Stima stereologica della lunghezza della fibra colinergica nel Nucleus Basalis di Meynert del cervello del topo
5 febbraio 2020
Lunghezza della fibra neuronale all'interno di una struttura tridimensionale di una regione del cervello è un parametro affidabile per quantificare specifica integrità strutturale neuronale o degenerazione. Questo articolo descrive in dettaglio un metodo di quantificazione stereologica per misurare la lunghezza della fibra colinergica all'interno del nucleo basalis di Meynert nei topi come esempio.
La neurodenegrazione in molti disturbi neurologici è un processo cronico di cui la perdita di fibre neuronali si verifica spesso prima della perdita del corpo cellulare. La quantificazione stereologica delle fibre neuronali in tre dimensioni fornisce un metodo sensibile e accurato per rilevare i primi cambiamenti neurodegenerativi. Questa tecnologia utilizza il frazionamento imparziale affidabile ed efficiente basato su computer delle palle spaziali per misurare le lunghezze di strutture simili a linee come le fibre neuronali in 3D.
A dimostrare la procedura saranno Prabhakar Singh, un post-doc e il nostro esperto di stereologia, e David Peng, l'assistente di ricerca nel mio laboratorio. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale nel topo anestetizzato, perfondere trascardialmente con circa 50 millilitri di DPBS molare ghiacciato 0,1, seguito da circa 25 millilitri di 4%PFA in 0,1 PBS molare. Alla fine della perfusione, post-fissare il cervello in un contenitore di 4%PFA fresco per 24 ore a quattro gradi Celsius.
Il giorno dopo, lavare il cervello con tre lavaggi da uno a due minuti in DPBS fresco per lavaggio e trasferire il cervello in un saccarosio del 15% in soluzione DPBS 0.1 durante la notte. La mattina seguente, metti il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% e 0,1 DPBS molare per 48 ore a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, trasferire il cervello in una camera criotoma pre-impostata a meno 20 gradi Celsius.
Il cervello può essere tenuto in tubi sigillati e conservato a meno 80 gradi Celsius. Per il sezionamento, incorporare il campione di tessuto in un mezzo di incorporamento ottimale della temperatura di taglio e montare il campione su un disco campione. Quindi acquisire sezioni seriali spesse 30 micrometri in un piano coronale nel criotomo, trasferendo ogni sezione in singoli pozzi di una piastra di coltura di 24 porri contenente soluzione crioprotettiva in preparazione per lo stoccaggio di meno 20 gradi Celsius.
Per identificare la prima e l'ultima sezione di ogni cervello, confrontare le caratteristiche morfologiche con un atlante cerebrale standard del mouse. NBM inizia da bregma meno 0,0 millimetri e termina a meno 1,6 millimetri. La selezione di ogni ottava sezione produce un totale di sei-sette sezioni e consente un coefficiente di errore appropriato sia per una stima del volume che della lunghezza della fibra.
Per l'etichettatura immunoistochimica delle sezioni tissutali, dopo aver bloccato qualsiasi legame non specifico con siero bovino normale al 10% nello 0,1%Tritone X-100 nella soluzione salina tamponata da Tris, etichettare le sezioni con l'anticorpo primario di interesse per 48 ore a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte per tre minuti in soluzione salina tris-tamponata fresca per lavaggio, seguita da incubazione con un anticorpo secondario biotinilato appropriato per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte in soluzione salina tris-tamponata fresca come dimostrato, seguita dalla colorazione con complesso di perossidasi di biotina Avidin e soluzione di substrato perossidasi DAB secondo i protocolli del produttore.
Dopo il lavaggio, montare tutte le sezioni da un campione di tessuto cerebrale su uno scivolo gelatinizzato e lasciare asciugare i campioni all'aria. Per disidratare le sezioni, immergere i campioni due volte per cinque minuti per diluizione in soluzioni sequenziali ascendenti di etanolo come indicato, seguita da schiaritura con due lavaggi in xilene di 10 minuti. Quindi utilizzare un mezzo di montaggio appropriato per posizionare le copertine sulle diapositive.
Per la stereologia, aprire un nuovo studio nel software. Si aprirà una finestra di dialogo per l'inizializzazione dello studio. Compilare le informazioni sullo studio e verificare che sia selezionata l'opzione basata su frazioni a più livelli.
Fare doppio clic sul volume per aprire la finestra di dialogo volume. Assegnare un nome alla feature di interesse e selezionare la sonda di conteggio dei punti regione e fare clic su Avanti. Fate doppio clic sulla lunghezza e fornite un nome della feature.
Selezionate sonda sfera e fate clic su Avanti (Next). Nella casella di inizializzazione del caso, per codificare i gruppi prima di iniziare lo studio, impostare il numero totale di sezioni a partire dalla prima sezione contenente l'area di interesse fino all'ultima sezione contenente l'area di interesse e l'intervallo di campionamento della sezione a otto. Fare clic accanto per aprire la finestra di dialogo di inizializzazione del probe che imposta automaticamente l'ingrandimento più basso per la selezione dell'area e la stima del volume e conferma le impostazioni.
Fare clic su anteprima per verificare se l'area di interesse può essere identificata con l'ingrandimento inferiore selezionato. Immettere 50.000 micrometri cubo per punto per la frazione di volume dell'area e fare clic su anteprima e fine. In ingrandimento elevato oggetto, impostate la lunghezza su 63X e fate doppio clic sulla lunghezza per aprire la finestra di dialogo della sfera di lunghezza.
Impostare il diametro di questa sfera su 10 micrometri e fare clic su fatto. Impostate i valori appropriati per l'area del fotogramma, l'altezza del fotogramma, la zona di protezione e la spaziatura del fotogramma. Quindi fare clic su Avanti e seguire le istruzioni fornite dal software.
Per inserire la prima sezione, posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio sotto un obiettivo 5X e fare clic sulla freccia verde per disegnare un limite arbitrario attorno all'NBM per definire la regione di interesse. Fare clic sulla freccia verde e fare per modificare l'obiettivo 63X per ottenere le misurazioni in fibra della frazione corrente. Verrà visualizzata la finestra di dialogo spessore sezione.
Impostate la superficie superiore e inferiore della sezione per misurare lo spessore effettivo della sezione utilizzando la manopola di messa a fuoco manuale dell'asse Z e fate clic su Fatto (Done). Spostate lentamente l'asse Z dall'alto verso il basso nell'altezza del fotogramma della sezione per contrassegnare tutte le fibre intersecante sulla superficie della sonda a sfera virtuale. Quando tutte le fibre sono state contrassegnate, fare clic accanto per passare alla posizione successiva.
Una volta completate tutte le frazioni, fare clic sulla freccia verde. Il software chiederà di inserire la sezione successiva. Portare a fuoco il campione successivo sulla diapositiva utilizzando l'obiettivo 5X e ripetere la misurazione della fibra come appena dimostrato.
Una volta misurate tutte le sezioni, il software genererà un risultato per il caso che mostra il coefficiente dei valori di errore. Se il coefficiente di errore è accettabile, procedere al caso successivo. Se il coefficiente di errore non è accettabile, il software fornirà raccomandazioni per modificare alcuni dei parametri.
Una volta completati tutti i casi, generare risultati per ogni caso e gruppo. In questo esperimento rappresentativo, il gruppo proteico precursore beta amiloide mutante svedese ha dimostrato una lunghezza delle fibre significativamente inferiore e una densità di lunghezza delle fibre rispetto ai loro accoppiamenti di lettiera di tipo selvatico. I risultati hanno anche mostrato che non c'era alcuna differenza significativa nel volume dell'NBM tra i due gruppi analizzati.
Questa tecnica richiede una corretta acquisizione nell'orientamento corretto e un buon metodo di colorazione con il periodo di incubazione. Il protocollo stereologico può essere utilizzato per la stima di qualsiasi profilo lineare come altre fibre neuronali, processi astrociti o persino profili vascolari.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo stereologico per la quantificazione della lunghezza delle fibre colinergiche nel nucleo basale di Meynert nei topi, un parametro fondamentale per valutare l'integrità neuronale nei processi neurodegenerativi. Sfruttando un'analisi tridimensionale, la tecnica offre una sensibilità maggiore per la rilevazione precoce della perdita delle fibre neuronali prima della degenerazione del corpo cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neurodegenerazione
- Stereologia
Sfondo
- La neurodegenerazione precede la perdita del corpo cellulare neuronale, spesso contrassegnata dalla perdita di fibre.
- I metodi stereologici consentono misurazioni tridimensionali precise delle strutture neuronali.
- Le fibre colinergiche svolgono ruoli significativi nelle funzioni cognitive e nelle malattie neurodegenerative.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per la quantificazione stereologica della lunghezza delle fibre colinergiche.
- Dimostrare l'applicazione di questo metodo in una regione cerebrale specifica.
- Facilitare la rilevazione precoce dei cambiamenti neurodegenerativi.
Metodi Utilizzati
- Lo studio utilizza tecniche stereologiche per quantificare le fibre neuronali in tre dimensioni.
- I topi costituiscono il modello biologico per valutare le fibre colinergiche nel nucleo basale di Meynert.
- La metodologia comprende una preparazione dettagliata dei tessuti, la sezionatura e l'etichettatura immunohistochimica.
- L'analisi basata su computer è impiegata per una quantificazione senza bias e la stima dei parametri.
Risultati principali
- Il metodo stereologico misura in modo efficace la lunghezza delle fibre colinergiche, dimostrando la capacità di rilevare i primi segni di degenerazione.
- I risultati quantitativi mostrano il potenziale per la valutazione dell'integrità strutturale in condizioni neurodegenerative.
- I risultati indicano un protocollo che garantisce accuratezza e riproducibilità nella misurazione della lunghezza delle fibre.
Conclusioni
- Questo studio sottolinea l'importanza dei metodi stereologici nello studio della neurodegenerazione.
- La metodologia consente strategie di intervento precoce identificando la degenerazione prima della perdita cellulare.
- Le informazioni ottenute facilitano una migliore comprensione dell'integrità del sistema colinergico e dei potenziali bersagli terapeutici nelle malattie neurodegenerative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione della lunghezza delle fibre colinergiche nel nucleo basale di Meynert fornisce un biomarcatore sensibile per le prime alterazioni neurodegenerative, consentendo la validazione degli obiettivi in modelli preclinici di declino cognitivo. Questo approccio stereologico supporta la riduzione del rischio meccanicistico rilevando la perdita assonale prima della degenerazione del corpo cellulare, migliorando la previsione nell'analisi terapeutica. Il metodo potenzia la continuità traslazionale collegando l'integrità strutturale ai risultati funzionali in sistemi pertinenti alla malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'integrità del sistema colinergico come ipotesi terapeutica nei modelli di malattie neurodegenerative.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni quantitative e prive di bias della lunghezza delle fibre per chiarire l'interazione con bersagli specifici del percorso.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico rilevando la perdita assonale precoce, migliorando la fiducia nel bersaglio durante l'identificazione dei composti promettenti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi standardizzati e riproducibili sulla lunghezza delle fibre colinergiche, consentendo una valutazione affidabile dei composti.
- Valore operativo: Favorisce la prontezza del saggio attraverso parametri definiti di sezionamento, colorazione e software stereologico, per un screening scalabile.
- Valore scientifico: Fornisce metriche sulla densità di lunghezza e sul coefficiente di errore, supportando la qualità dei dati e la comparabilità tra studi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra la rilevanza clinica collegando la riduzione della lunghezza delle fibre colinergiche in modelli transgenici a fenotipi neurodegenerativi.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica mediante una quantificazione coerente della lunghezza delle fibre in diversi genotipi.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento con rischio calibrato identificando una perdita significativa di fibre senza effetti confondenti dovuti a variazioni volumetriche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta per valutare l'interazione con il bersaglio nei percorsi colinergici, supportando l'identificazione dei composti promettenti attraverso letture quantitative dell'integrità assonale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla degenerazione colinergica mediante la stima imparziale della lunghezza delle fibre in 3D in regioni cerebrali rilevanti per la malattia.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio grazie a un processo standardizzato di preparazione dei tessuti, immunomarcatura e impostazioni del sonda stereologica per misurazioni delle fibre riproducibili.
- Analisi: Fornisce output relativi alla lunghezza delle fibre, alla densità di lunghezza e al coefficiente di errore, consentendo confronti quantitativi tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica validando la perdita di fibre come biomarcatore allineato al progresso neurodegenerativo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la quantificazione di qualsiasi profilo neurale o vascolare lineare, estendendone l'utilità oltre i sistemi colinergici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva rilevando la degenerazione assonale precoce, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso protocolli di stereologia definiti e frazionamento imparziale basato su software.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati precoci su biomarcatori, aumentando l'efficienza del capitale e riducendo i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione aggiustata per il rischio in base ai cambiamenti nella lunghezza delle fibre, sostenendo le decisioni di avanzamento nei percorsi per malattie neurodegenerative.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in stereologia, immunohistochemia e microscopia confocale o a campo chiaro per una marcatura accurata delle fibre.
- Richiede un software stereologico in grado di effettuare analisi con sonda "space ball" e un microtomo per sezionamenti costanti di 30 micrometri.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per fissazione, intervallo di sezionamento (ogni ottavo sezione) e impostazioni della sonda (diametro della sfera di 10µm) per garantire riproducibilità.
- Richiede una validazione dell'adattamento quando applicato ad altri profili lineari, come fibre dopaminergiche o profili vascolari, a causa delle differenze nella densità di marcatura.
- È limitato dalla qualità del tessuto e dalla costanza della colorazione, che influenzano direttamente il rilevamento delle fibre e l'accettabilità del coefficiente di errore.
