Innesto ingegnerizzato per la ricostruzione esofagea circonferenza nei ratti

La riparazione esofagea circonferenziale è tecnicamente impegnativa in un modello di ratto, rendendo necessario lo sviluppo di esofago ingegnerizzata dai tessuti che consente la rigenerazione della mucosa esofagea e del muscolo senza perdite di anastomosi esofagea. Abbiamo implementato un'impalcatura tubolare a due strati come modello pilota, costituita da nanofibra interna e un filamento esterno di stampa 3D in combinazione con un'anastomosi microvascolare per ridurre al minimo la perdita di saliva dopo il trapianto. La ricostruzione esofagea standard convenzionale è associata a una vasta gamma di complicazioni e morbilità.

Pertanto, l'ingegneria tissutale esofagea può essere una promettente strategia alternativa per lo sviluppo di modelli di esofago di un paziente nativo. La combinazione di impalcatura ibrida, coltivazione di bioreattori e un sistema di nutrizione orale può essere applicata a qualsiasi sistema che abbia un ambiente contaminato simile con la sua pressione meccanica continua. Inizia sterilizzando un'impalcatura di esofago stampata in 3D con un'esposizione di un'ora alla luce ultravioletta, un bagno di 10 minuti in etanolo e tre lavaggi con PBS.

Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare l'impalcatura tubolare a due strati in una piastra di coltura tissutale non aderente di 24 pozzetti e aggiungere delicatamente ma uniformemente uno per 10 alle sei cellule staminali mesenchimali umane derivate da adiposo per millilitro di matrice di membrana basale integrata con mezzo di crescita alla superficie interna dell'impalcatura. Utilizzare un sistema di bioreattore a flusso pulsatile per fissare saldamente l'impalcatura tubolare semi di cellule al supporto acrilico nella camera di coltura del bioreattore e aggiungere 500 millilitri di mezzo di crescita alla camera. Quindi, applicare 1 dyne per centimetro al quadrato della sollecitazione di taglio indotta dal flusso in un'atmosfera umida contenente il 5% di anidride carbonica.

Dopo cinque giorni, utilizzare un kit di dosaggio live/dead viability per determinare le risposte cellulari sulla superficie interna dell'impalcatura secondo i protocolli standard e immaginiamo le cellule con microscopia confocale. Prima di iniziare la procedura chirurgica, confermare la mancanza di risposta al riflesso del pedale nel ratto anestetizzato e posizionare l'animale in posizione supina su un drappo sterile. Utilizzare le tosaerba per rimuovere i capelli dal sito chirurgico e disinfettare la pelle esposta con BETADINE sequenziale e scrub al 70% di etanolo.

Per il posizionamento del tubo a T, fare un'incisione della pelle e del muscolo della linea mediana nell'addome del topo e utilizzare una lama bisturi per creare un orifizio di tre millimetri nella parete gastrica anteriore. Inserire la punta di un tubo a T in silicone nel sito del difetto per fissarlo alla parete dello stomaco e suturare attentamente il tubo al tessuto muscolare gastrico. Suturare la parete addominale con sutura 4-0 VICRYL.

Inserire con cura l'estremità distale del tubo a T impiantato attraverso il tunnel sottocutaneo nella parte posteriore del collo e utilizzare un angiocatetere per collegare un cappuccio di eparina all'estremità del tubo a T per evitare che il contenuto dello stomaco fluisco all'indietro. Quando il cappuccio è in posizione, utilizzare 4-0 suture di poliglactina per chiudere tutti gli strati della pelle addominale e posizionare il topo in una gabbia metabolica con monitoraggio fino alla piena reclinazione. Una settimana dopo il posizionamento del tubo a T, preparare il topo per l'intervento chirurgico come dimostrato.

Posizionare il topo al microscopio e fare un'incisione mediana anteriore del collo nella pelle disinfettata esposta. Separare i muscoli della cinghia per esporre la struttura tracheoesofagea. Isolare il lato sinistro dell'esofago dalla trachea.

Separare accuratamente la parte superiore dell'esofago dalla ghiandola tiroidea e utilizzare forbici chirurgiche per creare un difetto circonferenziale completo lungo cinque millimetri contenente tutti gli strati dell'esofago. Successivamente, inserire una sutura 9-0 tra il margine inferoposterior destro del residuo superiore dell'esofago e dell'impalcatura, e continuare a suturare da destra a sinistra tra il resto superiore dell'esofago e l'impalcatura per creare una microanastosi all'estremità superiore del difetto esofageo distale. Quindi, anastomosi l'impalcatura allo stesso modo del margine superiore del resto inferiore dell'esofago.

Una volta completate le anastomosi, posare il lembo della tiroide circostante sul sito trapiantato per garantire un apporto vascolare e un mantenimento stabile dell'innesto. Quindi, cucire il muscolo sottocutaneo e il tessuto cutaneo con una sutura 4-0 VICRYL e posizionare il topo in una gabbia metabolica su un dispositivo di riscaldamento a infrarossi con monitoraggio fino alla piena reclinazione. Dopo un'applicazione uniforme alla parete interna dell'impalcatura tramite iniezione, la matrice di membrana basale incorporata nelle cellule staminali mesenchimali umane dimostra la morfologia delle cellule staminali mesenchimali prevista come valutata mediante microscopia elettronica a scansione.

Dopo il trapianto esofageo in ratti con difetti esofagei circonferenziali completi come dimostrato, l'innesto è coperto da un lembo della ghiandola tiroidea per una fissazione stabile e fornitura vascolare al sito impiantato. I ratti trapiantati esofagei rimangono a 340 grammi fino a circa nove giorni dopo la procedura, a quel punto gli animali diminuiscono rapidamente di peso a causa di varie cause, con conseguente morte entro il giorno 15. Sebbene la maggior parte dei ratti sviluppi ostruzionismo non esofageo causato da bulbi piliferi, nel complesso non ci sono prove lorde di perforazione, perdite di anastomosi con fistola, accumulo di sieroma, formazione di ascessi o necrosi dei tessuti molli circostanti in qualsiasi animale sperimentale.

La ri epitelializzazione del sito di trapianto può essere confermata dalla colorazione dell'immunofluorescenza per la cheratina, e lo strato di collagene rigenerato e le fibre di elastina possono essere chiaramente osservati dalla colorazione tricromatica di Masson. La rigenerazione dello strato muscolare esofageo è anche evidenziata da un'abbondante neovascolarizzazione valutata dall'analisi immunoistochimica della desmina. Il successo di questa procedura si basa sul mantenimento stabile del tubo a T tramite fissazione dietro il collo per fornire nutrizione durante la ricostruzione esofagea.

Per superare la mortalità precoce tipica di questa procedura, la tecnologia organoide o di vascolarizzazione precoce potrebbe essere applicata a seguito dell'impianto esofageo per aiutare nella ricostruzione esofagea funzionale.