Name: Rat mammary Epithelial Cell Transplantation nel Pad Grasso Bianco Interscapular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Scopri il trapianto di cellule epiteliali mammarie di ratto nel pad grasso bianco interscapulare. Questa tecnica consolidata da oltre 40 anni consente di studiare gli effetti autonomi delle cellule mammarie rispetto all'ospite nella ricerca sul cancro al seno.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Cancer Center Di Hollings Cancer Center Support Grant P30 CA138313 finanziamenti pilota di ricerca dal National Institutes of Health<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">(https://www.nih.gov/)</a>e fondi dal Dipartimento di Patologia & Medicina di laboratorio presso la Medical University of South Carolina. Ringraziamo Marijne Smiths per aver registrato le dichiarazioni dell'intervista.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive una tecnica di trapianto di cellule epiteliali mammarie ottimizzata per lavorare con i ratti. Gli organoidi epiteliali mammari isolati dai ratti donatori (3-5 settimane di età) vengono innestati nel cuscinetto di grasso bianco interscapular dei ratti ricitti (anche 3-5 settimane di età). I risultati possono essere interpretati appena 4-6 settimane dopo, utilizzando la microscopia leggera per esaminare il tessuto innestato; tuttavia, la quantità ottimale di tempo tra il trapianto e il sacrificio...

Lo sviluppo della ghiandola mammaria postnatale e la morfogenesi duttale sono processi in gran parte influenzati dalla segnalazione ormonale all'inizio della pubertà. Nei topi e nei ratti, organismi modello comunemente usati della biologia della ghiandola mammaria, questo processo inizia intorno a 3 settimane di età, dove la rapida proliferazione e differenziazione provocano la formazione del parenchyma maturo. La ghiandola mammaria matura può subire numerosi cicli di espansione e involuzione, una proprietà che è stata in fase di studio fin dall'inizio del XXsecolo. Nel contesto dell'iperproliferazione e dello sviluppo del cancro, le tecniche di trapianto di ghiandola mammaria sono state sviluppate negli anni '501e potenziate dalla metodologia quantitativa richiesta da Gould et al. nel 19772,3,4. Il perfezionamento della tecnica di trapianto nei roditori ha contribuito a importanti progressi nella comprensione della normale biologia della ghiandola mammaria che sono ancora ampiamente utilizzati per studiare l'effetto di vari trattamenti e la manipolazione genetica sullo sviluppo normale della ghiandola mammaria e sugli stati della malattia.
Molte ipotesi sono state generate e successivamente testate utilizzando il trapianto di ghiandola mammaria, descritto per la prima volta da DeOme et al. Gli esperimenti di diversi decenni hanno mostrato la propensione del tessuto duttale ascisa dalle ghiandole mammarie del donatore per ripopolare l'intero cuscinetto a grasso5,6,7 e ha indicato che una componente critica dello sviluppo della ghiandola mammaria risiede in queste strutture epiteliali. Studi successivi sui topi hanno mostrato che una singola cellula staminale mammaria può ripopolare un cuscinetto di grasso eliminato e ha contribuito alla scoperta di un singolo progenitore comune di cellule epiteliali mammarie basali e luminali8,9,10. In linea con queste conclusioni, è stato suggerito che il trapianto aumenti il pool di cellule con potenziale di ripopolamento multilineato a causa della plasticità, permettendo alle cellule innestate di coltivare una ghiandola mammaria funzionale7,10,11,12,13. È importante sottolineare che l'uso di tecniche di trapianto nei roditori supera i limiti delle anomalie indotte dalla coltura cellulare14 e spesso fornisce risultati in poche settimane.
Mentre la procedura è stata originariamente descritta nel contesto delle lesioni preneoplastiche nei topi, è stata presto ampliata ai ratti e utilizzata in combinazione con il trattamento cancerogeno per stabilire la molteplicità come misura della suscettibilità al cancro15, ma la popolarità delle tecniche di trapianto ha seguito lo sviluppo di strumenti genetici per ogni specie. Anche se gli studi sui topi che incorporano il trapianto hanno contribuito a molti risultati traslazionali, il parenchyma della ghiandola mammaria del ratto assomiglia più da vicinoall'uomo 16,17 e offre vantaggi distinti per lo studio del cancro al seno del recettore estrogeno-positivo (ER). I tumori mammari sono inducibili in entrambe le specie, ma differiscono in termini di sensibilità ormonale e profili di espressione genica. Una differenza primaria è che i tumori mammari del ratto esprimono e dipendono dalla funzione dei recettori dell'ormone ovarico e ipofisario, vale a dire, estrogeni e progesterone (PR), simile al sottotipo luminale-A del cancro al seno umano. Infatti, il trapianto di cellule epiteliali mammarie, come descritto in questo protocollo, è stato utilizzato per studiare le varianti genetiche coinvolte nel cancro al seno e determinare l'autonomia cellulare degli effetti sulle cellule epiteliali mammarie18.
Oltre alla biologia tumorale, l'epitelio duttale della normale ghiandola mammaria del ratto presenta un livello più elevato di ramificazione ed è affiancato da uno strato più spesso di stroma rispetto al topo. L'importanza dello stroma è ben documentata negli studi sui trapianti epiteliali mammari. L'epitelio mammario deve interagire con stroma grasso, e idealmente il proprio mesenchyme, per sottoporsi alla sua caratteristica morfogenesi19,20. L'innesto del tessuto in una ghiandola mammaria ricevente fornisce un ambiente ottimale; tuttavia, la presenza di epitelio endogeno può interferire con i risultati. Il preclearing della ghiandola mammaria dell'epitelio endogeno è comunemente eseguito nei saggi di trapianto di topi e richiede l'escissione chirurgica del tessuto mammario endogeno e/o la rimozione del capezzolo1,21,22. Anche se possibile, il preclearing dell'epitelio mammario nei ratti post-svezzamento non è così ampiamente eseguito, principalmente a causa dell'inefficacia di cancellare l'albero mammario in crescita nei ratti post-svezzamento. Dal momento che è stato dimostrato che le regioni del tessuto adiposo altrove nel corpo potrebbero sostenere la crescita dell'epitelio mammario trapiantato21,23,24, il processo di preclearing può essere facilmente evitato nei ratti innestando tessuto nella pastiglia bianca interscapoare.
Il metodo di trapianto descritto in questo documento prevede l'iniezione di organoidi della ghiandola mammaria enzimaticamente dissociata (frammenti di epitelio duttile mammario e altri tipi di cellule in grado di morfogenesi) o cellule monodisperse nel lassogio di grasso interscapoare in ceppi inbred, isogenici o congenici di ratti di laboratorio2 . Poiché la macchia di grasso interscalpulare è normalmente priva di tessuto mammario, fornisce un ambiente adatto per più siti di trapianto senza la necessità di epitelio endogeno pre-chiaro. Di conseguenza, le ghiandole mammarie endogene dell'animale ospite non sono soggette a manipolazione chirurgica, si sviluppano normalmente e non possono interferire con l'interpretazione dei risultati. Inoltre, le ghiandole mammarie intatte possono essere utilizzate per il confronto per valutare gli effetti dell'ospite rispetto al donatore sullo sviluppo dell'epitelio mammario e sulla tumorigenesi18,25. Anche se il ripopolamento della ghiandola mammaria da una singola cellula staminale è disponibile per i topi, non è ancora stato sviluppato per il ratto, principalmente a causa della mancanza di disponibilità di anticorpi da selezionare per le cellule staminali mammarie diratto 25,26,27. Nonostante questo, il trapianto di cellule epiteliali mammarie monodisperse per quantificare il potenziale di ripopolamento può essere eseguito con successo, e quelle cellule si svilupperanno normalmente quando innestate nel quadro appropriato2,3,4. Mentre gli organoidi sono buoni per molti scopi, le cellule monodisperse sono necessarie per applicazioni quantitative, ad esempio, per determinare il numero di cellule epiteliali mammarie necessarie per l'avvio del cancro in seguito al trattamento con radiazioni ionizzanti28 o per confrontare le caratteristiche del flusso citometricamente selezionato popolazione di cellule epiteliali29.
Ad oggi, la procedura qui descritta è il metodo più robusto per eseguire il trapianto di ghiandola mammaria nel ratto con l'obiettivo generale di studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria e i meccanismi alla base dello sviluppo del cancro al seno. Spesso, il donatore e/o gli animali ricittori sono esposti a variabili diverse prima, durante o dopo il trapianto epiteliale. Gli esempi includono studi genetici singoli che coinvolgono la carcinogenesi chimica30, radiazioni28,31,32, manipolazione genetica del genoma ospite/donatore18e manipolazione ormonale12. Uno dei principali vantaggi della dissociazione enzimatica descritta in questo protocollo è l'opportunità di isolare organoidi epiteliali o cellule monodisperse per esperimenti complementari che coinvolgono citometria di flusso, coltura 3D, modifica genica e altro ancora. Le future applicazioni di questa tecnica includeranno un'ulteriore manipolazione del donatore e/o del tessuto ospite con l'ingegneria genetica. Ad esempio, le cellule donatrici possono essere geneticamente modificate ex vivo in qualsiasi locus genomico scelto utilizzando il sistema di editing genico CRISPR-Cas9. Allo stesso modo, i ratti riceventi possono anche essere geneticamente modificati per studiare l'interazione tra fattori genetici ingegnerizzati del donatore e del ricevente.

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; M filtri per siringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-715G</td><td>Terreno di digestione della collagenasi a filtro sterile</td></tr><tr><td>1,5 - 2,0 mL provette per microcentrifuga (sterili)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>contenente cellule risospese e/o miscela di omogeneizzato cerebrale</td></tr><tr><td>100 &; Filtri per cellule M</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>filtrante cervello omogeneizzato</td></tr><tr><td>Siringhe a tenuta di gas da 100 uL con aghi da 25 gauge</td><td>Hamilton</td><td>81001 e 90525</td><td>Per l'iniezione di una miscela di innesti in animali riceventi (1 per genotipo/condizione del donatore)</td></tr><tr><td>Puntali per pipette da 1000 uL + pipetta</td> <td>-</td><td></td> <td>trasferimento di cellule/miscele/tessuti</td></tr><tr><td>Tubo in polipropilene da 15 mL</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352196</td><td>Stoccaggio della miscela di omogeneizzato cerebrale, o cellula: miscela di omogeneizzato per trapianto</td></tr><tr><td>40 &MICRO; Filtri cellulari</td><td>M Corning</td><td>431750</td><td>organoidi filtranti dopo il lavaggio del pellet cellulare</td></tr><tr><td>Provette in polipropilene da 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td>per la digestione della collagenasi del tessuto della ghiandola mammaria del donatore</td></tr><tr><td>Piastre da 60 mm Thermo</td><td>Scientific</td><td>130181</td><td>per la macinazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Allume Solfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>243361/237086</td><td>colorazione ghiandola mammaria montatura intera diapositive Vaporizzatore</td></tr> per <tr><td>anestesia per uso veterinario</td> <td>-</td><td></td> <td>seguire il protocollo istituzionale</td></tr><tr><td>Beta-dine o iodio</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tubo di coltura in vetro borosilicato per omogeneizzazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>per omogeneizzazione del cervello (utilizzare un tubo appropriato per l'omogeneizzatore)</td></tr> <tr><td>Carmine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6152/1022</td><td>colorazione ghiandola mammaria </td></tr><tr><td>Apparecchi per il conteggio delle cellule</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gabbie per animali pulite per il recupero</td> <td>-</td><td></td> <td>seguire il protocollo istituzionale</td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo 3</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS004183</td><td>digestione enzimatica di tessuto tritato della ghiandola mammaria da ratti donatori acqua</td></tr><tr><td>deionizzata</td> <td>-</td><td></td> <td>per soluzioni chimiche</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320033</td><td>per la macinazione di tessuti, mezzi di digestione collagenasi e miscele di cellule epiteliali risolubili</td></tr><tr><td>EDTA</td> <td>-</td><td></td> <td>miscela monodispersione</td></tr><tr><td>Etanolo, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705/2701</td><td>fissativo per vetrini per montatura intera mammaria, lavaggi per vetrini per montatura intera mammaria, pulizia di siti di incisione chirurgica (diluito)</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS)</td><td></td><td>Soluzione per inattivazione</td>di <td>icloni</td></tr> <tr><td>Garza</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>uso per il fissativo per vetrini per montatura intera mammaria (acido acetico glaciale 1:4 in etanolo al 100%)</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>-</td><td>miscela monodispersione</td></tr><tr><td>Cuscinetti riscaldanti</td><td>-</td><td>-</td><td>seguire il protocollo istituzionale</td></tr><tr><td>Secchielli per il ghiaccio (x2)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice con rotazione orbitale</td><td>-</td><td></td><td>-devono essere in grado di mantenere 37&deg; C, agitazione a 220-225 giri/min (per la digestione della collagenasi del tessuto mammario)</td></tr><tr><td>Anestesia con isoflurano</td> <td>-</td><td></td> <td>seguire il protocollo istituzionale</td></tr><tr><td>Microscopio ottico o fotocamera digitale</td> <td>-</td><td></td> <td>visualizzazione dell'intero epitelio mammario montato e/o acquisizione di immagini</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore meccanico</td><td>Fisher</td> <td>Scientific-TissueMiser</td> <td>o modelli alternativi</td></tr><tr><td>Olio minerale, puro</td><td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td><td>8042-47-5</td><td>conservazione a lungo termine di supporti interi per ghiandola mammaria ripulita Serbatoi di</td></tr><tr><td>ossigeno per vaporizzatore per anestesia</td> <td>-</td><td></td> <td>seguire il protocollo istituzionale</td></tr> <tr><td></td><td>Asciugamani di carta o salviette per attività delicate</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Vetrini per microscopio caricati positivamente</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4981-001</td><td>tessuto della ghiandola mammaria monta intero</td></tr><tr><td>Postoperatorio analgesico</td><td>-</td><td>-</td><td>Protocollo istituzionale</td></tr><tr><td>Misure</td><td></td><td></td><td>del peso corporeo degli animali, dosaggio corretto di farmaci antidolorifici</td></tr><tr><td>Rasoio</td><td>-</td><td>-</td><td>tosatrici elettriche, o altri</td></tr><tr><td>barattoli di colorazione</td><td>-</td><td>-</td><td>minimo di 1 per lavaggio chimico, dimensioni appropriate per il numero di vetrini, vetro preferito</td></tr><tr><td>Teli da campo sterili</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td>utilizzato durante il trapianto</td></tr><tr><td>Forbici e pinze sterili x3 (autoclavato)</td> <td>-</td><td></td> <td>strumenti chirurgici in autoclave utilizzati per donatori e riceventi</td></tr><tr><td>Siringhe: 5 ml (o superiore)</td> <td>-</td><td></td> <td>per la filtrazione sterile dei mezzi di digestione della collagenasi</td></tr><tr><td>Miscela monodispersione</td><td>Trypsin</td><td>Worthington</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente per la raccolta dei rifiuti per liquidi (versati o aspirati)</td> <td>- </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore di clip per ferite, clip e strumento di rimozione</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td>Chiusura dell'incisione cutanea sul tampone bianco interscapolare</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>che elimina la ghiandola mammaria l'intero montaggio scivola dopo la colorazione</td></tr></tbody></table>

rat mammary epithelial cell transplantation nel pad grasso bianco interscapular

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Già negli anni '70, i ricercatori hanno trapiantato con successo cellule epiteliali mammarie nel cuscinetto di grasso bianco interscapoare dei ratti. L'innesto dell'epitelio mammario con tecniche di trapianto sfrutta l'ambiente ormonale fornito dall'ospite di roditori adolescenti. Questi studi sono ideali per esplorare l'impatto di varie manipolazioni biologiche sullo sviluppo della ghiandola mammaria e sezionare molti aspetti della biologia della ghiandola mammaria. Una caratteristica comune, ma limitante, è che le cellule epiteliali trapiantate sono fortemente influenzate dallo stroma circostante e superate dall'epitelio endogeno; per utilizzare il tessuto mammario nativo, il cuscinetto di grasso bianco addominale-inguinale deve essere eliminato per rimuovere l'epitelio mammario ospite prima del trapianto. Un ostacolo importante quando si utilizza l'organismo modello di ratto è che la cancellazione dell'albero mammario in via di sviluppo nei ratti post-svezzamento non è efficiente. Quando trapiantate in cuscinetti di grasso privi di ghiandola, le cellule epiteliali del donatore possono ripopolare il cuscinetto di grasso ospite eliminato e formare una ghiandola mammaria funzionale. Il cuscinetto di grasso interscapular è una posizione alternativa per questi innesti. Un grande vantaggio è che manca di strutture frandutali ma fornisce il normale stroma che è necessario per promuovere la crescita epiteliale ed è facilmente accessibile nel ratto. Un altro grande vantaggio di questa tecnica è che è minimamente invasiva, perché elimina la necessità di cauterizzare e rimuovere l'albero di mammifero endogeno in crescita. Inoltre, il cuscinetto di grasso interscapular contiene un vaso sanguigno mediale che può essere utilizzato per separare i siti per l'innesto. Poiché le ghiandole endogene rimangono intatte, questa tecnica può essere utilizzata anche per studi che confrontano la ghiandola mammaria endogena con la ghiandola trapiantata. Questo documento descrive il metodo di trapianto di cellule epiteliali mammarie nel cuscinetto di grasso bianco interscapular di ratti.

Donatore e trighi mammarie destinatarie I passaggi per isolare e preparare le cellule epiteliali mammarie del ratto per il trapianto sono illustrati nella Figura 1A. A 4 settimane di età, la ghiandola mammaria endogena del ratto donatore ha iniziato la maturazione e l'epitelio può essere visualizzato su interi vetrini montati macchiati con carmine di allume (Figura 1</stron...

Questo articolo descrive un metodo di trapianto per innestare cellule epiteliali mammarie del donatore nel cuscinetto di grasso bianco interscapular degli animali riceventi. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare gli effetti dell'ospite e/o del donatore sullo sviluppo dell'epitelio mammario ed elimina la necessità di pre-clearing, estendendo così l'utilità di questa tecnica.

Rat mammary Epithelial Cell Transplantation nel Pad Grasso Bianco Interscapular

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Questo protocollo è stato utilizzato per oltre 40 anni e rimane l'unico metodo affidabile per i test di trapianto di cellule mammarie nel ratto. Questo metodo è ampiamente usato per interrogare gli effetti autonomi delle cellule mammarie rispetto agli ospiti nella ricerca sulla suscettibilità al cancro al seno. Innestando nel cuscinetto di grasso interscapulare, questo metodo evita di dover cancellare l'epitelio della membrana endogena che non è efficace nei ratti.Il metodo è quindi meno invasivo e le ghiandole mammarie endogene possono essere utilizzate come controllo interno. Per iniziare questa procedura, posizionare un topo femmina eutanasiato sulla schiena e fissarlo con spilli. Spruzzare l'intera superficie ventrale con il 70% di etanolo.Fai un'incisione a forma di Y sagittale che consente l'accesso a ghiandole mammarie toraciche, addominali e inguinali. Usa le forbici per sezionare tutto il tessuto della ghiandola mammaria dal ratto donatore e rimuovere tutti i linfonodi visibili. Quindi, utilizzare le forcelle per estrarre il tessuto mammario.Posizionarlo in un piatto etichettato da 60 millimetri contenente 500 microlitri di supporti DMEM F12 senza siero e tenerlo sul ghiaccio. Quindi usa le forbici per tritare finemente il tessuto mammario. In primo luogo, girare attentamente il corpo dell'animale donatore per posizionarlo in una posizione incline e fissarlo con i perni.Spruzzare la testa e la parte superiore della schiena con il 70% di etanolo. Individuare la base del cranio e fare un'incisione sotto i condili occipitali, inserire forbici affilate sotto la pelle e tagliare la pelle lontano dal cranio compresi i lati della testa. Successivamente, utilizzare tagliatori ossei o forbici forti per tagliare il cranio lungo la linea mediana dalle ossa occipitali a quelle frontali, assicurandosi di mantenere la lama il più superficiale possibile e inclinata verso l'alto per prevenire la distruzione del tessuto cerebrale sottostante.Usa Rongeurs o forti forcep per staccare l'osso. Inserire l'utensile lateralmente al cervelletto per rompere l'osso su entrambi i lati. Sever i collegamenti con le meningi esponendo completamente il canale uditivo.Usa le forcep curve a punta fine per sollevare il cervello dal cranio e registrarne il peso. Usa un nuovo inizio di rifornimenti per ulteriori cervelli donatori. Trasferiscilo immediatamente in un tubo da 15 millilitri contenente una quantità uguale di supporto che viene immagazzinato sul ghiaccio.Omogeneizzare il cervello per 10-15 secondi a bassa velocità. Quindi filtrare l'omogeneato per rimuovere pezzi di grandi dimensioni. Conservare il liquido sul ghiaccio fino a quando necessario.Per prima cosa, tagliare un centimetro dall'estremità di una punta della pipetta da 1.000 microliter e posizionarlo manualmente sul pipettor. Utilizzare una punta di pipetta tagliata per trasferire il tessuto donatore tritato da ogni piatto da 60 millimetri al tubo di digestione della collagenasi. Mescolare delicatamente il tessuto tritato tubazione su e giù da una a due volte.Quindi fissare i campioni in posizione orizzontale nell'incubatore di scuotimento. Lasciare digerire i campioni per 1,5-2 ore a 37 gradi Celsius mentre si tremano a una velocità compresa tra 200 e 220 giri/min. Quando il tessuto della ghiandola mammaria del donatore è completamente digerito, centrifugare la sospensione a 1.200 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Dopo aver assicurarsi che si sia formato un pellet, utilizzare una pipetta per rimuovere lo strato di grasso o versare con cura il supernatante. Riutilizzare delicatamente il pellet in 10 millilitri di supporti DMEM F12 freschi. Ripetere questo processo per lavare accuratamente le cellule.Preparare un tubo da 50 millilitri con un colino da 40 micrometri per ogni animale donatore. Pre-bagnare il colino con almeno un millilitro di supporti DMEM F12. Quindi utilizzare una pipetta per passare la sospensione cellulare attraverso il filtro per raccogliere frammenti duttali o organoidi.Per gli organoidi, mantenere solo le celle che rimangono nel filtro. Invertire il filtro cellulare su un nuovo tubo da 50 millilitri e risciacquare con qualsiasi volume di mezzi sterili necessari per raccogliere tutte le cellule. Dopo questo, pellet le cellule ancora una volta e rimorsi in un piccolo volume di mezzi per il conteggio.Preparare singoli lotti di materiale donatore per tutti i riceventi del trapianto combinando volumi uguali della sospensione cellulare con omogeneato cerebrale al 50% per ogni sito di trapianto. In primo luogo, identificare la base del cranio e l'inizio della colonna vertebrale su un animale ricevente. Circa un terzo della strada lungo la colonna vertebrale, radersi un'area di tre centimetri per due centimetri sulla parte toracica superiore della schiena.Successivamente, preparare il campo sterile che verrà utilizzato per l'intervento chirurgico e organizzare tutte le forniture necessarie. Sciacquare le siringhe Hamilton con mezzi DMEM F12 sterili per evitare la perdita di cellule. Caricare l'intero volume di materiale donatore in una siringa separata per ogni condizione.Dopo che la siringa è stata completamente caricata, invertirla e premere leggermente lo stantuffo per rimuovere le bolle d'aria sulla punta dell'ago. Tenere la siringa sul ghiaccio per tutta la procedura. Assicurarsi che l'animale rimanga insensinte agli stimoli profondi con un dito fermo.Quindi utilizzare una lama chirurgica affilata per fare una piccola incisione interscapulare. Individuare il vaso sanguigno mediale per l'orientamento e utilizzare le forcep per sollevare la pelle su un lato dell'incisione. Tenere la pelle lontana dal cuscinetto grasso ed evitare il grasso bruno sottostante durante l'eseguito il trapianto.Quindi, inserire l'ago nel sito di innesto. Iniettare con cura 40 microlitri della miscela cellulare nel tessuto interscapulare del cuscinetto adiposo bianco. Rimuovere lentamente l'ago.Tenere il tessuto in posizione e consentire alle cellule trapiantate di depositarsi per tre o cinque secondi. Ripetere l'intera procedura di iniezione come descritto in precedenza nel secondo sito di trapianto. Successivamente, chiudere la ferita chirurgica usando clip o suture della ferita e quindi interrompere l'anestesia.Dopo aver sacrificato l'animale, preparalo per la dissezione. Identificare il vaso sanguigno mediale che separa i siti di innesto nel cuscinetto di grasso interscapulare. Asportare l'intero cuscinetto come un singolo pezzo di tessuto.Posizionare il tessuto su uno scivolo al microscopio caricato positivamente per l'intero supporto. Posizionare le diapositive in etanolo al 70% per sette-10 giorni per disgrassare il tessuto. Quindi preparare la macchia di carminio dell'allume ed elaborare le diapositive quando il tessuto è sufficientemente opaco.Quando l'elaborazione è completa e il tessuto sullo scivolo si è cancellato, utilizzare la microscopia a bassa potenza o la fotografia digitale ad alta risoluzione per acquisire immagini delle diapositive per l'analisi. In questo studio, le cellule epiteliali mammarie vengono trapiantate utilizzando una tecnica ottimizzata per lavorare con ratti in cui gli organoidi epiteliali mammari isolati dai ratti donatori sono innestati nel cuscinetto di grasso bianco interscapulare dei ratti riceventi. La presenza, l'assenza o l'abbondanza di epitelio possono essere valutate per determinare il successo dell'esperimento così come l'autonomia degli effetti relativi alle variabili sperimentali.Un esperimento di trapianto reciproco in cui ogni fattore ha due livelli come il tipo selvaggio rispetto al knockout creerà quattro gruppi di trapianti per il test delle ipotesi. Il cuscinetto di grasso interscapulare intero rappresentativo mostrato qui contiene una crescita epiteliale positiva in entrambi i siti di trapianto. Quando si analizzano le diapositive, la mancanza di epitelio nel cuscinetto di grasso interscapulare su molti campioni può indicare un problema tecnico con la procedura e deve essere trattata come un risultato negativo.La crescita epiteliale del donatore può anche essere paragonata alla ghiandola mammaria endogena e può facilitare ulteriori conclusioni. Nell'esempio qui mostrato, i risultati del trapianto reciproco utilizzando ratti knockout di tipo selvaggio e CDKN1B hanno suggerito effetti autonomi delle cellule non mammarie sullo sviluppo della ghiandola mammaria. Ricorda che le cellule epiteliali e gli organoidi del donatore devono essere preparati con cura e tenuti in vita fino a quando non vengono iniettati nell'animale ricevente.È imperativo pianificare in anticipo ed eseguire la procedura con attenzione e senza interruzioni. I test di cancerogenesi primaria possono essere eseguiti dopo il trapianto per interrogare l'autonomia delle cellule mammarie nell'eziologia o nel trattamento del cancro al seno. L'editing genico può anche essere incorporato per ingegnerizzare geneticamente le cellule donatrici o il ratto ricevente.Come unico metodo per eseguire il trapianto di cellule epiteliali mammarie nei ratti, questa procedura facilita lo sviluppo della ghiandola mammaria e gli studi sulla cancerogenesi. Questa tecnica è particolarmente importante per la ricerca delle interazioni tra le cellule tumorali del seno e/o le cellule epiteliali mammarie con il microambiente ospite. Consente studi nello sviluppo della ghiandola mammaria e nella ricerca sul cancro al seno.Coloro che tentano questa tecnica per la prima volta dovrebbero ottimizzare i preparati cellulari del donatore per garantire la massima resa e vitalità delle cellule, quindi eseguire piccoli esperimenti pilota per praticare procedure chirurgiche e determinare il numero di cellule da iniettare e anche determinare i tempi di incubazione post-chirurgica necessari per gli esperimenti.

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Questo articolo illustra la procedura sviluppata da DeOme...

Procedura di trapianto epiteliali mammarie

In questo rapporto, si dimostra un sistema per isolare la cultura e le cellule del donatore dalla ghiandola mammaria del mouse, e ortotopicamente trapianto di queste cellule in topi riceventi per analizzare stromali: interazioni epiteliali durante lo sviluppo del tumore mammario.

Trapianto mammaria di cellule stromali e cellule di carcinoma in topi C57BL/6J

In questo articolo discutiamo su come stabilire un modello di cancro al seno nei topi femmina iniettando cellule di cancro al seno nel cuscinetto adiposo mammario. Il protocollo di esempio illustra l'iniezione ortotopica.

Iniezione ortotopica nel cuscinetto adiposo mammario: stabilire il cancro al seno nei topi

Il video dimostra la tecnica di inoculazione ortotopica del cancro al seno in un modello murino. Questa tecnica produce un alto tasso di tumorigenesi con una minore variabilità nelle dimensioni e nella forma del tumore rispetto all'iniezione sottocutanea o non chirurgica.

Iniezione ortotopica: impianto di cellule tumorali tessuto-specifiche in un topo adulto

Il cancro è una malattia complessa che è influenzata dal tessuto circostante il tumore nonché pro- locale e anti-infiammatori mediatori. Pertanto, modelli iniezione ortotropici, anziché modelli sottocutanee possono essere utili per studiare la progressione del cancro in un modo che imita migliori patologia umana.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Questo protocollo descrive metodi per purificare, quantificare e caratterizzare vescicole extracellulari (EVs) / esosomi da cellule epiteliali mammarie non aderenti / mesenchimali e per usarle per trasferire la capacità di formazione delle ghiandole mammarie alle cellule epiteliali mammarie luminali. EVs / esosomi derivati ​​da cellule epiteliali mammarie simili a stelo possono trasferire questa proprietà cellulare alle cellule che ingeriscono gli EV / esosomi.

Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari

Questo lavoro dimostra un nuovo approccio per valutare la proliferazione, la differenziazione e il potenziale di formazione delle vascelle di cellule staminali endoteliali (VESCs) attraverso il trapianto di grassi mammarie, seguito da una preparazione del tessuto a tutto sesto per l'osservazione microscopica. Viene inoltre presentata una strategia di tracciamento delle linee per indagare il comportamento dei VESC in vivo .

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

Qui, presentiamo un protocollo per impiantare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, meno invasiva e facile da maneggiare, e questo modello di cancro al seno ortotopico del topo con un ambiente adeguato cuscinetto grasso mammario può essere utilizzato per approfondire vari aspetti della cancro.

Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e i modelli murini trapiantabili geneticamente modificati ricapitolano fedelmente la malattia umana e sono modelli preferiti per la ricerca di base e traslazionale sul cancro al seno. Qui, viene descritto un metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario per studiare la biologia del tumore e valutare la risposta al farmaco.

Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno

Mancano modelli pre-clinici che valutano la terapia adiuvante che mirano alla metastasi del cancro al seno. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un modello murino di metastasi adenocarcinomi mammarie polmonari de novo , in cui le terapie somministrate nell'ambiente adiuvante (resezione chirurgica postale dei tumori primari) possono essere valutate per efficacia nell'effetto delle metastasi polmonari precedentemente seminate.

Procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di De Novo Metastasi del cancro del mammario

Scopri il trapianto di cellule epiteliali mammarie di ratto nel pad grasso bianco interscapulare. Questa tecnica consolidata da oltre 40 anni consente di studiare gli effetti autonomi delle cellule mammarie rispetto all'ospite nella ricerca sul cancro al seno.

Rat mammary Epithelial Cell Transplantation nel Pad Grasso Bianco Interscapular

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