimetro quadrato e monitorata microscopicamente dal rilevamento dell'immunofluorescenza utilizzando anticorpi specifici VWF etichettati FITC. Dopo l'iniezione di proteine rosse a fluorescenza che esprimono batteri al mezzo circolante, l'attacco di Pneumococco alle corde VWF è stato visualizzato microscopicamente in tempo reale dall'emissione di fluorescenza a 450 nanometri. Dopo la fissazione delle cellule utilizzando pfa, la colorazione differenziale dell'immunofluorescenza fornisce la visualizzazione dell'attaccamento batterico in specifici punti di tempo di infezione.

La fase più importante di questa procedura è garantire un attacco cellulare stretto sulla superficie dello scivolo regolando i livelli fisiologici di sollecitazione di taglio ed evitando fluttuazioni estreme della pressione della pompa. Oltre alla visualizzazione microscopica, questa tecnica può essere applicata per studiare gli effetti farmacologici di nuovi anti-infettivi e anche per analizzare le conseguenze a lungo termine dei processi di infezione vascolare. Questo sistema di pompe perfonde agenti patogeni batterici per pressione dell'aria per prevenire qualsiasi trasmissione tramite aerosol.

Si consiglia di seguire le precauzioni di biosicurezza.