Name: Un modello di vescica murine decentralizzato (Ex Vivo) con il muscolo del detrusore rimosso per laccesso diretto al Suburothelium durante il riempimento della vescica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Scopri un modello di vescica murina senza detrusore per studiare i meccanismi di segnalazione tra urotelio e suburotelio durante il riempimento. Questo metodo permette di analizzare la disponibilità dei mediatori uroteliali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale di Diabete e Malattie Digestive e Neovirali DK41315.

Tutte le procedure che coinvolgono animali descritte in questo manoscritto sono state condotte secondo il National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e il Institutional Animal Use and Care Committee dell'Università del Nevada.
NOTA: Il modello qui presentato consiste nella rimozione del muscolo detrusore mentre l'urolium e il SubU/LP rimangono intatti(Figura 1B) per consentire agli investigatori l'accesso diretto a SubU/LP nel corso del riempimento della vescica.
1. Dissezione della preparazione della vescica priva di detrusivi
<ol><li>Collocare la vescica isolata in un piatto di dissezione pieno di freddo (10 gradi centigradi) e ossigenato con 5% CO2/95 % O2 Krebs soluzione bicarbonato (KBS) con la seguente composizione (mM): 118.5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dextrose, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.</li>
	<li>Pin una piccola porzione della cupola della vescica isolata a un piatto di dissezione sillgarda ricoperto di Sylgard pieno di KBS. Assicurarsi che il perno passi attraverso un pezzo di sirosa o il bordo più esterno del muscolo detrusore lontano dal bordo più interno del muscolo che si affaccia sul SubU/LP.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio, identificare l'uretra e gli ureteri e fissare ciascuno di essi sul fondo del piatto di dissezione.</li>
	<li>Rimuovere i tessuti adiposi e connettivi in eccesso in modo che vengavisualizzato l'intero corpo principale della vescica, l'uretra ed entrambi gli ureteri.</li>
	<li>Legare gli ureteri con 6-0 suture di nylon. Quindi, pin le estremità aperte degli ureteri verso il fondo del piatto di dissezione per garantire la preparazione.</li>
	<li>Utilizzando pinze a punta fine, tirare delicatamente un pezzo di sirosa all'angolo tra l'uretere e il corpo della vescica.</li>
	<li>Regolare la luce del microscopio per aumentare la trasparenza e distinguere il margine della sottomucosa sotto il muscolo detrusore.</li>
	<li>Iniziare a tagliare (non peeling!) la parete della vescica con forbici a punta fine lungo la superficie interna dello strato muscolare del detrusore mentre si allontana delicatamente il segmento tagliato dalla preparazione. In ogni momento, assicurarsi che il bordo laterale della mucosa può essere visto ed evitare di toccarla.</li>
	<li>Rimuovere completamente il muscolo detrusore girando intorno al piatto di dissezione in modo che la posizione della preparazione sia comoda per continuare a sezionare il muscolo detrusore.</li>
	<li>Lasciare un piccolo pezzo di muscolo detrusore sulla parte superiore della cupola della vescica per garantire la capacità di immobilizzare la preparazione durante le fasi rimanenti del protocollo.</li>
	<li>Fare un doppio anello di 6-0 filo di nylon, posizionarlo intorno al collo della preparazione della vescica, e lasciare il ciclo sciolto.</li>
	<li>Aggiungere un secondo doppio anello di 7-0 filo di seta, posizionarlo intorno al collo della preparazione della vescica e lasciare che il ciclo perda. Avere due suture previene le perdite intorno alle suture.</li>
	<li>Tagliare circa 2 cm di 20 pE tubi (catetere), brillare la punta muovendo lentamente la punta vicino a una fiamma.</li>
	<li>Riempire il catetere con KBS ossigenato caldo (37 gradi centigradi).</li>
	<li>Inserire il catetere nell'orifizio dell'uretra della vescica e spingere delicatamente il catetere fino a quando la punta del catetere raggiunge approssimativamente il centro della vescica.</li>
	<li>Legare la sutura intorno al catetere e il tessuto circostante del collo della vescica.</li>
	<li>Riempire lentamente la vescica con circa 50-100 gradi di KBS ossigenato (37 gradi centigradi), sollevarla brevemente (<10 s) sopra la superficie di KBS e monitorare le perdite alle suture e al corpo della vescica.</li>
	<li>Se non si osserva alcuna perdita, la preparazione è pronta per l'esperimento. Se si osserva una perdita intorno alla sutura, rimuovere la sutura e sostituirla. Se si nota una perdita da un buco nel corpo della vescica, scartare la preparazione.</li>
</ol>2. Riempimento della preparazione della vescica denudata
<ol><li>Perfusi KBS (37 ) in una camera da 3 mL di un piatto d'organo rivestito in acqua con fondo Sylgard.</li>
	<li>Regolare le linee di ossigeno e aspirazione.</li>
	<li>Posizionare la preparazione della vescica denudata nella camera.</li>
	<li>Fissare il catetere sul lato della camera in modo che la preparazione non galleggia sopra la superficie della soluzione di perfusione.</li>
	<li>Collegare il catetere della vescica a un tubo PE20 più lungo (linea di infusione) collegato al stopcock a tre vie utilizzando il raccordo della stessa dimensione.</li>
	<li>Assicurarsi che le linee tra la pompa di infusione, il trasduttore di pressione e la vescica siano aperte.</li>
	<li>Riempire la siringa di infusione con KBS fresco, caldo (37 gradi centigradi) e ossigenato.</li>
	<li>Regolare i parametri della pompa: tipo/volume della siringa (ad esempio, 1 mL), funzionamento (cioè infuso), flusso (cioè costante) e portata (ad es. 15 l/min).</li>
	<li>Premere il pulsante Start sulla pompa della siringa per riempire la vescica.</li>
	<li>Monitorare il volume di riempimento e la pressione intravesica durante il riempimento della vescica.</li>
</ol>3. Rilevamento dei Mediatori nell'Aspetto SubU/LP della preparazione della vescica denudata
<ol><li>Raccogliere le aliquote della soluzione vasca da bagno in tubi di microcentrifuga a freddo ghiaccio o inserti di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).</li>
	<li>Preparare ed elaborare i campioni in base all'applicazione di rilevamento appropriata. Nel caso di rilevamento della disponibilità di purine, elaborare i campioni da HPLC con rilevamento della fluorescenza13,18.</li>
</ol>

<ol><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).</li>
<li>Fry, C. H., Vahabi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Mucosa+in+Normal+and+Abnormal+Bladder+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).</li>
<li>Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors%2C+channels%2C+and+signalling+in+the+urothelial+sensory+system+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewes+Urology%22%5BJournal%5D)">Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder.</a> Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).</li>
<li>Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+is+released+from+rabbit+urinary+bladder+epithelial+cells+by+hydrostatic+pressure+changes--a+possible+sensory+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism?</a> Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).</li>
<li>Wang, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+and+purinergic+receptor-dependent+membrane+traffic+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+for+Piezo1+in+stretch-evoked+Ca%282%29%28%2B%29+influx+and+ATP+release+in+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).</li>
<li>Mochizuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPV4+cation+channel+mediates+stretch-evoked+Ca2%2B+influx+and+ATP+release+in+primary+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).</li>
<li>McLatchie, L. M., Fry, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+release+from+freshly+isolated+guinea-pig+bladder+urothelial+cells%3A+a+quantification+and+study+of+the+mechanisms+involved%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved.</a> BJU International. 115, 987-993 (2015).</li>
<li>Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic-+and+capsaicin-evoked+nitric+oxide+release+from+urothelium+and+afferent+nerves+in+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).</li>
<li>Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO%3A+effect+on+bladder+afferent+neurons+and+nitric+oxide+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release.</a> Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor+expression+suggests+a+sensory+role+for+urinary+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-adrenoceptor+agonists+stimulate+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+rat+urinary+bladder+urothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).</li>
<li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).</li>
<li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+cholinergic+system+in+human+bladder+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium.</a> Urology. 67, 425-430 (2006).</li>
<li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).</li>
<li>Collins, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OnabotulinumtoxinA+significantly+attenuates+bladder+afferent+nerve+firing+and+inhibits+ATP+release+from+the+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium.</a> BJU International. 112, 1018-1026 (2013).</li>
<li>Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+afferent+pathways+and+urothelial+function+in+the+male+mouse+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder.</a> Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).</li>
<li>Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+purine+release+during+filling+of+murine+and+primate+bladders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).</li>
<li>Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signalling+underlies+transforming+growth+factor-beta-mediated+bladder+afferent+nerve+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability.</a> Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).</li>
</ol>

Parti di questo lavoro sono state precedentemente pubblicate sul Journal of PhysiOlogy (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Il permesso è stato concesso da Wiley and Sons, Inc. Gli autori non hanno conflitti finanziari o di altro tipo da divulgare.

La vescica ha due funzioni: stoccaggio e svuotamento dell'urina. Il normale funzionamento di queste funzioni richiede un adeguato rilevamento meccanico del volume e della pressione intraluminale e la trasduzione dei segnali attraverso le cellule nella parete della vescica per regolare l'eccitabilità muscolare detrusatrice. La mucosa della vescica (urothelium) è creduta per regolare l'eccitabilità della vescica rilasciando una varietà di molecole di segnalazione nella SubU/LP che colpiscono numerosi tipi di cellule nella ...

Lo scopo di questo modello è quello di consentire l'accesso diretto al lato submucosale della mucosa della vescica durante le diverse fasi di riempimento della vescica.
La vescica deve astenersi da una contrazione prematura durante il riempimento e vuota quando si raggiunge il volume critico e la pressione. Continenza anormale o svuotamento delle urine sono spesso associati con eccitabilità anormale del muscolo detrusore liscio (DSM) nel corso del riempimento della vescica. L'eccitabilità del DSM è determinata da fattori intrinseci alle cellule muscolari lisce e da influenze generate da diversi tipi di cellule all'interno della parete della vescica. La parete della vescica urinaria è costituita da urotelium (mucosa), suburotilio (SubU)/lamina propriale (LP), muscolo detrustore liscio (DSM) e sirosa (Figura 1A). L'urotelium è costituito da cellule ombrelli (cioè lo strato più esterno dell'urolium), cellule intermedie e cellule basali (cioè lo strato più interno dell'urothelium). Vari tipi di cellule, tra cui cellule interstitial, fibroblasti, terminali nervosi afferenti, piccoli vasi sanguigni, e le cellule immunitarie risiedono nella SubU/ LP. È ampiamente ipotizzato che l'urotelium della vescica sia un organo sensoriale che avvia la minzione riflessiva e la continenza rilasciando mediatori nella submucosa che colpiscono le cellule nel SubU/ LP e nel DSM1,2,3. Per la maggior parte, tali ipotesi si basano su studi che hanno dimostrato il rilascio di mediatori: da pezzi di mucosa esposti a cambiamenti di pressione idrostatica4,5; da cellule uoreliali coltivate esposte al tratto6,7, cella indotta dall'ipotonicitàgonfiore 7 o forze di trascinamento8; da strisce di parete della vescica isolate alrecettoreo attivazione del nervo9,10,11,12,13,14; e nel lume della vescica alla fine della vescica che riempie15,16,17,18,19. Mentre tali studi sono stati strumentali per dimostrare il rilascio di mediatori sulla stimolazione meccanica di segmenti della parete della vescica o cellule urotelia coltivate, hanno bisogno di essere supportati da prove dirette per il rilascio di mediatori nella submucosa che è suscitata da stimoli fisiologici che riproducono il riempimento della vescica. Questo è un compito impegnativo dato che il SubU / LP si trova in profondità nella parete della vescica ostacolando il semplice accesso alle vicinanze di SubU / LP durante il riempimento della vescica.
Qui, illustriamo un modello di vescica murina decentralizzata (ex vivo) con il muscolo detrusor rimosso13 che è stato sviluppato per facilitare gli studi sui meccanismi locali di meccanotransduzione che partecipano alla segnalazione tra l'urothelium della vescica, DSM e altri tipi di cellule nella parete della vescica. Questo approccio è superiore all'utilizzo di fogli piatti della parete della vescica, strisce di parete della vescica o cellule uroliali coltivate perché consente misurazioni dirette in prossimità di SubU/LP di mediatori derivati dall'urothelium che vengono rilasciati o formati in risposta a pressioni fisiologiche e volumi nella vescica ed evita potenziali cambiamenti fenotipici nella coltura cellulare. Può essere utilizzato per misurare la disponibilità, il rilascio, il metabolismo e il trasporto transuroteliale dei mediatori in SubU/LP in diverse fasi di riempimento della vescica (Figura 1B). La preparazione può essere utilizzata anche per esaminare la segnalazione uoteliale e la meccanotrazione in modelli di sindromi della vescica iperattiva e sottoattiva.

<table><tbody><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>Perni di dissezione Fine</td><td>Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>Pompa di infusione</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P284</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa</td><td>SCHOTT ACEI</td><td></td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus SZX7</td><td></td><td>Flessibile per l'uso di qualsiasi cannocchiale</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S671</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233</td><td>Fonte aghi flessibili</td></tr><tr><td>25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>Bagno d'organo Sorgente</td> flessibile <td>su misura</td><td></td><td>; L'abbiamo realizzato con il piatto di dissezione Radnoti</td></tr><tr><td>Tubo PE-20</td><td>Intramedic</td><td>427405</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>Trasduttore di pressione</td><td>Strumento</td><td></td> AD <td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>S& T Forcipe</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>00632-11</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>Software pressione-volume</td><td>AD Strumenti</td><td>Power lab</td><td></td></tr><tr><td>Sutura Nylon, 6-0</td><td>AD chirurgico</td><td>S-N618R13</td><td></td></tr><tr><td>Fonte flessibile Sutura Seta, 6-0</td><td>Deknatel tramite Braintree Scientific, Inc.</td><td>07J1500190</td><td>Siringhe flessibili Source</td></tr><tr><td>1 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Source flessibile</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>Sorgente flessibile</td></tr><tr><td>Circolatore d'acqua</td><td>Baxter</td><td>K-MOD 100</td><td>Source flessibile</td></tr></tbody></table>

un modello di vescica murine decentralizzato (ex vivo) con il muscolo del detrusore rimosso per l'accesso diretto al suburothelium durante il riempimento della vescica

A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

Studi precedenti hanno stabilito il rilascio di sostanze chimiche da fogli di mucosa della vescica piatta apposti nelle camere di ussing ed esposti a cambiamenti nella pressione idrostatica o tratto meccanico e dalle cellule umaleali coltivate su cambiamenti di pressione idrostatica, stretch, gonfiore cellulare, o forze di trascinamento, e in lucentezza della vescica alla fine del riempimento. Tali risultati hanno portato all'ipotesi che questi mediatori siano rilasciati anche in suburolio (SubU)/lamina propria (LP) durante il riempimento della vescica, dove influenzano le cellule profonde nella parete della vescica per regolare in ultima analisi l'escitabilità della vescica. Ci sono almeno due ovvie limitazioni in tali studi: 1) nessuno di questi approcci forniscono informazioni dirette sulla presenza di mediatori in SubU/LP, e 2) gli stimoli utilizzati non sono fisiologici e non riassumono l'autentico riempimento della vescica. Qui, discutiamo una procedura che consente l'accesso diretto alla superficie suburoteliale della mucosa della vescica nel corso del riempimento della vescica. La preparazione senza detrusioni murine che abbiamo creato assomiglia molto al riempimento della vescica intatta e consente di eseguire studi di volume di pressione sulla vescica in assenza di segnalazione confusa da riflessi spinali e muscolo liscio detrusore. Utilizzando il nuovo modello di vescica priva di detrustori, abbiamo recentemente dimostrato che le misurazioni intrassiche dei mediatori non possono essere utilizzate come proxy per ciò che è stato rilasciato o presente nel SubU/LP durante il riempimento della vescica. Il modello consente l'esame delle molecole di segnalazione derivate dall'urotelium che vengono rilasciate, generate dal metabolismo e/o trasportate nel SubU/LP durante il corso del riempimento della vescica per trasmettere informazioni ai neuroni e al muscolo liscio della vescica e regolarne l'eccitabilità durante la continenza e la miturismo.

La parete di preparazione della vescica senza detrusori murini è intatta e contiene tutti gli strati tranne il DSM e la sirosa. Studi di prova hanno dimostrato che la parete della vescica senza DSM comprende urothelium e SubU/LP mentre la tunica muscularis e la sirosa sono assenti (Figura 2)13.
Riempimento della vescica detrustore-free approssima il normale riempimen...

Il modello di vescica privo di detrusivi consente l'accesso diretto al suburothelium per studiare i meccanismi locali per la regolazione della disponibilità del mediatore biologicamente attivo in suburothelium/lamina propria durante lo stoccaggio e lo svuotamento delle urine. La preparazione assomiglia da vicino al riempimento di una vescica intatta e consente di eseguire studi sul volume di pressione senza influenze sistemiche.

Un modello di vescica murine decentralizzato (Ex Vivo) con il muscolo del detrusore rimosso per l'accesso diretto al Suburothelium durante il riempimento della vescica

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in ...

Il nostro modello di vescica con un muscolo detrusore rimosso è un nuovo approccio sperimentale per studiare contemporaneamente la disponibilità di mediatori uroteliali nella lamia propria e nel lume vescicale durante il riempimento della vescica. Questo modello può fornire nuove informazioni sui meccanismi di segnalazione tra urotelio, suburotelio e muscolo detrusore che regolano l'eccitabilità della vescica durante il riempimento. Iniziare posizionando l'esemplare di vescica murina intatto in un piatto sezionante sotto un microscopio a dissezione contenente KBS ossigenato di 10 gradi celsius e pulendo i tessuti connettivi e grassi intorno alla vescica.Pin una piccola porzione della cupola della vescica isolata fino attraverso il bordo più esterno del muscolo detrusore lontano dal bordo più interno del muscolo che si affaccia sul suburotelio lamia propria a un piatto di sezionamento coperto di sylgard riempito con KBS, e fissare gli ureteri e il collo della vescica per mostrare la preparazione della vescica intatta. Utilizzando forcelle a punta fine, tirare delicatamente un pezzo di serosa all'angolo tra l'uretro e il corpo della vescica e regolare la luce del microscopio per aumentare la trasparenza e distinguere il margine della sottomucosa sotto il muscolo detrusore. Per evitare di perforare la parete di preparazione, assicurarsi di tagliare il muscolo detrusore solo mentre il bordo laterale della mucosa vescicale è chiaramente visibile.Utilizzando forbici a punta fine, iniziare a tagliare la parete della vescica lungo la superficie interna dello strato muscolare del detrusore mentre si allontana delicatamente il segmento tagliato dalla preparazione facendo attenzione che il bordo laterale della mucosa possa essere osservato evitando di toccare il bordo del tessuto. Lasciare un piccolo pezzo del muscolo detrusore sopra la cupola della vescica per consentire l'immobilizzazione della preparazione durante i restanti passaggi del protocollo e riempire un pezzo di due centimetri di tubi in polietilene da 20 centimetri con KBS ossigenato celsius di 37 gradi celsius. Dopo aver inserito il catetere nell'orifizio dell'uretra vescica, spingere delicatamente il catetere fino a quando la punta del catetere raggiunge il centro approssimativo della vescica.Quindi fissare il catetere nel tessuto circostante del collo della vescica con una sutura in nylon 6.0 a doppio anello. Dopo aver controllato la presenza di perdite nel tessuto, posizionare la preparazione della vescica denudata in una camera da tre millilitri di 37 gradi Celsius con un fondo sylgard e fissare il catetere sul lato della camera in modo che la preparazione non galleggi sopra la superficie della soluzione di perfusione. Collegare il catetere della vescica a un pezzo di tubo di polietilene 20 collegato a un fermafo a tre e una siringa per infusione riempita con KBS ossigenato di 37 gradi celsius e avviare la pompa di infusione per riempire la vescica con KBS facendo attenzione a monitorare il volume di riempimento nella pressione intravesica durante il riempimento.Per rilevare i mediatori all'interno dell'aspetto suburotelio lamina propria della preparazione, raccogliere le aliquote della soluzione del bagno in vari punti di tempo sperimentali appropriati ed elaborare i campioni secondo l'analisi a valle pianificata. La parete di preparazione della vescica denudata contiene l'urotelio e il suburotelio ma non il muscolo liscio detrusore. Le relazioni di volume di pressione sono notevolmente simili nei preparati intatti e denudati.L'idoneità del modello per la misurazione dei mediatori derivati dall'urotelio rilasciati nel lato suburotelio lamina propria durante il riempimento può essere testata misurando il rilascio di mediatori purini nella soluzione che bagna il suburotelio lamina propria del preparato denudato. Come dimostrato, quantità trascurabili di purine possono essere rilevate in un bagno contenente una preparazione isolata della vescica con un muscolo detrusore intatto;mentre le quantità di queste purine sono significativamente più elevate nei campioni raccolti dal bagno contenenti una preparazione della vescica denudata. In particolare, la distribuzione di purine e metaboliti in campioni raccolti dal lume e dal suburotelio lamina propria al termine del riempimento differisce in modo significativo.L'aggiunta di atheno ATP, un analogo altamente fluorescente dell'ATP, al lato suburoteliale della preparazione senza detrusore comporta una diminuzione dell'atheno ATP e un aumento dei prodotti Atheno ATP, atheno ADP, atheno AMP e atheno ADO. Allo stesso modo, l'aggiunta di atheno ATP alla preparazione del lume si traduce in una diminuzione dell'Atheno ATP e in un aumento dell'ADP ateo, dell'atheno AMP e dell'atheno ADO nel lume. Inoltre, l'aggiunta di atheno ATP al lato suburotelio lamina propria del preparato denudato comporta la comparsa di atheno AMP e atheno ADO all'interno del lume.Allo stesso modo, l'aggiunta di atheno ATP al lume comporta la comparsa di atheno AMP e atheno ADO nel suburotelio lamina propria. Seguendo questa procedura, la disponibilità di mediatori eccitatori e inibitori può essere misurata alla lamina propria e nella lucentezza della vescica in diverse fasi del riempimento della vescica. Anche il trasporto bilaterale transuretrale di mediatori e il metabolismo dei mediatori possono essere studiati utilizzando questo modello.L'uso di questo nuovo modello di vescica si tradurrà in una nuova comprensione della segnalazione meccanosensibile intrinseca e locale tra l'urotelio e il muscolo liscio detrusore che controllano l'eccitabilità della vescica in salute e malattia.

a-decentralized-ex-vivo-murine-bladder-model-with-detrusor-muscle

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Tumori della vescica sono stabiliti in topi femmina in modo minimamente invasivo con il cateterismo, cauterizzazione locali, e l'adesione successiva delle cellule di carcinoma ai siti bruciare.

Un modello ortotopico di cancro alla vescica Murine

Stabilire un modello di tumore della vescica ortotopica per valutare gli effetti antitumorali di sarna via endovescicale consegnate e monitoraggio della crescita tumorale con l'ecografia e imaging bioluminescente.

Un modello ortotopico tumore della vescica e la valutazione del trattamento intravescicale sarna

Fonte: O'Brien, V. P., et. al., Infezione urinaria ricorrente da Escherichia coli scatenata dall'esposizione alla vescica vaginale a Gardnerella vaginalis nei topi. J. Vis. Esp. (2020)Questo video dimostra l'uso della microscopia elettronica a scansione per visualizzare la colonizzazione batterica e le interazioni ospite-patogeno nell'epitelio vescicale, in un modello murino pre-infetto.

Preparazione del tessuto della vescica del topo per la visualizzazione di infezioni batteriche

In questo video, descriviamo il trapianto ortotopico di organoidi tumorali vescicali in coltura nella vescica murina per studiare il ruolo dell'ambiente dell'organo sullo sviluppo dei tumori.

Modello di organoide tumorale della vescica: un metodo per il trapianto ortotopico di organoidi della vescica nella vescica murina ricevente

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule muscolari lisce del detrusore da campioni di vescica urinaria umana utilizzando un trattamento enzimatico sequenziale in due fasi.

Isolamento delle cellule muscolari lisce del detrusore: una procedura di digestione enzimatica per ottenere cellule DSM da campioni di vescica urinaria umana

La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.

Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti

I circa 3-8 milioni di persone negli Stati Uniti soffrono di sindrome interstiziale dolore cistite / vescica (IC / BPS), una condizione debilitante caratterizzata in parte da dolore pelvico. Per studiare contributi del sistema nervoso alla condizione, un modello fisiologico di dolore vescica urinaria è utilizzato in topi e ratti.

Vescica urinaria Distensione Evocati visceromotoria Risposte come un modello per il dolore della vescica nei topi

L'obiettivo di questo protocollo è quello di applicare un protocollo di dissociazione dei tessuti ottimizzato a un modello di topo di lesione del midollo spinale e convalidare l'approccio per l'analisi a singola cellula per citometria del flusso.

Un approccio di dissociazione a singola cellula per l'analisi molecolare della vescica urinaria nel topo dopo la lesione del midollo spinale

Presentiamo un metodo per stabilire un modello di sottoattività del detrusore mediante transezione del conus medullaris nei ratti. La sottoattività del detrusore è stata stimolata con successo in questi animali. Il modello può essere utilizzato per studiare la funzione del tratto urinario.

Modello di sottoattività del detrusore nei ratti mediante transezione di Conus medullaris

Questo protocollo descrive il processo di generazione e caratterizzazione di organoidi uroteliali di topo che ospitano delezioni in geni di interesse. I metodi includono la raccolta di cellule uroteliali di topo, la trasduzione ex vivo con adenovirus che guida l'espressione di Cre con un promotore CMV e la caratterizzazione in vitro e in vivo .

Ex Vivo Modello organoide delle delezioni geniche mediate da Adenovirus-Cre in cellule uroteliali di topo

Scopri un modello di vescica murina senza detrusore per studiare i meccanismi di segnalazione tra urotelio e suburotelio durante il riempimento. Questo metodo permette di analizzare la disponibilità dei mediatori uroteliali.

Un modello di vescica murine decentralizzato (Ex Vivo) con il muscolo del detrusore rimosso per laccesso diretto al Suburothelium durante il riempimento della vescica (Video) | JoVE Journal

Un modello di vescica murine decentralizzato (Ex Vivo) con il muscolo del detrusore rimosso per l'accesso diretto al Suburothelium durante il riempimento della vescica

Esplora altri video