Name: Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per losservazione a singola molecola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri come produrre ensemble di motori molecolari dynein e kinesin su nanostrutture DNA origami per l'osservazione a singola molecola mediante microscopia a fluorescenza TIRF.

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Ringraziamo K. Chau, J. Morgan e A. Driller-Colangelo per aver contribuito alle tecniche del telaio segmentato di origami di DNA. Ringraziamo anche gli ex membri dei laboratori Reck-Peterson e Shih per le discussioni utili e i contributi allo sviluppo originale di queste tecniche. Ringraziamo J. Wopereis e lo Smith College Center for Microscopy and Imaging e L. Bierwert e lo Smith College Center for Molecular Biology. Ringraziamo con gratitudine il programma di risonanza magnetica NSF per l'acquisizione di un microscopio TIRF.

<ol><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li>
<li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li>
<li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li>
<li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle%3A+Stepping+Toward+a+Consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li>
<li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li>
<li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+cargo+transport%3A+moving+beyond+tug+of+war%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li>
<li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li>
<li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li>
<li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li>
<li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li>
<li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li>
<li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li>
<li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li>
<li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li>
<li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641(2014).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li>
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<li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li>
<li>Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRao%2C+L+%22Single+Molecule+Analysis.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology</a>. 1665, Humana Press. New York, NY. (2018).</li>
<li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li>
<li>Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGietz%2C+RD+%22Yeast+Genetics.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. 1205, Humana Press. New York, NY. (2014).</li>
<li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li>
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<li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li>
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<li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le tecniche di costruzione molecolare degli origami del DNA forniscono un modo unico per costruire insiemi motori con architetture definite, numeri motori e tipi, consentendo studi su come il comportamento emergente deriva da specifiche configurazioni motorie31. Mentre gli studi strutturali e cellulari continuano a chiarire esempi di motori citoscheletrici che lavorano in team, le tecniche per isolare e studiare i meccanismi biofisici e biochimici dei motori negli insiemi stanno crescendo in utili...

La dineina e la cinesia sono proteine motorie citoscheletriche responsabili di una miriade di funzioni nelle cellule eucariotiche1. Convertendo l'energia chimica dell'idrolisi ATP in lavoro produttivo, questi motori traslocano sui microtubuli per trasportare e distribuire vari carichi intracellulari. Si coordinano anche nei massicci riarrangiamenti intracellulari associati alla mitosi, dove esibiscono forze orchestrate che contribuiscono al posizionamento e alla separazione dei cromosomi. I saggi strutturali, biochimici e biofisici, comprese le osservazioni su singola molecola, hanno rivelato i meccanismi di questi motori a livello individuale (ben esaminati nei lavori precedenti2,3,4). Tuttavia, molti dei compiti dei motori richiedono loro di lavorare in piccoli gruppi di motori simili e misti. Comparativamente meno si intende i meccanismi che coordinano l'attività e la motilità emergente finale di questi insiemi5,6. Questa lacuna di conoscenze è dovuta, in parte, alla difficoltà di creare insiemi con caratteristiche controllabili, come il tipo di motore e il numero di copia. Nell'ultimo decennio, le tecniche di costruzione molecolare degli origami di DNA sono state impiegate per risolvere questo problema. Per i motori basati su microtubuli, alcuni esempi di queste indagini includono osservazioni a singola molecola di insiemi di dineeina citoplasmica-17,8,9, dineina intraflagellare11, vari motori kinesin12,13, e miscele di dine e kinesins7,14,15. Qui, forniamo dettagli sulla purificazione e l'etichettatura oligonucleotide dei motori da lievito7,16,17,18,19,20, il piegamento e purificazione degli origami di DNA segmentato con conformità regolabile8e l'imaging dei motori di lievito che prospettano le strutture del telaio7,18.
Costruire insiemi motori per l'osservazione in vitro a singola molecola richiede tre sforzi primari. Il primo è l'espressione, la purificazione e l'etichettatura dei costrutti motori adatti per l'attaccamento agli origami di DNA. Il secondo è la produzione e la purificazione di strutture definite di origami di DNA (spesso chiamato "telaio"). E la terza è la coniugazione dei motori alla struttura del telaio seguita dall'osservazione utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF). Qui, forniamo protocolli stabiliti per questo processo per motori ricombinanti a base di microtubuli purificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. Sono stati studiati insiemi motori basati su origami di DNA utilizzando sia kinesin ariente15 che dynein7,8,18 costrutti prodotti in questo sistema di espressione del lievito16 ,17,18,19. Questo protocollo è valido per questi costrutti, dato che sono controllati dal promotore indotto da galactose, e fusi agli stessi tag proteici per la purificazione (linker proteasete TEV) e per la coniugazione dell'oligo del DNA (SNAPtag).
Ceppi di lievito specifici producono costrutti motori specifici. Ad esempio, la dineina utilizzata per studiare il ruolo della conformità del carico è stata purificata dal ceppo RPY10847,8. In generale, i ceppi contenenti costrutti motori con le opportune modifiche genetiche per l'espressione e la purificazione possono essere richiesti ai laboratori dopo aver pubblicato l'uso di tali motori. I costrutti con nuovi attributi come mutazioni o tag possono essere realizzati utilizzando tecniche genetiche ricombinanti, come la trasformazione acetato di litio21 e i kit commerciali. Sono stati pubblicati protocolli dettagliati per la creazione di proteine motorie modificate nel lievito per studi su singole molecole19. Oltre ai motori fusi al SNAPtag, le oligo utilizzate per etichettare i motori devono essere coniugate al substrato SNAP, benzylguanine (BG); Protocolli pubblicati in precedenza descrivono la formazione e la purificazione dei coniugi BG-oligo18. La strategia globale qui descritta è stata impiegata anche per motori basati su actin (vedi lavori precedenti per gli esempi22,23,24) e motori purificati da altri organismi e sistemi di espressione (vedi precedenti funziona per gli esempi7,9,10,11,12,13,14).
I microtubuli polimerizzati (MT) vengono utilizzati in questi esperimenti in due diverse procedure. La purificazione dell'affinità MT dei motori funzionali richiede MT che non sono etichettati con altri gruppi funzionali, mentre l'analisi motilità motor-ensemble TIRF richiede MT etichettati con biotina e fluorofori. In tutti i casi, le MT sono stabilizzate con taxol per prevenire la denaturazione. Il passaggio di purificazione dell'affinità MT viene utilizzato per rimuovere tutti i motori non motile con un'elevata affinità MT, in quanto questi motori possono alterare la motilità dell'insieme se coniugati a un telaio. Durante questo processo, i motori attivi dislegano le MT e rimangono in soluzione, mentre i motori a legame stretto girano verso il basso nel pellet MT. Questo aiuta a garantire che tutti i motori sul telaio provengono da una popolazione attiva.
Una varietà di strutture di origami di DNA sono stati utilizzati per studiare gli insiemi motori citoscheletrici. Con l'aumentare della comprensione meccanicistica del trasporto di insiemi, le strutture di origami del DNA impiegate negli esperimenti sono cresciute in complessità. In linea di principio, qualsiasi struttura potrebbe essere adattata a questo scopo a condizione che venga modificata per includere siti di fissaggio del DNA a filamento singolo per motori e fluorofori. Specifici progetti e attributi del telaio possono essere utili per sondare particolari domande sul comportamento emergente dei motori incui. Ad esempio, le aste rigide sono state utilizzate per sviluppare una conoscenza fondamentale di come il numero di copie influenzi il trasporto da parte di squadre di dine e kinesins7,15,18e piattaforme 2D sono state utilizzate per studiare l'ensemble di miosina navigazione delle reti actin22. Strutture con flessibilità variabile o regolabile sono state utilizzate per comprendere i ruoli di accoppiamento elastico tra motori e per sondare come la sincronizzazione passo influisce sulla sincronizzazione influisce sulla motilità8,24. Più recentemente, le strutture sferiche vengono utilizzate per ottenere informazioni su come i vincoli geometrici alla rilegatura del motore influenzano la dinamica della motilità25.
In questo protocollo, offriamo passaggi specifici per esperimenti di ensemble su telai segmentati con rigidità variabile. I siti di legame sullo chassis sono a volte indicati come "maniglie", mentre le sequenze di DNA complementari che legano queste maniglie sono chiamate "antihandle". Il numero di motori su questi telai è determinato da quali segmenti contengono punti metallici estesi con complementarità all'oligo antihandle sui motori con etichetta oligo. L'utilizzo di sequenze di maniglie diverse su segmenti diversi consente di associare diversi tipi di motori a posizioni specifiche sullo chassis. Il telaio qui dettagliato è composto da 7 segmenti rigidi sequenziali, ciascuno composto da 12 eliche di DNA a doppio filamento disposte in 2 anelli concentrici8. I segmenti rigidi contengono le maniglie del motore e sono collegati attraverso regioni che possono essere sia DNA a filamento singolo flessibile o DNA a doppio filamento rigido, a seconda dell'assenza o della presenza, rispettivamente, di graffette "linker". La conformità della struttura del telaio è quindi determinata dalla presenza o dall'assenza di questi elementi di base "linker". Vedere i rapporti precedenti per ulteriori dettagli e specifiche sequenze di DNA8. Inoltre, è possibile utilizzare più metodi per purificare lo chassis26. Il metodo di centrifugazione del gradiente di glicerolo di tasso-zonale27 è descritto qui.

<table><tbody><tr><td>Provetta a fondo tondo da 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Proteina tubulina marcata con biotina: cervello suino, Cytoskeleton.com puro al >99%</td><td></td><td>T333P-A Biotina-BSA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Flacone in policarbonato, policarbonato, 250 mL, 62 x 120 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>356013</td><td></td></tr><tr><td>Flacone, con tappo assemblato, policarbonato, 10,4 mL, Unità</td> di filtro centrifugo <td>355603</td><td></td><td>Coulter Beckman</td> da 76 mm</tr><tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td> Colonne per cromatografia <td>GE Healthcare</td><td>17096901</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin, vuote</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204EDU</td><td></td></tr><tr><td>P8064 Scaffold</td><td>Tilibit</td><td>2 mL a 400nM</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Colonne per cromatografia</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>ProTev Proteasi</td><td>Promega</td><td>V6101</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Nastro biadesivo con dosatore</td><td>amazon.com</td><td>S/A</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-500 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>17061310</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>434302</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA stain</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteina tubulina (pura al >99%): cervello suino</td><td>Cytoskeleton.com</td> Tubulina <td>T240-B</td><td></td></tr><tr><td>, HiLyte 647</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>TL670M-A</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga ultra trasparenti</td><td>Beckman Coulter</td><td>344090</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di dynein e kinesin motor ensemble su nanostrutture dna origami per l'osservazione a singola molecola

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

I motori citoscheletrici sono responsabili di un'ampia varietà di funzioni nelle celle eucariotiche, tra cui mitosi, trasporto merci, motilità cellulare e altri. Molte di queste funzioni richiedono motori per operare in generale. Nonostante la ricchezza di conoscenze sui meccanismi dei singoli motori citoscheletrici, si sa relativamente meno sui meccanismi e sui comportamenti emergenti degli insiemi motori, tra cui esempi di cambiamenti nella processizia e nella velocità dell'insieme con modifica del numero del motore, della posizione e della configurazione. La nanotecnologia del DNA strutturale, e la tecnica specifica degli origami del DNA, consentono la costruzione molecolare di architetture ben definite di insiemi motori. La forma delle strutture di carico così come il tipo, il numero e il posizionamento dei motori sulla struttura possono essere tutti controllati. Qui, forniamo protocolli dettagliati per la produzione di questi insiemi e osservandoli utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna. Anche se queste tecniche sono state specificamente applicate per i motori citoscheletrici, i metodi sono generalizzabili ad altre proteine che si assemblano in complessi per svolgere i loro compiti. Nel complesso, il metodo degli origami del DNA per la creazione di insiemi ben definiti di proteine motorie fornisce un potente strumento per sezionare i meccanismi che portano a un comportamento motile emergente.

Le purificazioni di successo dei motori e delle strutture del telaio sono state svolte dall'elettroforesi in gel. L'analisi SDS-PAGE ha confermato la riuscita estrazione della dineina dal lievito (Figura 2), poiché il filtrato finale raccolto al punto 2.3.7 ha mostrato una banda chiara e nitida alla posizione di 350 kDa. Come previsto, questa banda didina era assente dal flusso e lavaggio che ha rimosso le proteine indesiderate, e le perline da cui la dineina...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di formare insiemi di motori molecolari sulle nanostrutture di origami del DNA e osservare la motilità dell'insieme utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna.

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Il nostro protocollo è progettato per sondare i meccanismi biofisici che regolano il trasporto del carico da parte di squadre di proteine motorie citoscheletriche identiche o dirette in senso opposto. Utilizzando gli origami di DNA per la costruzione molecolare, questo metodo può scegliere per il tipo, il numero e la posizione dei motori su forme di carico definite con precisione. Mentre questo protocollo si concentra sui motori a base di microtubuli dynein e kinesin, è adattabile alla miosina motoria a base di actina, così come ad altri sistemi proteici che funzionano in modo cooperativo.Un aspetto impegnativo di questo protocollo è mantenere l'integrità e l'attività delle proteine motorie durante tutto il processo di purificazione, in quanto sono sensibili al calore e alla forza meccanica. Per indurre la crescita e l'espressione delle proteine motorie tramite il promotore del galattosio, utilizzare una bacchetta sterile per striare il ceppo di lievito congelato di interesse su un piatto di coltura di lievito-peptone-destrosio per un'incubazione da tre a quattro giorni a 30 gradi Celsius. Il quarto giorno di coltura, quando la densità ottica a 600 nanometri è compresa tra 1,5 e du

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Questo video descrive un metodo per visualizzare l'assemblaggio di condensati di proteine di fusione su molecole di DNA in loci specifici utilizzando l'imaging a singola molecola. Questi condensati si formano a causa delle interazioni LCD-LCD e LCD-DBD, che consentono il reclutamento della RNA polimerasi II e una migliore trascrizione genica.

Imaging di una singola molecola per visualizzare l'assemblaggio di condensati di proteine di fusione su tende di DNA

Origami di DNA è un potente metodo per la realizzazione di oggetti in nanoscala precise programmando l'auto-assemblaggio di molecole di DNA. Qui, descriviamo come origami di DNA può essere utilizzato per progettare un robot in grado di rilevare segnali biologici e rispondenti, per il cambiamento di forma, successivamente trasmesso ad un effetto desiderato.

Progettazione di un robot bio-sensibile da DNA Origami

L'origami del DNA è un metodo potente per fabbricare oggetti precisi su scala nanometrica programmando l'auto-assemblaggio di molecole di DNA. Qui descriviamo un protocollo per il ripiegamento di un robot bio-responsivo da origami di DNA, la sua purificazione e colorazione negativa per l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione (TEM).

Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA

Qui si descrive la strumentazione e metodi per la rilevazione di molecole proteiche singolo fluorescenza marcata che interagiscono con una singola molecola di DNA sospeso tra due microsfere otticamente intrappolati.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

Descriviamo il protocollo dettagliato per la progettazione, la simulazione, gli esperimenti di laboratorio bagnato e analisi per un rack di fisarmonica DNA riconfigurabile di 6 per 6 maglie.

Progettazione e sintesi di un Rack di fisarmonica di DNA riconfigurabile

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la legatura di T4 e denaturazione pagina purificazione di piccole molecole di DNA circolare, ricottura e nativo pagina analisi circolare piastrelle, montaggio e formazione immagine AFM di nanostrutture di DNA 1D e 2D, nonché dell'agarosi gel purificazione di elettroforesi e centrifugazione di nanostrutture di DNA finiti.

Motivi di DNA stabile, 1D e 2D nanostrutture costruito da molecole di DNA circolare piccola

Presentiamo un protocollo per costruire navette molecolari, dove proteine motrici superficie-aderito chinesina propel microtubuli tintura-etichettati. Interazioni deboli di kinesins con superficie consente loro reversibile attaccamento ad essa. Questo crea un sistema su scala nanometrica che esibisce dinamico montaggio e smontaggio dei suoi componenti, pur mantenendo la sua funzionalità.

Assemblaggio molecolare navette arricchite reversibilmente attaccato Kinesins

Qui, descriviamo un protocollo per creare nanostrutture inorganiche discrete e accurate sui substrati utilizzando forme di origami di DNA come modelli guida. Il metodo è dimostrato dalla creazione di antenne plasmoniche a forma di papillon in oro su un substrato trasparente (sapphire).

Il nanopatterndifid antistrato DNA Mediato delle strutture inorganiche per applicazioni di rilevamento

La cinesina mitotica bidirezionale-5 Cin8 si accumula in ammassi che si dividono e si fondono durante la loro motilità. L'accumulo negli ammassi cambia anche la velocità e la direzionalità di Cin8. Qui viene descritto un protocollo per saggi di motilità con Cin8-GFP purificato e analisi delle proprietà mobili di singole molecole e cluster di Cin8.

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l'intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all'interno delle reti di microtubuli attivi.

Misurazione diretta delle forze all'interno di fasci di microtubuli attivi ricostituiti

Questo studio descrive in dettaglio la purificazione di KIF1A (1-393LZ), un membro della famiglia kinesin-3, utilizzando il sistema di espressione del baculovirus Sf9. L'analisi in vitro di scorrimento monomolecola e multimotore di questi motori purificati ha mostrato robuste proprietà di motilità paragonabili ai motori del lisato cellulare di mammifero. Pertanto, il sistema Sf9-baculovirus è suscettibile di esprimere e purificare la proteina motoria di interesse.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

Scopri come produrre ensemble di motori molecolari dynein e kinesin su nanostrutture DNA origami per l'osservazione a singola molecola mediante microscopia a fluorescenza TIRF.

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

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