Isolamento e caratterizzazione delle vescicoli extracellulari prodotti da micobatteri a limite di ferro

Questo metodo consente di coltivare mycobacterium tuberculosis in condizioni di ferro rigide e purificare le vescicole di membrana dal filtrato a bassa coltura del ferro. Poiché la limitazione del ferro è nota per stimolare la produzione di vescicole a membrana, questo protocollo produce un'elevata abbondanza di vescicole di membrana pure che possono essere utilizzate per ulteriori saggi biochimici o funzionali. Quando dimostriamo il protocollo usando il Mycobacterium smegmatis, il ceppo non verulento, questo protocollo può essere seguito in strutture BSL-2 utilizzando Mycobacterium tuberculosis, il ceppo virulento.

Per iniziare, preparare un litro di mezzo minimo sciogliendo cinque grammi di fosfato monopotassio, cinque grammi di L-asparagina, 20 millilitri di glicerolo e due grammi di destrosio in 900 millilitri di acqua deionizzata in un contenitore di plastica. Regolare il pH a 6,8 con cinque idrossido di sodio normale e regolare il volume a un litro con acqua deionizzata. Quindi aggiungere 50 grammi di resina chelatante metallica e agitare delicatamente utilizzando una barra di agitazione magnetica per 24 ore a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, interrompere l'agitazione e lasciare sedimentare la resina per circa 30 minuti. Sterilizzare e rimuovere la resina rimanente dalla soluzione mediante filtrazione attraverso un'unità filtrante da 22 micron con un ricevitore in plastica. Ora, integrare il mezzo minimo con 0,5 milligrammi per litro di cloruro di zinco, 40 milligrammi per litro di solfato di magnesio e 0,1 milligrammi per litro di solfato di manganese.

Inoculare una singola colonia di MTB in due millilitri di brodo micobatterico integrato con arricchimento ADN. Incubare con agitazione a 37 gradi Celsius. Quando c'è una crescita visibile, estrarre due millilitri della coltura e misurare l'OD 540 su uno spettrofotometro.

Interrompere l'incubazione quando l'OD 540 raggiunge 0,8, il che indica la fase logaritmica tardiva. Stendere 200 microlitri della coltura logaritmica tardiva sulle piastre di agar micobatterico integrate con 0,2 glicerolo, 0,5%Tween 80 e ADN. Inoculare almeno cinque piatti.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius. E dopo una settimana, la crescita batterica è visibile come uno strato confluente. Quindi bagnare un batuffolo di cotone sterile in un mezzo minimo di ferro basso.

Utilizzare questo tampone per raccogliere batteri dalle piastre di agar. Inoculare i batteri in 100 millilitri di basso supporto minimo di ferro in un tubo. Raccogliere batteri sufficienti per preparare una sospensione con un OD 540 di uno.

Diluire la sospensione da 10 volte a un litro con un mezzo minimo di ferro basso e dividerla in due bottiglie di plastica sterili. Successivamente, trasferire due millilitri della coltura in un tubo di coltura da cinque millilitri. Aggiungere 10 microlitri del 10% volume per volume tyloxapol.

Incubare le colture a 37 gradi Celsius per 14 giorni. Trasferire la coltura a cinque tubi di centrifuga conica da 225 millilitri e centrifugare a 2.850 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Raccogliere il supernatante di coltura con una pipetta da 50 millilitri e filtrarlo sterilizzarlo attraverso un filtro da 0,22 micron.

Per isolare i MEV, trasferire il filtrato di coltura in un sistema di ultrafiltrazione cellulare mescolato posto a quattro gradi Celsius e filtrare il concentrato a una pressione inferiore a 50 PSI attraverso una membrana di taglio da 100 kilodalton. Quindi centrifugare il filtrato di coltura concentrato a 15.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il supernatante in tubi di ultracentrifugazione in policarbonato. Centrifugare il supernatante a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.

Successivamente, rimuovere il supernatante e rimescolare i pellet membranosi in un totale di un millilitro di PBS sterile mediante pipettazione delicata. Mescolare 0,5 millilitri della sospensione a pellet con 1,5 millilitri di soluzione di iodixanolo al fondo di un tubo ultracentrifugo a parete sottile in polipropilene. Sovrapporre questa sospensione MVE iodixanolo 45% con un millilitro del 40%35%30%25% e 20%soluzioni iodixanoli e un millilitro di PBS nella parte superiore.

Centrifuga a 100.000 volte g per 18 ore a quattro gradi Celsius. Quindi, utilizzare una siringa Hamilton da un millilitro per raccogliere le frazioni di gradiente di densità di un millilitro a partire dall'alto. Diluire ogni frazione raccolta a 20 millilitri con PBS e centrifuga a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il supernatante e resuspend in 0,5 millilitri di PBS. Conservare i tubi a quattro gradi Celsius. Per eseguire l'analisi lipidica della membrana, combinare 10 microlitri di ogni frazione gradiente con la sonda a membrana fluorescente TMA-DPH a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro in 50 microlitri di PBS in ogni pozzo di una piastra nera da 96 pozzetti.

Incubare le piastre a 33 gradi Celsius per 20 minuti. Misurare la fluorescenza a 360 nanometri per l'eccitazione e 430 nanometri per l'emissione. In questo protocollo, i MEV sono stati purificati dalla sedimentazione differenziale in un gradiente di densità.

Nelle condizioni descritte, i MEV sono stati separati per lo più in frazione gradiente tre che corrisponde al 25% di iodixanolo. Le proteine associate alla vescicola sono state concentrate nella frazione tre mostrata dall'analisi delle macchie di punti. La colorazione negativa ha anche confermato la presenza di MEV nella frazione tre e l'analisi delle nanoparticelle ha mostrato che la dimensione del MEV era di circa 100 nanometri.

La concentrazione di proteine e lipidi normalizzata in unità di formazione di colonie ha mostrato un aumento di circa otto volte della resa di MEV in ferro basso rispetto alle elevate condizioni di ferro. L'analisi delle macchie di punti ha mostrato un segnale più intenso da marcatori associati al MEV nelle frazioni di gradiente di densità da colture MTB limitate dal ferro rispetto alle colture MTB sufficienti del ferro. Seguire le istruzioni per la preparazione del mezzo minimo per garantire condizioni limitate al ferro e prevenire la contaminazione delle vescicole di membrana con aggregati di lipoproteina.

Le vescicole della membrana micobatterica purificate in questo modo possono essere utilizzate per la caratterizzazione biochimica e l'analisi funzionale.