Name: Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Impara a generare organoidi endometriali umani multicellulari per studiare la risposta ormonale e i meccanismi patologici. Questo metodo consente test farmacologici in un modello fisiologicamente rilevante.

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Questo studio è stato finanziato dalla sovvenzione NIEHS/NIH/NCATS UG3 (ES029073) e dal fondo Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge (JJK). Vorremmo riconoscere lo strumento di patologia nordoccidentale per l'elaborazione degli organoidi fissi per l'incorporamento della paraffina. Vorremmo conoscere l'intero team UG3, compresi i laboratori Woodruff, Burdette e Urbanek, per le discussioni e le collaborazioni approfondite.

Campioni endometriali sono stati raccolti da donne in premenopausa sottoposte a isterectomia di routine per condizioni uterine benigne presso il Northwestern University Prentice Women's Hospital, secondo un protocollo approvato dall'Institutional Review Board. Il consenso scritto è stato ottenuto da tutte le donne incluse nello studio.
1. Preparazione delle muffe Agarose
<ol><li>Prima di iniziare l'isolamento cellulare, lanciare ed eclicare 1,5% di micro stampi agarose (Tabella dei materiali) per ospitare gli organoidi secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>2. Generazione di organoidi endometriali
<ol><li>Raccogliere cellule stromali ed epiteliali primarie
	<ol>
<li>In un armadio di biosicurezza con tecnica asettica, preparare la soluzione enzimatica (2,5 mg/mL di tipo collagenase I - 0,1 mg/mL DNase I in 10 mL di dispasi [500 unità]) a 37 mL, e sterile-filtro la soluzione utilizzando un filtro di siringa 0,2 m in un tubo conico 15 mL.</li>
		<li>In un armadio di biosicurezza con tecnica asettica, raschiare l'endometrio dalle biopsie uterine e macinare il tessuto sotto il cappuccio in pezzi molto piccoli con un bisturi. NOT:</</c2> Il tessuto endometriale di almeno 20 mm x 10 mm x 1 mm è necessario per generare un numero sufficiente di organoidi.</li>
		<li>Mettere il tessuto appena macinato nella soluzione enzimatica in un tubo conico da 15 mL. Chiudere il tappo e avvolgere la parte superiore con una pellicola di cera (Tabella dei materiali) per evitare la contaminazione.</li>
		<li>Mettete il tubo con il tessuto in un bagno d'acqua o in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 30 min con agitazione delicata (80-100 giri/m).</li>
		<li>Impilare un colino a 100 m sopra un colino da 20 m su un tubo conico da 50 ml. Filtrare la soluzione attraverso i due ceppi, quindi sciacquare il tubo conico da 15 mL con 10 mL di soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS; Tabella dei materiali) e mettere il lavaggio attraverso il colino per garantire che tutte le cellule siano raccolte. NOT:</</c5> Il liquido fluivo contiene globuli stromali e globuli rossi (20 mL in totale). Le cellule epiteliali vengono raccolte sul colino da 20 m. Pezzi di tessuto non digerito rimangono in cima al colino da 100 m. Eliminare il tessuto non digerito in un contenitore di rifiuti di pericolo biologico.</li>
		<li>Invertire il colino a 20 m dal passo 2.1.5 su un nuovo tubo conico da 50 ml e lavare le cellule epiteliali dal colino con 20 mL di supporti organoidi (Tabella dei materiali) completate con 1% di penna/strep.</li>
		<li>Centrifugare i tubi conici da passi 2.1.5 e 2.1.6 a 500 x g per 5 min.</li>
		<li>Con le cellule strone raccolte, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 10 mL di lisi di lissi dei globuli rossi.  Incubare a 37oC per 10-15 min. Centrifugare il tubo conico a 500 x g per 5 min, rimuovere il supernatante, e sospendere nuovamente il pellet con 200'300 l di supporti organoidi (vedere passo 2.2.2 per ulteriori istruzioni).</li>
		<li>Con le cellule epiteliali raccolte, rimuovere il sovratalgarico e sospendere nuovamente con 100 -L di supporti organoidi (vedere il passaggio 2.2.2 per ulteriori istruzioni).</li>
	</ol></li>
	<li>Seeding cellule
	<ol>
<li>Dopo aver equilibrato l'1,5% di stampi agarose in pozzetti (1 stampo per pozzo) di una piastra di 24 pozzetti, rimuovere i supporti organoidi all'esterno degli stampi agarose e inclinare la piastra di coltura del tessuto in modo che il mezzo dalla camera di semina cellulare dei piatti agarose può anche essere accuratamente rimosso.</li>
		<li>Visualizzare le sospensioni epiteliali (dal punto 2.1.9) e stromali (dal punto 2.1.8) delle sospensioni cellulari al microscopio.  Aggiungere più supporti organoidi alle sospensioni delle cellule epiteliali o stromali 100 gradi alla volta, in modo che le sospensioni siano approssimativamente uguali in densità. NOT:</</c2> Le cellule epiteliali si aggregano insieme, e non è consigliabile digerire / provare le cellule epitiniali in sospensioni a cella singola.</li>
		<li>Combina 1 parte delle cellule stromali con 3 parti di cellule epiteliali per volume.</li>
		<li>Pipetta 50 L (60.000 cellule) della sospensione cellulare combinata nella camera di semina cellulare dello stampo agarose.</li>
		<li>Una volta che gli stampi di agarose sono riempiti con le cellule, aggiungere con cura 400 - L di supporti organoidi freschi nel pozzo della piastra di 24 pozze. NOT:</</c3> Il mezzo raggiunge appena sotto la superficie dei piatti agarose e non farà galleggiare le cellule fuori dagli stampi. Dopo 2/3 giorni, le cellule si depositano e iniziano a formare organoidi.</li>
		<li>Cambiare media ogni due giorni con 500 -L di supporti organoidi.</li>
		<li>Dopo 2-3 giorni, cambiare medio a uno che è integrato con 0.1 nM estradiol (E) e 0.8 nM di testosterone (T) per promuovere l'organizzazione delle cellule epiteliali e stromali. NOT:</</c4> Anche se l'organizzazione delle cellule epiteliali e stromali può verificarsi con o senza ormoni, più organoidi si organizzeranno in presenza di ormoni.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Raccolta degli organidi endometriali per gli esperimenti
 NOT:</</c0> Una volta fatto l'esperimento, gli organoidi endometriali possono essere elaborati per l'istologia o l'analisi dell'RNA. I passaggi seguenti descrivono come elaborare gli organoidi.
<ol><li>
Istologia
	<ol>
<li>Sciogliere l'1,5% di agarose nella salina con buffer fosfato (PBS) bollendo. Lasciare raffreddare l'agarose liquido a circa 50 gradi centigradi.</li>
		<li>Sotto un microscopio dissettivo, inclinare la piastra di 24 pozze e pipetta con attenzione fuori dal mezzo dall'esterno dello stampo agarose. Attentamente pipette fuori il mezzo dall'interno dello stampo agarose per evitare di interrompere gli organoidi.</li>
		<li>Al microscopio sezionato, con cura la pipetta 70-75 - L di caldo (50 oC) 1,5% agarose nella camera del piatto di agarose. Fare attenzione a non disturbare gli organoidi.</li>
		<li>Lasciar raffreddare a 4 gradi centigradi per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) in ogni pozzetto della piastra 24 e fissare l'intero stampo agarose sigillato contenente organoidi durante la notte a 4 gradi centigradi. Quindi conservare nel 70% di etanolo a 4 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'elaborazione per l'incorporamento della paraffina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento dell'RNA
	<ol>
<li>Al microscopio dissezioso, inclinare la piastra di 24 pozze e pipetta con attenzione fuori dalla camera dello stampo agarose.</li>
		<li>Con forza pipetta 1 mL di mezzo organoide fresco direttamente nello stampo agarose in modo che gli organoidi vengano scaricati dai micropozzi. Fare attenzione a non creare troppe bolle.</li>
		<li>Ripetere la pipa con lo stesso supporto dal passaggio 3.2.2.</li>
		<li>Raccogliere tutto il mezzo contenente gli organoidi. Centrifuga a velocità massima per raccogliere gli organoidi e procedere all'estrazione dell'RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo generato organoidi endometriali umani composti da cellule epiteliali e stromali dell'endometrio senza l'uso di materiali scaffold esogeni. Mentre è già stato dimostrato che le cellule epiteliali endometriali primarie possono formare organoidi6,7, queste cellule sono state incorporate in una matrice gelatinosa di proteine secrete da cellule di sarcoma del topo (vedi Tabella dei materiali)per aiutare formano strutture simili a sferoidi. Ino...

L'endometrio umano allinea la cavità uterina e serve come primo contatto per l'embrione durante l'impianto. L'endometrio è composto da cellule epiteliali luminali e ghiandolari, fibroblasti stromali di supporto, cellule endoteliali e cellule immunitarie. Insieme, questi tipi di cellule costituiscono il tessuto endometriale che è uno dei tessuti più reattivi agli ormoni steroidei sessuali1. I cambiamenti che si verificano durante ogni ciclo mestruale sono sorprendenti. È necessaria un'adeguata crescita e rimodellamento dell'endometrio per consentire l'impianto dell'embrione. La risposta aberrante agli estrogeni e al progesterone può provocare un endometrio refrattario che non consente l'istituzione di una gravidanza di successo e può anche provocare malattie tra cui la neoplasia endometriale.
Al fine di studiare le risposte ormonali e i cambiamenti essenziali che si verificano nell'endometrio, le cellule dei tessuti endometriali eccitate dai pazienti durante l'intervento chirurgico o la biopsia endometriale sono state propagate nella coltura cellulare. Le cellule stromali endometriali proliferano preferibilmente e si propagano prontamente, e il processo di differenziazione indotto dal progesterone può essere ricapitolato in vitro. Di conseguenza, molto è stato appreso durante questo processo di differenziazione, definito deciduizzazione2,3. L'altro tipo di cellula principale nell'endometrio, le cellule epiteliali luminali e ghiandolare, tuttavia, non crescono così come i monostrati tradizionali, perdendo la polarità, diventando senescenti e con un limitato potenziale proliferare. Di conseguenza, meno è noto della loro biologia e del loro ruolo nell'endometrio umano. Poiché molti neoplasia provengono dalle cellule epiteliali, i meccanismi associati all'iperplasia o alla trasformazione nelle cellule tumorali rimangono da definire completamente. Inoltre, gli studi hanno stabilito che la risposta ormonale coinvolge le azioni paracrine intime tra le cellule epiteliali e stromali dell'endometrio4,5.
Recentemente, una coltura organoide tridimensionale (3D) di cellule epiteliali endometriali è stata stabilita da due gruppi indipendenti6,7, che sono i primi rapporti di organoidi formati dal tessuto endometriale. Questi organoidi erano costituiti da cellule epiteliali endometriali incorporate all'interno di una matrice proteica (Table of Materials) e non includevano un importante compartimento ormonale reattivo dell'endometrio endometriale, i fibroblasti stromali. Poiché le proteine della matrice possono variare da un lotto all'altro e possono innescare percorsi di segnalazione che non si verificano necessariamente nel tessuto, sarebbe ideale sostituire le proteine della matrice con componenti dell'endometrio. Nello studio attuale, viene presentato un protocollo per generare organoidi endometriali umani privi di scaffold di cellule epiteliali e stromali dell'endometrio umano. La presenza di cellule stromali non solo fornisce il supporto per le cellule epiteliali, ma fornisce anche le azioni paracrine necessarie che sono state stabilite per essere importanti per la risposta dell'ormone endometriale4,8,9 .
Il nuovo organoide endometriale multicellulare offre un sistema modello dell'endometrio che è semplice da generare e che incorpora cellule epiteliali e stromali. Questi organoidi possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti ormonali a lungo termine e i primi eventi di malattia come la tumorigenesi a causa di squilibri ormonali o insulti esogeni. La complessità di questi organoidi potrebbe infine essere ampliata per includere altri tipi di cellule, tra cui cellule endoteliali e immunitarie con cellule potenzialmente miometriali per imitare veramente la fisiologia del tessuto umano.

<table><tbody><tr><td>Agarosio HS, grado di biologia molecolare</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Stampi di agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td><td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio (NH4Cl)</td><td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi, Tipo II, polvere</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione eosina</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Recettore degli estrogeni (SP1), anticorpo monoclonale di coniglio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield con DAPI, mezzo di montaggio istologico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x senza calcio, magnesio e rosso fenolo</td></tr><tr><td>Soluzione colorante di ematossilina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32</td><td>Formulazione Harris modificata,</td></tr><tr><td>soluzione di eparina</td> senza mercurio <td>STEMCELL Technologies</td><td>07980</td><td>aggiunto ai terreni MammoCult</td></tr><tr><td>Soluzione madre di idrocortisone</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>aggiunto ai terreni MammoCult</td></tr><tr><td>Terreni organoidi - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>integrato con 2 &micro; L/mL di eparina e 5 &micro; L/mL idrocortisone</td></tr><tr><td>Paraformaldeide, soluzione al 16%</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4</td> Recettore del progesterone <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>, PgR 1294, non coniugato, surnatante di coltura</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>matrice proteica - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo purificato anti-E-caderina nel topo</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>Clone 36</td></tr><tr><td>Anticorpo ricombinante anti-vimentina [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento e lisi dell'RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Testosterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>Macchia Tricromica</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola di cera - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

L'endometrio umano è uno dei tessuti più ormonali reattivi nel corpo ed è essenziale per l'istituzione della gravidanza. Questo tessuto può anche diventare malato e causare morbilità e persino la morte. I sistemi modello per studiare la biologia endometriale umana sono stati limitati a sistemi di coltura in vitro di tipo a cellula singola. Inoltre, le cellule epiteliali, uno dei principali tipi di cellule dell'endometrio, non si propagano bene o mantengono i loro tratti fisiologici nella coltura, e quindi la nostra comprensione della biologia endometriale rimane limitata. Abbiamo generato, per la prima volta, organoidi endometriali costituiti da cellule epiteliali e stromali dell'endometrio umano. Questi organoidi non richiedono materiali di impalcatura esogeni e specificamente organizzano in modo che le cellule epiteliali comprendano la struttura simile a uno sferoide e diventino polarizzate con cellule stromali al centro che producono e secernono collagene. I recettori dell'estrogeno, del progesterone e dell'androgeno sono espressi nelle cellule epiteliali e stromali e il trattamento con livelli fisiologici di estrogeni e testosterone promuovono l'organizzazione degli organoidi. Questo nuovo sistema modello può essere utilizzato per studiare la biologia endometriale normale e la malattia in modi che prima non erano possibili.

Uno schema del protocollo è illustrato nella Figura 1. Il tessuto uterino è stato ottenuto da un intervento chirurgico dopo che è stato esaminato dai patologi. Il rivestimento endometriale è stato separato dal miometrio raschiando e il tessuto endometriale è stato enzimaticamente digerito alle cellule come delineato nel protocollo. Le cellule epiteliali e stromali sono state aggiunte nei micropozzi negli stampi agarose. Dopo 7 giorni di coltura, gli organoidi sono stati trattati con E e T pe...

Viene presentato un protocollo per generare organoidi endometriali primari umani costituiti da cellule epiteliali e stromali e che conservano le caratteristiche del tessuto endometriale nativo. Questo protocollo descrive i metodi dall'acquisizione del tessuto uterino all'elaborazione istologica degli organoidi endometriali.

Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

L'endometrio è un tessuto che cambia ogni mese in risposta agli ormoni. Lo squilibrio ormonale può prevenire l'attaccamento dell'embrione e causare anche malattie come il cancro. Il nostro protocollo ricostruisce l'endometrio in modo che possa essere studiato al di fuori del corpo della donna in modo fisiologico.Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una struttura 3D di cellule composte da due tipi di cellule ormonalmente reattive, le cellule epiteliali e stroma che si organizzano e si comportano specificamente come fanno nel corpo. Poiché gli organoidi possono imitare meglio il comportamento dei tessuti, alla fine possono essere utilizzati per testare diversi farmaci. Gli organoidi endometriali possono essere utilizzati per studiare gli effetti diretti dei fattori di rischio attualmente noti per il cancro, tra cui obesità e sindrome ovarica policistica.I nostri organoidi sottolineano l'importanza delle azioni paracrine tra due tipi di cellule. È importante iniziare con una quantità adeguata di tessuto. Ottenere la giusta densità di cellule epiteliali e stromali può essere complicato.Inoltre, gli organoidi sono piuttosto piccoli e possono essere difficili da visualizzare con la colorazione IHC. La visualizzazione di questa procedura è importante perché ci sono alcuni passaggi che saranno molto più facili da capire dopo averli visti. Questi includono ottenere il giusto strato tissutale dell'utero, ottenere la giusta densità di cellule da combinare e seminare gli stampi di agarosio.Prima di iniziare l'isolamento cellulare, lanciare ed equilibrare microsta stampi all'1,5% di agarosio secondo le istruzioni del produttore per ospitare gli organoidi. In un armadio di biosicurezza, utilizzare tecniche asettiche per preparare una soluzione enzimatica a 37 gradi Celsius e filtrare sterilemente la soluzione utilizzando un filtro siringa da 0,2 micrometri in un tubo conico da 15 millilitri. Usando un bisturi, raschiare l'endometrio dalle biopsie uterine e tritare il tessuto in pezzi molto piccoli.Posizionare il tessuto appena tritato nel tubo conico da 15 millilitri contenente la soluzione enzimatica. Chiudere il cappuccio e avvolgere la parte superiore del tubo con un film di cera per evitare la contaminazione. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua o in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti con tremare delicatamente.Successivamente, impilare un colino a celle da 100 micron sopra un colino a celle da 20 micron su un tubo conico da 50 millilitri. Filtrare la soluzione attraverso i due filtri. Risciacquare il tubo conico da 15 millilitri con HBSS e mettere questo lavaggio attraverso il colino per garantire che tutte le cellule vengano raccolte.Quindi, invertire il filtro cellulare da 20 micron su un nuovo tubo conico da 50 millilitri e lavare le cellule epiteliali dal colino con 20 millilitri di mezzi organoidi integrati con 1%penicillina e streptomicina. Centrifugare i tubi conici a 500 G per cinque minuti. Per le cellule stromali raccolte, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 10 millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi.Incubare a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Centrifuga queste cellule a 500 G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet con da 200 a 300 microlitri di mezzi organoidi.Per le cellule epiteliali raccolte, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 100 microlitri di mezzi organoidi. Dopo che gli stampi di agarosio all'1,5% sono equilibrati, rimuovere il mezzo organoide all'esterno degli stampi di agarosio e inclinare la piastra di coltura tissutale in modo che anche il mezzo dalla camera di semina cellulare dei piatti di agarosio possa essere accuratamente rimosso. Visualizza le sospensioni cellulari epiteliali e stromali al microscopio e aggiungi più mezzi organoidi alle sospensioni, assicurandoti di aggiungere solo 100 microlitri alla volta in modo che le sospensioni siano approssimativamente uguali in densità.Quindi combinare una parte delle cellule stromali con tre parti delle cellule epiteliali per volume. Pipetta 50 microlitri della sospensione cellulare combinata nella camera di semina cellulare dello stampo di agarosio. Una volta riempiti gli stampi di agarosio con cellule, aggiungere con cura 400 microlitri di mezzi organoidi freschi nei pozzi della piastra a 24 porri.Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, assicurandosi di cambiare il mezzo ogni secondo giorno con 500 microlitri di mezzi organoidi. Dopo sette giorni, cambiare il mezzo in uno che è integrato con 0,1 estradiolo nanomolare e testosterone nanomolare 0,8 per promuovere l'organizzazione delle cellule epiteliali e stromali. In primo luogo, sciogliere l'1,5% di agarosio in PBS facendo bollire.Posizionare l'agarosio liquido in un bicchiere di acqua calda e lasciare raffreddare a circa 50 gradi Celsius. Al microscopio sezionato, inclinare la piastra a 24 poggia e pipettare con cura il mezzo dall'esterno dello stampo di agarosio. Quindi pipettare con cura il mezzo dall'interno dello stampo di agarosio per evitare di interrompere gli organoidi.Aggiungere con cura tra 70 e 75 microlitri di agarosio caldo all'1,5% nella camera del piatto di agarosio, facendo attenzione a non disturbare gli organoidi. Lasciare raffreddare il piatto a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, aggiungere il 4% di paraformaldeide in ogni pozzo della piastra da 24 po 'e fissare l'intero stampo di agarosio sigillato durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, conservare la piastra in 70%etanolo a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per il processo per l'incorporamento della paraffina. Per iniziare l'isolamento dell'RNA, vedere la piastra al microscopio di sezionazione. Inclinare la piastra e pipettare con cura il mezzo dalla camera dello stampo di agarosio.Pipettare con forza un millilitro di mezzo organoide fresco direttamente nello stampo dell'agarosio in modo che gli organoidi vengano esacquati dai microlitri, facendo attenzione a non creare troppe bolle. Ripetere questo processo di pipettazione forzata una volta utilizzato lo stesso mezzo. Dopo questo, raccogliere tutto il mezzo contenente gli organoidi.Centrifugare a 500 G per raccogliere gli organoidi e procedere all'estrazione dell'RNA. In questo studio, gli organoidi endometriali umani composti da cellule epiteliali e stromali dell'endometrio vengono generati senza l'uso di materiali di impalcatura esogeni. Per la lavorazione istologica, gli stampi di agarosio contenenti gli organoidi endometriali sono sigillati con agarosio, seguiti da fissazione con paraformaldeide al 4% durante la notte.Questi stampi sono lavorati per l'incorporamento standard di paraffina sessato e macchiato per istologia, immunofluorescenza o immunoistochimica. L'ematossilina nella colorazione dell'eosina rivela una struttura simile a uno sferoide con un singolo strato di cellule che rivestono l'esterno e cellule al centro. Marcatori specifici delle cellule per cellule endometriali, epiteliali e stromali rivelano cellule epiteliali che circondano l'organoide con cellule stromali al centro.Marcatori di fisiologia endometriale confermano che gli organoidi endometriali hanno mantenuto alcune caratteristiche del tessuto nativo. La colorazione tri-cromo, che macchia il blu del collagene e il rosso delle cellule, mostra la presenza di collagene all'interno del centro in cui risiedevano le cellule stromali, dimostrando la produzione attiva e la secrezione di collagene da parte di cellule stromali simili al tessuto nativo. Inoltre, la colorazione immunoistochimica rivela la presenza di recettori degli estrogeni, recettori degli androgeni e recettori del progesterone sia nelle cellule epiteliali che stromiche.È importante placcare densamente le cellule in modo da avere abbastanza organoidi per gli esperimenti a valle. Ci sarà un po' di pratica. Gli organoidi endometriali possono essere coltivati in diverse condizioni e quindi raccolti per esperimenti come l'immunoistochimica o l'immunofluorescenza per studiare l'espressione proteica o raccolti per l'RNA per studiare l'espressione genica.Il nostro laboratorio indaga come l'endometrio risponde ai livelli alterati di ormone, che possono portare all'iperplasia endometriale e al cancro. Possiamo usare questi organoidi per trattamenti a lungo termine di ormoni e aggiungere condizioni patologiche come l'eccesso di testosterone presente nella sindrome ovarica policistica, o segnali da adipociti per studiare i cambiamenti endometriali indotti dall'obesità. I tessuti umani sono considerati pericolosi per il rischio biologico e sarà importante prendere le precauzioni appropriate.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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