Name: Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dellRNA a singola cellula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Impara l'isolamento di microglia da regioni specifiche dell'emisfero cerebrale di topi adulti per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Questo metodo consente di analizzare l'eterogeneità funzionale delle cellule immunitarie cerebrali.

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Ringraziamo Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno e Spyros Darmanis per il loro aiuto durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo anche lo Stanford Shared FACS Facility, in particolare Meredith Weglarz e Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart di Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) per il loro grande supporto per le riprese. Questo lavoro è finanziato dalla Fondazione JPB e dalla Fondazione Vincent J. Coates.

Tutte le procedure che coinvolgono roditori sono conformi alle linee guida della Stanford University, che rispettano le leggi e le politiche nazionali e statali. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal gruppo amministrativo della Stanford University sulla cura degli animali da laboratorio.
 NOT:</</c0> Tutte le composizioni di soluzioni e buffer sono disponibili nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione il giorno dell'isolamento cellulare
<ol><li>Preparare i seguenti reagenti e raffreddarli sul ghiaccio: medio A (50 mL), buffer di smistamento cellulare ad attivazione magnetica (30 mL), buffer FACS (25 mL), salina con buffer fosfato (PBS; 30 mL), DNase (320 zL) e inibitore di RNase (30 l). NOT:</</c0> I volumi qui forniti sono sufficienti per isolare microglia da 4 regioni cerebrali (ad esempio, corteccia, cervelletto, ippocampo e striato) di un singolo emisfero cerebrale del topo. Scalabilità verticale se vengono utilizzati più tessuti.</li>
	<li>Mettete quattro omogeneizzatori puliti da 2 mL sul ghiaccio e aggiungete 2 mL di mezzo A con 80 gradi di DNase (12.500 unità/mL) e 5 luna di inibitore di RNase in ogni omogeneizzatore Dounce. Raffreddare i pistoni in tubi da 15 mL.</li>
	<li>Etichettare quattro piatti Petri da 6 cm con regioni cerebrali per la raccolta dei tessuti e aggiungere 200 l di mezzo freddo A in ogni piatto sul ghiaccio. Aggiungere circa 5 mL di mezzo A in un piatto Petri di 6 cm per la dissezione. NOT:</</c1> Prima dell'uso, assicurarsi che tutti i reagenti siano sterili e adatti per applicazioni di RNA. Gli utensili da banco e dissezione devono essere puliti e spruzzati con la soluzione di decontaminazione RNase (Tabella dei materiali).</li>
</ol>2. Dissezione della Regione del Cervello
 NOT:</</c0> Questo passaggio dovrebbe richiedere 30 min.
<ol><li>Iniettare nel peritoneo di un topo da giovane a stamiche da giovane a xilometro (>1 mese di vita). NOT:</</c0> Un topo maschio è usato qui per illustrazione, ma entrambi i sessi sono adatti.</li>
	<li>Attendere 5 min e pizzicare una zampa posteriore per garantire la mancanza di retrazione.</li>
	<li>Utilizzare immediatamente un ago da 26 G x 3/8 per eseguire la perfusione transcardiale con 20-30 mL di PBS ghiacciato fino a quando il buffer non si esaurisce senza sangue visibile.</li>
	<li>Decapitare il topo con un paio di forbici chirurgiche. Utilizzare piccole forbici per tagliare aprire la pelle per esporre il cranio sottostante, e poi tagliare attraverso la sutura sagittale, sutura lambdoidal e sutura coronale. Utilizzare pinze per tirare fuori entrambi i lati dell'osso parietale e dell'osso interparietale senza danneggiare il tessuto, e spostare con attenzione il cervello nella dissezione piatto Petri con mezzo A.</li>
	<li>Utilizzare una lama pre-raffreddata per tagliare il cervello attraverso la linea mediana in due emisferi. NOT:</</c1> Le quattro regioni cerebrali qui descritte da un singolo emisfero producono un numero sufficiente di microglia per applicazioni RNA-seq singole o sfuse. L'altro emisfero può essere utilizzato per l'immunostochimica o l'RNA nella convalida in situ.</li>
	<li>Separare il cervelletto dal lobo corticale e dal tronco encefalico con #55 pinze e trasferire il tessuto in un piatto Petri di raccolta.</li>
	<li>Utilizzare #55 pinze per sezionare con attenzione l'ippocampo e lo striato dalla corteccia e trasferire ogni tessuto in un piatto Petri di raccolta.</li>
</ol>3. Dissociazione dei tessuti meccanici
 NOT:</</c0> Mantenere le cellule e reagenti fresco tutto il tempo tranne durante le fasi di colorazione. Questo passaggio dovrebbe richiedere 30 min.
<ol><li>Tritare ogni tessuto cerebrale con una lama di rasoio in pezzi <1 mm3 fini.</li>
	<li>Utilizzare 1 mL pipette (con punte tagliate) per trasferire i pezzi di tessuto negli omogeneizzatori Dounce pre-raffreddati, ciascuno contenente 2 mL di media A con inibitore DNase e RNase.</li>
	<li>Omogeneizzare il tessuto ruotando lentamente il pistone dentro e fuori l'omogeneizzatore dounce per 6-10 colpi completi, fino a quando non sono presenti pezzi visibili. NOT:</</c1> Douncing uccide i neuroni e la maggior parte delle altre cellule gliali, ma lasciare le cellule microgliali piuttosto intatte. Sia l'insufficiente che l'esagerazione possono portare a un basso rendimento delle cellule.</li>
	<li>Trasferire i tessuti dissociati in tubi da 50 mL attraverso ceppi di 70 m.</li>
	<li>Sciacquare ogni omogeneizzatore e pistone Dounce con un totale di 6 mL di mezzo freddo A e filtrare la soluzione di risciacquo attraverso lo stesso colino nel tubo corrispondente.</li>
	<li>Trasferire le sospensioni a singola cella (circa 8 mL ciascuna) in tubi conici da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi con freno 5.</li>
</ol>4. Rimozione della mielina
 NOT:</</c0> Questo passaggio dovrebbe richiedere 60 min.
<ol><li>Preparare 1 colonna di esaurimento di grandi dimensioni (LD) (per la corteccia) e 3 colonne di selezione ampia (LS) (per le altre 3 regioni) in un separatore magnetico (Tabella dei materiali). Risciacquare ogni colonna con 3 mL di buffer MCS.</li>
	<li>Una volta terminata la centrifuga, pipetta fuori e scartare il supernatale senza disturbare il pellet. Per i tessuti della corteccia e del cervelletto, risospendere le cellule in buffer MCS da 850 litri con 1,8 gradi di inibitore di RNase. Per i tessuti ippocampo e striato, risospendere le cellule in 400 - L di buffer MCS con 0,9 . NOT:</</c1> Le colonne (LD vs LS) e il volume utilizzato per la sospensione sono ottimizzati in base alla quantità di mielina presente nel tessuto. Se altre regioni del cervello sono sapientemente, queste condizioni potrebbero essere necessario regolare a seconda delle dimensioni del tessuto e quanto mielina può esistere. L'efficacia della rimozione della mielina può essere stimata al passo 4.9.</li>
	<li>Aggiungete 100 l di perline di rimozione della mielina ciascuna nelle cellule della corteccia e del cervelletto e aggiungete 50 -L di rimozione della mielina ciascuna nelle cellule dell'ippocampo e dello striato.</li>
	<li>Mescolare delicatamente le cellule con perline e incubare i tubi sul ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Portare il volume del tubo con cellule corticali a 2 mL con buffer MCS, e tutti gli altri a 1 mL (cioè, aggiungere 1 mL per le cellule corticali; 500 L per le cellule ippocampali e striacali; non c'è bisogno di aggiungere buffer alle cellule cerebellari).</li>
	<li>Una volta che le colonne sono vuote di tampone di risciacquo, posizionare un tubo da 15 mL sotto ogni colonna. Caricare le celle corticali (2 mL) nella colonna LD e tutte le altre (1 mL ciascuna) sulle colonne LS. Utilizzare immediatamente 1 mL di buffer MCS ciascuno per lavare i tubi originali e caricare la soluzione sulle colonne corrispondenti.</li>
	<li>Lavare la colonna LD una volta con 1 mL di buffer MCS e lavare ogni colonna LS due volte con 1 mL di tampone MCS ogni lavaggio. Continuare a raccogliere la soluzione di flusso attraverso durante il lavaggio.</li>
	<li>Filtrare le cellule in tubi FACS rotondi attraverso i tappi del colino da 35 m. NOT:</</c2> Ogni tubo dovrebbe raccogliere circa 4 mL di sospensione a cella singola impoverito di mielina.</li>
	<li>Facoltativamente, prendere 10 l della sospensione cellulare e mescolare con 10 .L di 0,4% soluzione di trypan blu. Esaminare le cellule al microscopio a campo luminoso 10 volte per stimare la resa, il tasso di sopravvivenza e il livello di mielina residua. NOT:</</c3> Una preparazione di successo dovrebbe generare oltre il 90% di cellule vive (di forma rotonda ed escludendo il colorante blu) con poco o nessun detriti di mielina.</li>
	<li>Celle di pellet nei tubi FACS a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, con freno 5. Versare lentamente supernatali e tamponare il bordo del tubo su carta velina. Risospendere le cellule in ogni tubo con 300 l di tampone FACS. NOT:</</c5> Se lo smistamento MCS è preferito, perline CD11b possono essere utilizzate per selezionare microglia e altre cellule mieloidi dopo la rimozione della mielina. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per lo scRNA-seq non a base di piastra e per l'RNA-seq sfuso. L'avvertenza di questo approccio alternativo è che le perline CD11b non separano microglia da altre cellule immunitarie correlate che sono anche positive per questo antigene.</li>
</ol>5. Colorazione per lo smistamento delle celle attivato dalla fluorescenza
 NOT:</</c0> Questo passaggio dovrebbe richiedere 40 min.
<ol><li>Aggiungere 5 -L di topo Fc recettori blocco reagente (Tabella dei materiali) in ogni tubo. Incubare per 5 min sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungete 1 - L di CD45-PE-Cy7 e 1 - L di CD11b-BV421 in ogni tubo. NOT:</</c1> Possono essere utilizzati anticorpi con altri fluorofori coniugati. È inoltre possibile includere anticorpi contro TMEM119, un marcatore specifico per la microglia omeostatica9,ma si consiglia di essere utilizzati insieme a CD45 e CD11b, perché alcune sottopopolazioni di microglia possono perdere l'espressione superficiale di TMEM119.</li>
	<li>Incubare i tubi su uno shaker per 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di tampone FACS per lavare.</li>
	<li>Cellule di Pellet a 4 gradi centigradi, 400 x g per 5 min. versare lentamente supernatali e tamponare il bordo del tubo su carta velina. Risospendere le cellule in ogni tubo utilizzando 400 l di TAC tampone con 1 L di inibitore di RNase e 0,5 L di propidio iodide (PI, 1:1,000 diluizione).</li>
</ol>6. Ordinamento FACS indice
 NOT:</</c0> Questo passaggio dovrebbe richiedere 1 h.
<ol><li>Seguendo la procedura FACS standard, disegnare cancelli in base a dispersione (esclusi detriti), singole cellule, cellule vive (PI negativo), microglia e cellule mieloidi (CD45,CD11b). NOT:</</c2> Le cellule microgliali tipiche esprimono CD45 a livelli inferiori rispetto ad altri macrofagi associati ai confini, come i macrofagi perivascolari e meningei, e quindi gating su CD45 basso CD11b- dovrebbe essere sufficiente se il focus della ricerca sono profili di espressione genica in queste microglia classiche1,2. Tuttavia, alcuni sottoinsiemi di microglia possono avere una maggiore espressione cd45 e questo è particolarmente vero durante lo sviluppo o in condizioni di malattia. Per garantire un'analisi imparziale dell'espressione genica microgliale, i immunofenotipi alti e CD45 sono registrati tramite l'ordinamento degli indici ed entrambe le popolazioni raccolte per il sequenziamento e l'analisi a valle. Inoltre, l'espressione superficiale di TMEM119 può essere utilizzata per indirizzare la popolazione microgliale omeostatica (cfr. passo 5.2) e analizzata insieme ai livelli di CD45 e ai risultati del sequenziamento.</li>
	<li>Ordinare le microglie singole (con un ugello di 100 m) in piastre di reazione a catena di polimerasi 96-well (PCR), contenenti 4 l'lofilisi tamponare ogni pozzo (vedere il protocollo pubblicato14 per i dettagli). NOT:</</c8> Il mix di RNA spike-in (Tabella dei materiali) del Consorzio esterno per il controllo dell'RNA (ERCC) può essere aggiunto a 1:2,4 x 107 nel buffer di lisi per il controllo della qualità e la normalizzazione2.</li>
	<li>Vorticare brevemente le piastre e girare verso il basso utilizzando una centrifuga panca-top.</li>
	<li>Congelare immediatamente i campioni sul ghiaccio secco. Conservare le piastre a -80 gradi centigradi fino alla preparazione della biblioteca. NOT:</</c12> In alternativa, più cellule possono essere raccolte in tubi da 1,5 mL con buffer di estrazione dell'RNA per RNA-seq sfuso. Secondo l'esperienza degli autori, 3.000 cellule sono sufficienti per generare librerie di buona qualità seguendo il protocollo pubblicato2,14.</li>
</ol>7. Preparazione della libreria di sequenziamento di RNA a cella singola
 NOT:</</c0> Qui, il protocollo pubblicato14 è seguito per generare librerie scRNA-seq con l'aiuto della robotica di movimentazione dei liquidi e alcune modifiche. In questo articolo, la procedura viene descritta solo brevemente e le differenze vengono evidenziate. La lavorazione simultanea di 4 piastre richiede circa 2,5 giorni.
<ol><li>Scongelare le piastre sul ghiaccio ed eseguire la trascrizione inversa con il primer Oligo-dT30VN (nel buffer di lisi) per generare cDNA con riciclati termici (Tabella 1): 42 C 90 min; 70 s 5 min; attesa a 4 gradi centigradi. Quindi amplificare cDNA con un ulteriore passo di digestione di eonucleale all'inizio (Tabella 2) utilizzando il mix master PCR e primer in situ PCR (ISPCR) ( Tabelladei materiali) e la seguente condizione pcR: 37 . 95 C 3 min; 23 cicli di 98 s C 20 s, 67 c 15 s, 72 c 4 min; 72 c 5 min.</li>
	<li>Purificare il cDNA utilizzando 18 l'l di perline magnetiche per pozzo (rapporto 0,7:1). Incubare la piastra su un supporto magnetico per 5 min e lavare i campioni due volte con l'80% di etanolo appena fatto, 80 l per ogni volta. Dopo aver asciugato la piastra per 15-20 min, elute cDNA con 20 l di tampone di eluizione per pozzo. NOT:</</c3> Per il controllo della qualità, utilizzare un analizzatore di frammenti (analisi dei frammenti di nuova generazione ad alta sensibilità , 1,6.000 bp) per controllare le distribuzioni delle dimensioni e le concentrazioni di cDNA, e solo ulteriori campioni di processo con uno striscio compreso tra 500,5.000 bp e superiore a 0,05 ng/L.</li>
	<li>Per generare librerie, mescolare 0,4 l di ogni campione di cDNA con 1,2 di reagenti di tagmenttazione Tn5 dal kit di preparazione della libreria (Tabella dei materiali) in una piastra di 384 pozzetti con l'aiuto di una macchina di tubi nanoliteri, a 55 c 10 min. NOT:</</c5> In questo caso, viene aggiunto 1/12,5 del volume di reazione suggerito (5 campione L e 15 l di reagenti di tagmentation) al fine di ridurre i costi e nel frattempo aumentare la produttività. Una macchina di pipettatura nanolitera (Tabella dei materiali) viene utilizzata per trasferire reagenti (questo e seguendo passaggi) da e a 384 pozze.</li>
	<li>Aggiungete 0,4 l di buffer di neutralizzazione per fermare la reazione di tagment a RT per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 384 indici (Tabella dei materiali, 0,4 L in avanti e 0,4 ll di miscela PCR su campioni (2 ll ciascuno) e amplificare le librerie utilizzando la seguente condizione: 72 C 3 min; 95 s 30 s; 10 cicli di 95 gradi centigradi, 55 gradi centigradi 30 s, 72 c 1 min; 72 c 5 min.</li>
	<li>Raggruppare insieme tutte le singole librerie (prendere 1 X) dalla stessa piastra 384-po' e utilizzare perline magnetiche (Rapporto Tabella dei materiali, 0,7:1) per purificare le librerie raggruppate finali.</li>
	<li>Utilizzare un fluorometro (Tabella dei materiali) per misurare le concentrazioni e un bioanalisi ( Tabella deimateriali) per esaminare le distribuzioni delle dimensioni delle librerie raggruppate prima del sequenziamento. Puntare la profondità di sequenziamento a 1 milione di letture non elaborate per cella.</li>
	<li>Seguire le procedure bioinformatiche standard per filtrare e tagliare le letture di sequenziamento ed eseguire l'allineamento2. Utilizzare la tabella di conteggio e i metadati come input per eseguire l'analisi del clustering con il pacchetto Seurat15.</li>
</ol>

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<li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li>
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<li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109(2018).</li>
<li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Microglia interagiscono attivamente con altri tipi di cellule nel SNC, e sono molto sensibili agli stimoli ambientali. Al fine di ridurre al minimo le risposte infiammatorie e i cambiamenti aberranti nella loro espressione genica durante il processo di isolamento, questo protocollo è stato semplificato da un metodoprecedentementepubblicato 9 ed è ora adatto per isolare la microglia da più regioni di un singolo emisfero cerebrale del topo in parallelo. I tessuti e i reagenti sono tenuti a temperatu...

Le microglia, che rappresentano il 5%-10% di tutte le cellule neurali, sono macrofagi residenti sparsi in tutto il sistema nervoso centrale (SNC)1. Protetto dietro barriera emato-encefalica, microglia tipica in un cervello adulto sano contengono molti processi fini che si estendono rapidamente e si ritraggono per interagire con i neuroni e altre cellule gliali nel parenchyma. La microglia può anche adottare la morfologia ameboide associata ad una maggiore funzione fagocitica durante specifiche fasi di sviluppo o su sfide immunitarie in lesioni e malattie1,2,3,4. Recenti scoperte entusiasmanti hanno chiaramente dimostrato che le microglia non sono affatto astanti passivi a segnali derivati dal cervello o patologici, ma svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo cerebrale e dell'omeostasi, ad esempio, sostenendo la sopravvivenza neuronale, potando sinapsi immature, promuovendo la differenziazione delle cellule lignaggio oligodocito e l'asgiogenesi1 . Man mano che le funzioni della microglia sono chiarite, l'eccitazione è ulteriormente alimentata da studi di genetica umana, che hanno dimostrato che molti geni del rischio di malattie neurodegenerative, come TREM2, sono prevalentemente o esclusivamente espressi da microglia5,6,7. Data la loro importanza nello sviluppo e nei plausibili ruoli guidati dalle malattie, recentemente è stato compiuto un enorme sforzo verso la nostra comprensione della regolazione genica microgliale e della funzione nella speranza di trovare nuovi bersagli terapeutici per le malattie neurodegenerative1,8.
Il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) consente una caratterizzazione imparziale dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, che a sua volta guida gli scienziati a studiare le funzioni geniche nelle reti cellulari dense7. L'RNA-seq era stato fatto per lo più su campioni sfusi, portando alla scoperta di una firma del gene microgliale omeostatica che li distingue da altre cellule neurali e immunitarie9. Tuttavia, un tale approccio potrebbe trascurare le differenze molecolari e funzionali tra le microglia, in particolare quelle temporanee presenti in fase di sviluppo o associate all'invecchiamento e alla malattia. Infatti, RNA-seq unicellulare (scRNA-seq) offre la sensibilità e la risoluzione che hanno rivoluzionato il campo rivelando l'eterogeneità della microglia precedentemente sottovalutata in una varietà di contesti2,3,10. Inoltre, a causa della presenza di altre cellule immunitarie simili all'interfaccia di circolazione del CNS, scRNA-seq fornisce informazioni che aiutano la progettazione di nuovi strumenti per separare e sezionare funzionalmente queste cellule correlate con poca conoscenza precedente2,11.
È stata inventata una vasta gamma di piattaforme scRNA-seq, ognuna adatta per determinate applicazioni12. In generale, i metodi basati sulle goccioline, come 10x Genomica, sono più elevati in termini di produttività con (decine di) migliaia di cellule sequenziate in ogni esecuzione e sono meno selettivi per l'input che può contenere popolazioni di cellule miste che richiedono un'ampia categorizzazione. I metodi a base di piastre forniscono una maggiore sensibilità e profondità di lettura13,14, di solito mirando a popolazioni specifiche dallo smistamento delle cellule per rivelare sottili differenze o trascrizioni rare. Data la piccola percentuale di cellule microgliali, in particolare quelle sottopopolazioni associate allo sviluppo o alla malattia, tra tutti i tipi di cellule SNC, è spesso auspicabile isolare la microglia da una specifica regione di interesse e ottenere informazioni trascrittomiche profonde e complete per comprenderne l'eterogeneità.
Qui, forniamo dettagli su come isolare microglia da diverse regioni del cervello del topo sezionate da un singolo emisfero, che vengono utilizzate per l'RNA-seq a singola cellula (o alla rinfusa) seguendo una procedura di preparazione della libreria semi-automatica basata su lamiere. L'altro emisfero può quindi essere utilizzato per la convalida istologica. Semplificato da un metodoprecedentementepubblicato 9 , questo protocollo di isolamento mira a massimizzare la resa da piccole quantità di materiali di partenza, e nel frattempo mantenere profili di espressione genica microgliale endogeni. Utilizziamo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per arricchire la microglia (o altre cellule immunitarie correlate di interesse) in piastre di 96 pozze e diimentare i volumi di reagenti per la preparazione della biblioteca al fine di aumentare la produttività. Mettiamo in evidenza questa piattaforma scRNA-seq sensibile, anche se possono essere applicate altre strategie basate su piastre. Questo metodo può essere facilmente adattato per isolare microglia da altri tessuti sezionati, come lesioni o foci di malattia, e l'età del topo può variare in quasi tutti gli stadi postnatali. L'isolamento efficiente della microglia regionale per gli studi sulla trascrittomica a una cellula faciliterà una migliore comprensione delle loro funzioni in materia di salute e malattia.

<table><tbody><tr><td>5 M Betaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B0300-5VL</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP miscela</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R0192</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Cat</td><td># 15575020</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks' Soluzione salina bilanciata</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific Cat</td><td># 15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td><td>Kapa Biosciences</td><td>Cat# KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL, con tappo del filtro</td><td>cellulare Corning</td><td>Cat# 352235</td><td></td></tr><tr><td>AATI, kit di analisi dei frammenti NGS ad alta sensibilità (1 bp &ndash; 6.000 bp)</td><td>Advanced Analytical</td><td>Cat# DNF-474-1000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A8806</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>Cat# LS002007</td><td>Soluzione di lavoro: 12500 unità/ml</td></tr><tr><td>DTT, grado molecolare</td><td>Promega</td><td>Cat# P1171</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indici)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indici)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2002</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indici)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2003</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indici)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Esonucleasi (5 U/&mu; l)</td><td>New England BioLabs</td><td>Cat# M0262S</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat# 553142</td><td></td></tr><tr><td>Perline per la rimozione della mielina</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>Cat# 130-096-433</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Kit di preparazione del campione di DNA</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 cicli)</td><td>Illumina</td><td>Cat# 20024907</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( 10X), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 70011044</td><td></td></tr><tr><td>Perline PCRClean DX</td><td>Aline Biosciences</td><td>Cat# C-1003-50</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Thermo Fisher Scientific Cat</td><td># P3566</td><td>Colorazione: 1:1000</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermal Fisher Scientific</td><td>Cat# Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale di ratto anti topo/umano CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>Gatto# 101236; RRID: AB_11203704</td><td>Colorazione: 1:300</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td><td>Colorazione: 1:300</td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi ricombinante</td><td>Takara Bio</td><td>Cat# 2313B</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Trascrittasi inversa (100 U/&mu; l)</td><td>Clontech</td><td>Cat# 639538</td><td>Contenente 5x</td></tr> <tr><td>Oligonucleotidi tampone strong</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &mu; M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" è per forribobasi e "+" è per una base LNA)</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS tampone</td><td></td><td></td><td>Ricetta: 1% FBS filtrato sterile, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td></tr><tr><td>MCS tampone</td><td></td><td></td><td>Ricetta: 0,5% BSA filtrato sterile, 2 mM EDTA in 1X PBS</td></tr><tr><td>Medium A</td><td></td><td></td><td>Ricetta: 15 mM HEPES, 0,5% glucosio in 1X HBSS senza rosso fenolo</td></tr><tr><td>Plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 pozzetti Rigi-Plate PCR Micropiastre, Axygen Scientific</td><td>VWR</td><td>89005-556</td><td></td></tr><tr><td>Piastre PCR a 96 pozzetti</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Others</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Dounce, 2 ml</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td>357422</tr><tr><td>Colonna di esaurimento grande</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di selezione grande</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separatore QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RNAzap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Filtro (70 &mu; m)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di frammenti</td><td>Agilent</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito HTS robot di pipettaggio nanolitri</td><td>TTP Labtech</td><td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorimetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'rna a singola cellula

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Come macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale, microglia controllano attivamente lo sviluppo cerebrale e l'omeostasi, e le loro disfunzioni possono guidare le malattie umane. Sono stati compiuti notevoli progressi per scoprire le firme molecolari della microglia omeostatica e le alterazioni della loro espressione genica in risposta agli stimoli ambientali. Con l'avvento e la maturazione delle metodologie genomiche unicellulari, è sempre più riconosciuto che la microglia eterogina può essere alla base dei diversi ruoli che svolgono in diverse condizioni di sviluppo e patologiche. Un'ulteriore dissezione di tale eterogeneità può essere ottenuta attraverso un isolamento efficiente delle microglia da una determinata regione di interesse, seguito da una profilazione sensibile delle singole cellule. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per il rapido isolamento della microglia da diverse regioni del cervello in un singolo emisfero certo adulto. Dimostriamo anche come utilizzare queste microglia ordinate per il sequenziamento profondo dell'RNA a cellule a base di piastre. Discutiamo l'adattabilità di questo metodo ad altri scenari e forniamo linee guida per migliorare il sistema per accogliere studi su larga scala.

Questo protocollo descrive un metodo per isolare e ordinare microglia da diverse regioni del cervello in un emisfero cerebrale perfuso adulto, seguito da scRNA-seq. Usiamo il douncing per creare sospensioni a singola cellula e anche come primo passo per arricchire la microglia. Insufficiente o sovradosso riduce la resa. Inoltre, cervelli di topi adulti contengono alti livelli di mielina, che può anche ridurre l'efficienza di selezione e la resa se non rimosso correttamente. Pertanto, esaminiamo la sospensione cellulare a...

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Questo metodo consente la cattura imparziale dell'espressione genica della microglia a un livello a singola cellula, che può aiutare a chiarire l'eterogeneità molecolare delle microglia in un cervello sano e mato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una procedura dettagliata per un rapido isolamento delle microglia da diverse regioni cerebrali e mostra come generare in modo efficiente la base di riproduzione delle librerie RA6 a cella singola per il sequenziamento profondo. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i buffer e le soluzioni necessari come delineato nel protocollo di testo e raffreddarli sul ghiaccio.Dopo aver eutanasiato e decapitato il topo, usa piccole forbici per aprire la pelle sulla testa per esporre il cranio sottostante. Quindi, tagliare la sutura sagittale, la sutura lambdoidale e la sutura coronale. Utilizzare le forcelle per estrarre entrambi i lati dell'osso parietale e dell'osso interparietale senza danneggiare il tessuto e spostare attentamente il cervello in una piastra di Petri di dissezione contenente il mezzo A.Utilizzando una lama pre-refrigerata, tagliare il cervello attraverso la linea mediana in due emisferi.Utilizzare l

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Il profilo dell'espressione dell'RNA in regioni cerebrali murine discrete richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Viene qui descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello sia la microdissezione assistita da corer tissutale. Il rendimento e la qualità dell'RNA totale ottenuti dai campioni risultanti confermano l'utilità del metodo delineato.

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

Il video dimostra una tecnica per isolare la microglia dalla corteccia del cervello di un topo adulto. In primo luogo, la corteccia subisce la segmentazione e l'omogeneizzazione per rimuovere i neuroni e altre cellule gliali, preservando la microglia. Successivamente, la sospensione cellulare viene esposta a microsfere magnetiche anti-mielina e a un campo magnetico, separando efficacemente le microglia e le cellule mieloidi dai detriti di mielina e dalle cellule contenenti mielina.

Isolamento della microglia dalla corteccia di un cervello di topo adulto

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

Questo protocollo descrive la preparazione dettagliata e a basso input del campione per il sequenziamento a nucleo singolo, compresa la dissezione dei gangli cervicali e stellati superiori del topo, la dissociazione cellulare, la crioconservazione, l'isolamento del nucleo e il codice a barre hashtag.

Isolamento del nucleo a basso ingresso e multiplexing con anticorpi con codice a barre dei gangli simpatici del topo per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Descriviamo un protocollo per isolare le cellule microgliali dall'ipotalamo del topo (o piccole strutture cerebrali equivalenti) utilizzando il cell sorting attivato magneticamente (MACS), in un tempo relativamente breve. La microglia ipotalamica selezionata con MACS può essere utilizzata per analisi ex vivo e può essere piastrata per eseguire saggi in vitro .

Isolamento della microglia ipotalamica dal cervello di topo adulto appena perfuso mediante smistamento cellulare attivato magneticamente  

Il presente protocollo descrive come isolare e purificare la microglia ippocampale primaria da topi adulti, seguito da istruzioni per condurre registrazioni di patch-clamp su cellule intere su queste cellule isolate acutamente.

Isolamento e registrazione con patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti

Questo protocollo combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per isolare e caratterizzare gli stati delle cellule microgliali nel cervelletto dei cervelli di topo postnatale precoce. Utilizza la dissociazione enzimatica, la centrifugazione Percoll e l'immunocolorazione per rivelare l'eterogeneità delle microglia e migliorare la comprensione del loro ruolo nello sviluppo e nella malattia cerebellare.

Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

Impara l'isolamento di microglia da regioni specifiche dell'emisfero cerebrale di topi adulti per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Questo metodo consente di analizzare l'eterogeneità funzionale delle cellule immunitarie cerebrali.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dellRNA a singola cellula (Video) | JoVE Journal

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

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