Name: Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Scopri come modellare la morte delle cellule di Purkinje nel cervelletto di topo usando colture di fette organotipiche. Questo metodo preserva l'architettura tissutale per studiare neuroprotezione e screening di farmaci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il lavoro di imaging è stato eseguito presso il Northwestern University Center for Advanced Microscopy generosamente supportato da NCI CCSG P30 CA060553 assegnato al Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Ringraziamo Sean McDermott per l'assistenza tecnica e il supporto e Maya Epstein per le illustrazioni disegnate a mano illustrate nella Figura 1.

Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati effettuati in conformità con il comitato di studi sugli animali della Northwestern University.
1. Preparazione prima delle colture di fette organotipiche di cerebellar
<ol><li>In un cappuccio cellulare spruzzato con 70% etanolo in anticipo, preparare 200 mL di mezzo di coltura in un filtro sottovuoto da 250 mL a portata di mano collegato a un ricevitore sterile. Aggiungere 100 mL di Basal Medium Eagle (BME), 50 mL di soluzione di sale bilanciato di Hanks (HBSS), 50 mL di siero di cavallo inattivato dal calore, 1 mL di 200 mM L-Glutamine (concentrazione finale 1 mM) e 5 mL di 200 g/L di glucosio (concentrazione finale 5 mg/mL). Filtrare sottovuoto il mezzo di coltura e tenerlo a 4 gradi centigradi per un massimo di un mese.</li>
	<li>Nell'armadio sterilizzato per la biosicurezza, estrarre una piastra di coltura a 6 pozzetti dal suo pacco. Riempire ogni pozzo con 1 mL di mezzo di coltura. Se un trattamento viene testato, aggiungere l'agente farmacologico al pozzo trattato e lo stesso volume di soluzione del veicolo per il pozzo di controllo. Nel presente studio, abbiamo aggiunto 1 /L di sterile 3 M KCl soluzione al pozzo trattato (30 mM finale) e 1 L di acqua sterile per i pozzi di controllo.</li>
	<li>Portare all'interno della cappa di coltura cellulare il numero necessario di inserti di coltura cellulare avvolti individualmente con membrana idrofila politetrafluoroetilene (PTFE) (dimensione del poro s 0,4 m). Srotolare con cura e togliere gli inserti di coltura cellulare con pinze sterili. Lasciali uno ad uno in un pozzo di una piastra di 6 pozze, evitando le bolle all'interfaccia tra la membrana di inserto e il mezzo di coltura cellulare. Lasciare gli inserti equilibrati nel mezzo in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, 5% di CO2 per almeno 2 h prima della coltura. NOTA: L'elicottero dei tessuti risiede permanentemente nella cappa di coltura cellulare.</li>
	<li>Preparare due becher da 200 mL, uno riempito con 150 mL di acqua sterile, e l'altro riempito con 150 mL 70% di etanolo. Immergere gli strumenti chirurgici nel bagno di etanolo 70% e poi in acqua prima di utilizzarli. NOTA: Non utilizzare strumenti chirurgici immediatamente dopo il contatto con l'etanolo.</li>
	<li>Disinfettare la lama a doppio taglio nel becher di etanolo 70%. Posizionarlo sul supporto della lama utilizzando pinze sterili e tenerlo in posizione utilizzando la chiave di morsetto della lama. Lasciare asciugare fino all'uso.</li>
	<li>Disinfettare il disco di plastica fornito con l'elicottero tissutale nel becher di etanolo 70%. Spruzzare il tavolo di taglio con 70% di etanolo prima di posizionare il disco su di esso. Lasciare asciugare fino all'uso.</li>
</ol>2. Dissezione e Cerebellar Organotypic Slice Cultures
<ol><li>Portare il cucciolo di topo all'interno della cappa di coltura cellulare per eseguire la dissezione.</li>
	<li>Decapitare rapidamente il cucciolo utilizzando forbici operative dritte (Figura 1A).</li>
	<li>Tenendo la testa del cucciolo per il naso con pinze adesive dritte, tagliare il cuoio capelluto utilizzando forbici dritte per gli occhi, partendo dall'estremità posteriore e andando laterale a linea mediana.</li>
	<li>Procedere in modo identico per il cranio. NOTA: Assicurarsi di puntare le punte della forbice verso l'esterno per evitare di danneggiare il cervelletto durante la dissezione.</li>
	<li>Estrarre il cervello e trasferirlo in un piatto di 60 mm pieno di HBSS freddo - 5 mg/mL di glucosio.</li>
	<li>Sezionare con cura il cervelletto utilizzando pinze sottili e dritte sterili (Figura 1B). Trasferirlo sul disco di plastica posto sul tavolo di taglio dell'elicottero dei tessuti utilizzando pinze sottili curve sterili.</li>
	<li>Orientare il tessuto ruotando il tavolo di taglio per eseguire sezioni parasagittali.</li>
	<li>Spostare il tavolo di taglio tirando la manopola di rilascio del tavolo a destra, in modo che la lama sia posizionata sul bordo del tessuto.</li>
	<li>Regolare lo spessore della fetta a 350 m e la velocità della lama a media.</li>
	<li>Accelera l'elicottero. Una volta che l'intero cervelletto è stato tagliato (Figura 1C), spegnere l'elicottero.</li>
	<li>Rimuovere il disco di plastica con pinze sterili.</li>
	<li>Portare con cura il disco di plastica vicino a un piatto di 60 mm contenente HBSS - 5 mg/mL di glucosio. Pipetta fredda HBSS 5 mg/mL di glucosio sul tessuto utilizzando una pipetta di trasferimento sterile per consentire la raccolta di fette di cerebellar nel piatto riempito tampone.</li>
	<li>Separare le fette cerebellari l'una dall'altra utilizzando una microsonda. Estrarre sezioni di buona qualità con la pipetta di trasferimento (si consiglia di utilizzare sezioni di tessuto che sono vicine al vermis) e lasciarle in un inserto di coltura cellulare pre-equilibrato (Figura 1D).</li>
	<li>Posizionare le fette di cerebellar sull'inserto di coltura cellulare utilizzando la microssonda, quindi rimuovere con attenzione l'eccesso di HBSS - 5 mg/mL di glucosio con la pipetta di trasferimento. NOTA: In questa fase il tessuto è estremamente tenero e soggetto a danni fisici. Il numero massimo di fette di cerebellari per inserto di coltura cellulare dipende dall'età dell'animale donatore. 6-8 fette possono essere coltivate per un animale P0-P4-vecchio, e 4-6 fette per gli animali di età superiore a P5.</li>
	<li>Mettere il piatto di coltura nell'incubatrice, cambiando completamente il mezzo ogni 2-3 giorni.</li>
	<li>Per valutare la sopravvivenza delle cellule Purkinje, le fette possono essere raccolte già 5 giorni in vitro. Per altri scopi, possono essere mantenuti nella cultura per diverse settimane (Figura 1F). NOTA: Nel caso di esperimenti di sopravvivenza cellulare Purkinje, non è necessario rinnovare il trattamento farmacologico quando si cambia il mezzo di coltura cellulare (Figura 1F).</li>
</ol>3. Immunofluorescenza
<ol><li>Estrarre la piastra 6-bene dall'incubatrice. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare, lavare l'inserto di coltura cellulare con 1x PBS e fissare le fette con soluzione di paraformaldeide fredda 4% per 1 h, con 1 mL sotto l'inserto di coltura cellulare e 500 L sopra l'inserto di coltura cellulare.</li>
	<li>Lavare gli inserti 4x 10 min con 1x PBS, con 1 mL sotto e 500 l sopra l'inserto, su uno shaker orbitale.</li>
	<li>Con un pennello, trasferire le fette del cerebellar da 1 inserto di coltura cellulare a 1 pozzetto di un 24-well pre-riempito con 1x PBS, 0.25% Triton X-100, e 3% BSA (PBS-TB), 500 l/po.</li>
	<li>Permeabilizzare e bloccare le fette per incubazione in PBS-TB per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare con anticorpi primari diluiti nella soluzione PBS-TB, durante la notte a 4 gradi centigradi, su uno shaker orbitale, 200 gradi centigradi/pozzo.</li>
	<li>Il giorno seguente, eseguire quattro lavamenti di 10 min con 1x PBS, su uno shaker orbitale, 500 l/po.</li>
	<li>Incubare con anticorpi secondari diluiti nella soluzione PBS-TB, due ore a temperatura ambiente, su uno shaker orbitale, e protetto dalla luce, 200 .</li>
	<li>Eseguire quattro lavamenti di 10 min con 1x PBS, su uno shaker orbitale, 500 l/po.</li>
	<li>Controstate le fette utilizzando Hoechst 33342, diluite in 1x PBS (2 g/mL), per 10 min a temperatura ambiente, protetto dalla luce, 500 gradi/pozzo.</li>
	<li>Montare le fette di cerebellar su un vetrino di microscopia con una pipetta di trasferimento. Lasciateli asciugare completamente l'aria, protetti dalla luce. Ri-umiliarli con 1x PBS e applicare un coverslip coperto coperto coperto con poche gocce di supporto di montaggio (80 dollari l). Evitare di fare bolle.</li>
	<li>Una volta che il supporto di montaggio è guarito, le sezioni cerebellari sono pronte per essere imagete.</li>
</ol>4. Imaging e quantificazione della sopravvivenza cellulare
<ol><li>Accendere il microscopio e i laser in base alle istruzioni del produttore e/o del nucleo di imaging.</li>
	<li>Avviare il software di acquisizione.</li>
	<li>Utilizzando un obiettivo 10X, individuare le fette di cerebellar non alterate che presentano 9-10 lobuli (di solito sezioni cerebellar vicino al vermis).</li>
	<li>Attivare l'acquisizione dello stack z. Definire l'intervallo dello z-stack per includere tutte le celle Purkinje presenti nella sezione cerebellar. Impostare una dimensione di passo di 2 m e avviare l'acquisizione. Salvare l'immagine acquisita nel formato del produttore del software di acquisizione per conservare i metadati associati.</li>
	<li>Aprire il file acquisito in ImageJ utilizzando ilplug-inBioformati 18 .</li>
	<li>Passare a Immagine > Stack > Progetto z... (Figura 2A).</li>
	<li>Scegliere Intensità massima nel menu a discesa Tipo di proiezione e fare clic su OK (Figura 2B).</li>
	<li>Verrà generata un'immagine 2D appiattita. Fare doppio clic sullo strumento Multipunto per visualizzare la finestra Strumento Punto. Deselezionare l'opzione Punti etichetta per semplificare la visualizzazione delle celle conteggiate. Quindi, fare clic direttamente su un soma di una cella Purkinje per iniziare a contare (Figura 1E). Il numero totale di celle conteggiate verrà indicato nella parte inferiore della finestra dello strumento Punto (Figura 3). NOTA: Di solito, è possibile quantificare almeno 3 sezioni non danneggiate contenenti 9-10 lobuli per inserto di coltura cellulare. Per valutare l'effetto neuroprotettivo di un agente farmacologico, devono essere eseguiti almeno 3 esperimenti indipendenti.</li>
</ol>

<ol><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886(2017).</li>
<li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures%2C+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li>
<li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifepristone+%28RU486%29+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li>
<li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures%3A+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li>
<li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li>
<li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture%3A+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li>
<li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li>
<li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+%28JNK%29+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li>
<li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li>
<li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985(2012).</li>
<li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin%3A+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li>
<li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li>
<li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells%27+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La coltura della fetta Cerebellar è un potente strumento per studiare la morte programmata delle cellule Purkinje durante lo sviluppo postnatale. Questa tecnica può essere utilizzata per vagliare rapidamente le molecole candidate per il loro potenziale neuroprotettivo. Il vantaggio principale è che l'impostazione è semplice e molto conveniente, e richiede solo un modesto investimento in attrezzature (un vibratome può costare fino a 3 volte più di un elicottero di tessuto). Inoltre, da 10 a 15 fette sane possono essere ge...

La modellazione in vitro è uno strumento essenziale nella ricerca biomedica. Consente agli sperimentatori di studiare e controllare strettamente meccanismi specifici in tipi di cellule limitate o in sistemi/organi isolati. La coltura delle fette organotipiche è una tecnica in vitro ampiamente utilizzata, specialmente nel campo delle neuroscienze1. Il metodo è stato inizialmente stabilito da Gàhwiler, che coltiva fette di cervello utilizzando la tecnica del tubo a rulli2e successivamente modificato da Yamamoto et al., che ha introdotto l'uso di una membrana microporosa per eseguire colture di fette corticali3. Rispetto alle colture cellulari primarie, le colture di fette organotipiche presentano il vantaggio di preservare la citoarchitettura del tessuto, così come le connessioni cellulari native nel piano della sezione dei tessuti.
Le fette organotipiche sono state coltivate da molte parti del sistema nervoso centrale, come l'ippocampo4, la corteccia5, lo striato6, il cervelletto4,7e il midollo spinale8,9, tra gli altri. Essi hanno dimostrato di essere un potente strumento negli studi di scoperta di farmaci10. Gli effetti delle molecole neuroattive possono essere valutati in molti modi: sopravvivenza e neurodegenerazione utilizzando analisi immunostaining e biochimiche, formazione di circuiti neuronali o interruzione mediante elettrofisiologia e live-imaging.
L'obiettivo di questo lavoro è quello di descrivere un metodo semplice per eseguire la coltura della sezione cerebellar organotipica, che è noto per essere un modello rilevante per imitare lo sviluppo cerebellar in vitro. In particolare, ci siamo concentrati sullo studio della morte per lo sviluppo cellulare di Purkinje. In vivo, le cellule Purkinje subiscono l'apoptosi durante la prima settimana postnatale, con un picco al giorno postnatale 3 (P3)11. Lo stesso modello si osserva nella coltura della fetta cerebellare, con i neuroni Purkinje che muoiono per apoptosi quando la cerebella viene prelevata da animali tra P1 e P8, con un picco al P34,12. L'uso delle colture di fette di cerebellare organotipiche ha permesso di identificare diverse molecole neuroprotettive7,13, oltre a comprendere parte dei meccanismi coinvolti in questa morte cellulare programmata14,15,16. Qui, descriviamo un protocollo basato sullo studio di Stoppini et al.17 in ippocampo, e adattato al cerrebelum da Dusart et al.4 Include una rapida dissezione e taglio della cerebella postnatale; affettare la coltura su un inserto di coltura cellulare contenente una membrana microporosa, con o senza trattamento neuroprotettivo; e l'immunofluorescenza per valutare la sopravvivenza neuronale.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 Asino anti-topo IgG anticorpo secondario</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>A21203</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle (BME)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>21010046</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza Classe II, Tipo A2</td><td>NuAire</td><td>NU-540-400</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Brush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Calbindina D-28K (CB-955)</td><td>Abcam</td><td>ab82812</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a CO2</td><td>NuAire</td><td>NU-5700</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Piastre per colture cellulari a 6 pozzetti a fondo piatto</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, 22 x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per medicazione, diritte</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8949</td><td></td></tr><tr><td>Lame a doppio taglio</td><td>Fisher Scientific</td><td>50949411</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 200 proof</td><td>Decon Labs, Inc</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per gli occhi, diritte</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8428</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-127</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina 100X</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>25030149</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di glucosio</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione salina bilanciata</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, tricloridrato, triidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo, inattivato termicamente, origine neozelandese</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9914528</td><td></td></tr><tr><td>Microsonde</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-850</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari Millicell</td> Unità filtranti sterili <td>monouso a flusso rapido Millipore Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene con membrana in PES, 250 mL</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di microscopio laser confocale Nikon A1R</td><td>Software</td> di <td></td><td></td>imaging</tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Acros Organics</td><td>41678-0010</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operative, dritto</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8403</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale Belly Dancer</td><td>IBI Scientific BDRLS0003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale, 60 mm con anello di presa</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012921</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale, 24 pozzetti</td><td>Falcon/Corning</td><td></td><td></td>353047</tr><tr><td>Pipette di trasferimento, sterili</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>13-711-21</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

La coltura delle fette organotipiche è un potente modello in vitro che imita le condizioni in vivo più da vicino rispetto alle colture cellulari primarie dissociate. Nello sviluppo postnatale, le cellule cerebellari Purkinje sono note per passare attraverso un periodo vulnerabile, durante il quale subiscono la morte cellulare programmata. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per eseguire la coltura della fetta di cerebellar organotypic del topo durante questo momento critico. Le fette sono ulteriormente etichettate per valutare la sopravvivenza delle cellule Purkinje e l'efficacia dei trattamenti neuroprotettivi. Questo metodo può essere estremamente prezioso per lo screening per nuove molecole neuroattive.

Come illustrato nella Figura 4, questo protocollo produce colture di fette di cerebellar organotipiche in cui la sopravvivenza delle cellule Purkinje può essere valutata seguendo i passaggi di immunofluorescenza e acquisizione di immagini. Le cellule Purkinje sono state etichettate con una combinazione di anticorpi antito-tono (diluizione 1/200) anti-tono anti-Calbindin (diluizione 1/200) e Alexa594 anti-tono (diluizione 1/300). La cucitura dell'immagine è stata eseguita automaticamente dal ...

Le colture di fette organotipiche sono un potente strumento per studiare i processi neurosviluppo o degenerativi/rigenerativi. Qui, descriviamo un protocollo che modella la morte del neurosviluppo delle cellule Purkinje nelle colture di fette di cerebellar di topo. Questo metodo può beneficiare la ricerca nella scoperta di farmaci neuroprotettivi.

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

La cultura delle fette organotipiche è un potente strumento per studiare i processi neurosviluppo e degenerativi o rigenerativi. Questa tecnica può essere utilizzata per schermare rapidamente le molecole candidate per il loro potenziale neuroprotettivo. Questo metodo imita da vicino le condizioni in vivo, rispetto alle colture cellulari primarie dissociate, poiché l'architettura del set tissutale e le connessioni cellule-cellule native sono conservate all'interno dei piani delle sezioni.Qui dimostriamo lo studio della morte cellulare di Purkinje nel cervelletto in via di sviluppo. Ma la cultura delle fette organotipiche è ugualmente adatta per modellare le malattie neurodegenerative in quasi tutte le regioni del sistema nervoso centrale. A dimostrare la procedura con Jennifer Rakotomamonjy sarà Sean McDermott, un tecnico del mio laboratorio.Prima di raccogliere le fette cerebellari, in un armadio di biosicurezza sterilizzato, riempire ogni pozzo di una piastra di coltura a sei pozzetti con un millilitro di mezzo di coltura filtrato sottovuoto e aggiungere l'agente farmacologico di interesse ai pozzi di trattamento e un volume uguale di veicolo ai pozzi di controllo. Utilizzando forcep sterili, posizionare un inserto del filtro a membrana PTFE di dimensioni dei pori di 0,4 micrometri in ogni pozzo, facendo attenzione a evitare bolle all'interfaccia di ogni membrana e mezzo, ed equilibrare il mezzo in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% per due ore. Per raccogliere il cervelletto, utilizzare le alessamenti di medicazione dritta per afferrare la testa del cucciolo per il naso e utilizzare forbici per gli occhi dritti per aprire il cuoio capelluto dall'estremità posteriore lateralmente alla linea mediana.Tagliare il cranio allo stesso modo, puntando le punte della forbice verso l'esterno per evitare di danneggiare il cervelletto, e utilizzare una spatola per trasferire il cervello su un piatto da 60 millimetri contenente HBSS freddo e cinque milligrammi per millilitro di glucosio. Utilizzare le forcelle di medicazione dritta per sezionare attentamente il cervelletto e utilizzare forcette fini curve sterili per posizionare il tessuto su un disco di plastica sul tavolo di taglio di un elicottero tissutale. Ruotare la tabella di taglio per orientare il tessuto per consentire l'acquisizione di sezioni parasagittali e tirare la manopola di rilascio del tavolo a destra per spostare il tavolo di taglio fino a quando la lama non è posizionata sul bordo del tessuto.Quindi regolare lo spessore della fetta a 350 micrometri e la velocità della lama su medio e avviare l'elicottero. Quando l'intero cervelletto è stato tagliato, spegnere l'elicottero. Utilizzando forcep sterili, tenere il disco su un nuovo piatto da 60 millimetri.Utilizzare una pipetta di trasferimento per lavare HBSS più glucosio sul disco in modo che le fette cadano nel piatto. Quindi, toccando i campioni il più minimamente possibile, utilizzare una microsoperta per separare le fette. Utilizzare la pipetta di trasferimento per selezionare sezioni del cervelletto vicino ai vermi su singoli inserti di coltura cellulare nella piastra a sei pozzi e utilizzare la microsoperta per posizionare le fette al centro di ogni inserto.Una volta posizionate tutte le fette, aspirare attentamente l'HBSS in eccesso più il glucosio e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare. Per la colorazione dell'immunofluorescenza, rimuovere il supernatante da ogni pozzo e lavare gli inserti con PBS. Fissare le fette con un millilitro di paraformaldeide fredda al 4% nel pozzo di ogni inserto e 500 microlitri sopra ogni inserto per un'ora.Al termine della fissazione, lavare gli inserti quattro volte per 10 minuti con un millilitro di PBS fresco sotto ogni inserto e 500 microlitri di PBS fresco sopra ogni inserto per lavaggio su uno shaker orbitale. Precompilare ogni pozza di una piastra da 24 porri con 500 microlitri di PBS-TB e utilizzare un pennello per trasferire le fette cerebellari da ogni inserto di coltura cellulare in singoli pozzi di una piastra da 24 porri. Permeabilizzare e bloccare le fette a temperatura ambiente per un'ora.Alla fine dell'incubazione, etichettare le cellule con 200 microlitri dell'anticorpo primario di interesse diluito in PBS-TB per pozzo durante la notte a quattro gradi Celsius sullo shaker orbitale. La mattina successiva, lavare le fette quattro volte per 10 minuti e 500 microlitri di PBS fresco per lavaggio sullo shaker, prima di etichettare i campioni con gli anticorpi secondari coniugati al fluoroforo appropriati per due ore a temperatura ambiente sullo shaker, protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione, controsostenere le sezioni con 500 microlitri di una macchia nucleare appropriata per pozzo per 10 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce.E utilizzare una pipetta di trasferimento per montare le fette su vetrini. Quindi lasciare asciugare completamente le sezioni prima di reidratare con PBS e montare i tessuti con coverlips rivestiti con circa 80 microlitri di mezzo di montaggio. Una volta che il mezzo di montaggio si è polimeritato, le sezioni cerebellari sono pronte per essere immagini.Al sesto giorno postnatale, la sopravvivenza delle cellule di Purkinje è bassa nei campioni di controllo, coerentemente con la loro nota finestra di vulnerabilità. La sopravvivenza aumenta man mano che l'animale donatore invecchia e esce da questo periodo critico. Il trattamento delle fette cerebellari con un'alta concentrazione di cloruro di potassio si traduce in un'induzione riuscita della loro depolarizzazione e sopravvivenza.Per ottenere risultati coerenti e riproducibili, è fondamentale selezionare sezioni cerebellari sane e eseguire la configurazione delle impostazioni cultura nel modo più efficiente possibile. Le applicazioni post-coltura vanno oltre l'immunofluorescenza. Poiché le fette organotipiche possono essere utilizzate per studi di espressione delle proteine del genoma e per monitorare l'attività del circuito neuronale usando l'elettrofisiologia e l'imaging dal vivo di calcio.

purkinje-cell-survival-in-organotypic-cerebellar-slice-cultures

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo metodo descrive la generazione di organotipica culture cerebellare e l'effetto di alcuni stimoli apoptotici sulla vitalità dei diversi tipi di cellule del cervelletto.

Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

Presentiamo un protocollo che permette di visualizzare e valutare quantitativamente la morfologia dell'albero dendritico delle cellule di Purkinje singole coltivate in culture fetta organotipiche cerebellari. Questo protocollo ha lo scopo di promuovere gli studi sui meccanismi di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje.

L&#39;analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

Questo video illustra una tecnica per ottenere fette organotipiche cerebellari dal cervello di un cucciolo di topo e coltivare le fette in terreni integrati con nutrienti e fattori di crescita per imitare lo sviluppo cerebellare in vitro. Inoltre, specifiche fette cerebellari vengono trattate con un composto di prova e la capacità neuroprotettiva del composto viene analizzata utilizzando una tecnica di colorazione in immunofluorescenza.

Analisi della sopravvivenza delle cellule di Purkinje in colture organotipiche di fette cerebellari

Viene descritta una tecnica per studiare le cellule NG2 e gli oligodendrociti utilizzando un sistema di coltura a fette del proencefalo e del cervelletto.  Questo metodo consente di esaminare le dinamiche di proliferazione e differenziazione delle cellule all'interno della linea degli oligodendrociti, dove l'ambiente extracellulare può essere facilmente manipolato mantenendo la citoarchitettura tissutale.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

Qui presentiamo un metodo per preparare organotipiche fetta culture dal cervelletto di topo e guaina mielinica colorazione da immunohistochemistry adatto per studiare i meccanismi della mielinizzazione e remyelination nel sistema nervoso centrale.

Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

Condurre esperimenti in vitro per riflettere le condizioni in vivo nel modo più adeguato possibile non è un compito facile. L'uso delle colture cellulari primarie è un passo importante verso la comprensione della biologia cellulare in un intero organismo. Il protocollo fornito descrive come crescere e coltivare neuroni cerebellari embrionali del topo.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

Questo protocollo descrive un sistema di coltura dinamica per produrre aggregati di dimensioni controllate delle cellule staminali pluripotenti umane e stimolare ulteriormente la differenziazione negli organoidi cerebellari in condizioni chimicamente definite e senza alimentatori utilizzando un bioreaettore monouso.

Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

In questo articolo, forniamo un metodo riproducibile per generare e mantenere a lungo termine fette organotipiche del midollo spinale trapiantate con cellule staminali neurali come modello ex vivo per testare terapie di sostituzione cellulare.

Coltura a lungo termine di fette organotipiche del midollo spinale di topo come piattaforma per la convalida del trapianto di cellule nella lesione del midollo spinale

Le cellule cerebellari di Purkinje (PC) sono particolarmente sensibili alle carenze nella risposta al danno del DNA. Viene presentato un protocollo per la valutazione visiva della dinamica della risposta del PC al danno al DNA, che prevede la colorazione di catene poli(ADP-ribosio) legate alle proteine all'interno di colture organotipiche cerebellari.

Visualizzazione della risposta al danno al DNA nelle cellule di Purkinje utilizzando colture organotipiche cerebellari

Scopri come modellare la morte delle cellule di Purkinje nel cervelletto di topo usando colture di fette organotipiche. Questo metodo preserva l'architettura tissutale per studiare neuroprotezione e screening di farmaci.

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Esplora altri video