Name: Un modello di ipertensione oculare indotta da olio di silicone reversibile nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-15T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri un modello di ipertensione oculare reversibile nei topi mediante iniezione intracamerale di olio di silicone. Questo metodo permette di studiare la neurodegenerazione glaucomatosa e testare terapie neuroprotettive in vivo.

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Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni NIH EY024932, EY023295 ed EY028106 a YH.

Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University.
1. Induzione dell'ipertensione oculare mediante iniezione intracamerale di SO
<ol><li>Preparare una micropipetta di vetro per l'iniezione intracamerale SO tirando un capillare di vetro con un tiratore pipetta per generare una micropipetta. Tagliare un'apertura sulla punta della micropipetta e affilare ulteriormente la punta con una macchina a sferzatura microgrinder per fare una sferzata di 35-40 gradi.</li>
	<li>Polacco i bordi della svegliata e rimuovere tutti i detriti lavando con acqua. Autoclave la micropipetta prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare l'ago della paracentesi per l'ingresso corneale. Per farlo, attaccare un ago da 32 G a una siringa da 5 mL su una serratura Luer e fissarlo ulteriormente con del nastro adesivo. Piegare la punta di smusso dell'ago a faccia in su a 30 gradi.</li>
	<li>Preparare l'iniettore SO attaccando e fissando un ago di estremità smussata 18 G su una siringa da 10 mL prima. Quindi collegare un tubo di plastica con l'ago 18 G su un'estremità e riempire con SO come necessario attraverso l'altra estremità.</li>
	<li>Attaccare la micropipetta sterilizzata al tubo di plastica e spingere lo stantuffo di siringa per riempire l'intera micropipetta con SO.</li>
</ol>2. Iniezione SO intracamerale per un occhio
<ol><li>Mettete un topo maschio C57B6/J di 9-10 settimane in una camera di induzione con il 3% di isoflurane mescolato con ossigeno a 2 L/min per 3 min.</li>
	<li>Intraperitonealmente iniettare 2,2,2-tribromoetanolo a 0,3 mg/g peso corporeo. NOTA: A differenza della chetamina/xylazina, 2,2,2 tribromoetanolo non causa dilatazione della pupilla evidente.</li>
	<li>Controllare la mancanza di risposta a un pizzico di punta e la mancanza di movimento dei baffi o della coda per determinare la forza anestetica.</li>
	<li>Posizionare il mouse in posizione laterale su una piattaforma chirurgica. Per ridurre la sua sensibilità durante la procedura, applicare una goccia di 0,5% di cloruro proparacaina alla cornea prima dell'iniezione.</li>
	<li>Fare un'incisione di ingresso con l'ago di paracentesi 32 G al quadrante superotemporale, a circa 0,5 mm dal limbo.</li>
	<li>Tunnel attraverso gli strati della cornea per circa 0,3 mm prima di piercing nella camera anteriore. Fare attenzione a non toccare l'obiettivo o l'iride.</li>
	<li>Ritirare lentamente l'ago per liberare un umore acquoso (circa 1/2 -L) dalla camera anteriore attraverso il tunnel (paracentesi).</li>
	<li>Attendere 8 min per diminuire ulteriormente l'IOP. Questo può essere determinato misurando l'occhio di controllo contraplaterale.</li>
	<li>Inserire la micropipetta di vetro precaricata con SO attraverso il tunnel corneale nella camera anteriore, con la svella rivolta verso la superficie dell'iride.</li>
	<li>Spingere lentamente lo stantuffo della siringa per iniettare SO nella camera anteriore fino a quando la goccia SO copre la maggior parte della superficie dell'iride, con un diametro di 2,2,4 mm.</li>
	<li>Lasciare la micropipetta nella camera anteriore per altri 10 s prima di ritirarla lentamente.</li>
	<li>Spingere delicatamente la palpebra superiore per chiudere l'incisione della cornea per ridurre al minimo la perdita di SO.</li>
	<li>Applicare unguento antibiotico (bacitracina-neomicina-polimyxin) sulla superficie dell'occhio.</li>
	<li>Durante la procedura, spesso inumidire la cornea con lacrime artificiali.</li>
	<li>Tenere il mouse sulla piastra di riscaldamento fino a quando completamente recuperato dall'anestesia.</li>
</ol>3. Rimozione SO
<ol><li>Preparare il sistema di irrigazione.<ol>
<li>Preparare la soluzione di irrigazione secondo le istruzioni del produttore e inserirla nella bottiglia di irrigazione. Eleva la bottiglia della soluzione di irrigazione a 110-120 cm (81-88 mmHg) sopra la piattaforma di chirurgia.</li>
		<li>Attaccare un set di somministrazione IV alla bottiglia della soluzione di irrigazione. Rimuovere le bolle d'aria dal tubo IV. Collegare un ago da 33 G piegato a 20 gradi faccia a faccia in su fino al tubo IV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare il sistema di drenaggio, rimuovere lo stantuffo da una siringa da 1 mL. Fissare un ago da 33 G alla siringa e piegare l'ago a 20 gradi.</li>
	<li>Rimuovere SO dalla camera anteriore.<ol>
<li>Intraperitonealmente iniettare 2,2,2-tribromoetanolo (0,3 mg/g di peso corporeo). Controllare la mancanza di risposta al pizzico della punta per determinare la forza anestetica e la mancanza di movimento dei baffi o della coda.</li>
		<li>Posizionare il mouse su una piattaforma chirurgica e fissarlo in posizione laterale con nastro adesivo. Applicare una goccia di 0,5% di cloruro proparacaina alla cornea per ridurne la sensibilità.</li>
		<li>Fare due incisioni nel quadrante temporale della cornea tra i 2 e le 5 dollari sul bordo della gocciolina SO utilizzando l'ago prefatto da 32 G paracentesi.</li>
		<li>Inserire un ago di irrigazione da 33 G collegato alla soluzione di irrigazione attraverso un'incisione corneale, velocità massima.</li>
		<li>Inserire un altro ago di drenaggio da 33 G attaccato alla siringa senza uno stantuffo attraverso l'altra incisione corneale per consentire alla goccia SO di uscire dalla camera anteriore durante l'irrigazione con soluzione di irrigazione.</li>
		<li>Ritirare l'ago di drenaggio, quindi l'ago di irrigazione.</li>
		<li>Iniettare una bolla d'aria nella camera anteriore per mantenere la profondità normale e premere per chiudere l'incisione corneale.</li>
		<li>Applicare unguento antibiotico su entrambi gli occhi.</li>
		<li>Tenere il mouse sul pad di recupero di riscaldamento fino a quando completamente recuperato dall'anestesia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Misurazione IOP una volta alla settimana
<ol><li>Posizionare il topo in una camera di induzione perfusa con 3% isoflurane mescolato con ossigeno a 2L/min per 3 min.</li>
	<li>Intraperitonealmente iniettare xillazina e ketamina (0,01 mg di xilolazina/g, 0,08 mg di ketamina/g).</li>
	<li>Mantenere la cornea umida applicando lacrime artificiali per tutta la procedura.</li>
	<li>Attendere circa 15 min per consentire alla pupilla di dilatarsi completamente.</li>
	<li>Misurare l'IOP di entrambi gli occhi utilizzando un tonometro secondo le istruzioni del prodotto. Portare il tonometro vicino all'occhio del mouse. Mantenere la distanza dalla punta della sonda alla cornea del topo a circa 3,4 mm. Premere il pulsante di misurazione 6x per generare una lettura. Da ogni occhio si ottengono tre letture generate dalla macchina per acquisire l'IOP medio.</li>
	<li>Sacrificare gli animali a 8 settimane dopo l'iniezione di SO ed eseguire l'immunosofia della retina a montaggio intero, il conteggio RGC, le sezioni semi-sottili nervo ottico (ON) e la quantificazione degli assoni sopravvissuti, che sono stati descritti prima delle13.</li>
</ol>

<ol><li>Chang, E. E., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glaucoma+2.0%3A+neuroprotection%2C+neuroregeneration%2C+neuroenhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement.</a> Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).</li>
<li>Tham, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+glaucoma+and+projections+of+glaucoma+burden+through+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).</li>
<li>Pang, I. H., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+glaucoma+retinopathy+and+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy.</a> Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).</li>
<li>Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+models+for+glaucoma+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat models for glaucoma research.</a> Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).</li>
<li>McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+retinal+ganglion+cell+death+and+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma.</a> Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rodent+Model+of+Glaucoma+and+Its+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Asia+Pacific+Journal+of+Ophthalmology+%28Philadelphia%29%22%5BJournal%5D)">The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications.</a> Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).</li>
<li>Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbead+occlusion+model%3A+a+paradigm+for+induced+ocular+hypertension+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+neuropathy+due+to+microbead-induced+elevated+intraocular+pressure+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).</li>
<li>Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+to+experimental+glaucoma+among+3+mouse+strains+using+bead+and+viscoelastic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection.</a> Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).</li>
<li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li>
<li>Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+oil+induced+glaucoma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Archieves+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Silicone oil induced glaucoma: a review.</a> Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).</li>
<li>Kornmann, H. L., Gedde, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glaucoma+management+after+vitreoretinal+surgeries%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Glaucoma management after vitreoretinal surgeries.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+oil-induced+ocular+hypertension+and+glaucomatous+neurodegeneration+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+protein+RBPMS+is+a+selective+marker+of+ganglion+cells+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).</li>
<li>Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+RS+%22Systematic+evaluation+of+the+mouse+eye+%3A+anatomy%2C+pathology%2C+and+biomethods%22">Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods</a>. , CRC Press. (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui dimostriamo una procedura semplice ma efficace per indurre l'elevazione prolungata di IOP nell'occhio del mouse mediante iniezione intracamerale di SO. Questa procedura può essere appresa rapidamente da chiunque abbia esperienza nella microdissezione al microscopio. Il rischio potenziale primario di fallimento è la perdita di SO dall'incisione corneale. Tuttavia, uno dei vantaggi dell'utilizzo di SO è che, poiché la goccia d'olio è visibile e misurabile, possiamo facilmente identificare i topi che hanno ricevuto gocc...

La progressiva perdita di cellule gangliari retiniche (RGC) e dei loro assoni è il segno distintivo del glaucoma, una malattia neurodegenerativa comune nella retina1. Colpisce più di 100 milioni di individui di età superiore ai 40-80 anni entro il 20402. L'IOP rimane l'unico fattore di rischio modificabile nello sviluppo e nella progressione del glaucoma. Per esplorare la patogenesi, la progressione e i potenziali trattamenti del glaucoma, è imperativo un modello sperimentale affidabile, riproducibile e inducibile di ipertensione/glaucoma sperimentale.
IOP dipende dall'afflusso di umorismo acquoso alla camera anteriore dal corpo ciliario nella camera posteriore e dal deflusso attraverso la mesh trabecolare (TM) all'angolo della camera anteriore. Al raggiungimento di uno stato stabile, IOP viene mantenuto. Quando il flusso in ingresso supera o è inferiore al deflusso, IOP aumenta o scende rispettivamente. Diminuendo il deflusso acquoso sia occludendo l'angolo della camera anteriore o danneggiando la TM, diversi modelli di glaucoma sono stati stabiliti3,4,5,6,7,8,9,10. Questi modelli sono normalmente associati a danni irreversibili ai tessuti oculari, e l'alto IOP nella camera anteriore causa anche complicazioni indesiderate come l'edema corneale e l'infiammazione intraoculare, che rendono difficile eseguire e interpretare l'imaging retinico e i saggi delle funzioni visive.
Per sviluppare un modello che superi queste carenze, ci siamo concentrati sul glaucoma secondario ben dichiarato causato dall'olio di silicone (SO) che si verifica come una complicanza postoperatoria della chirurgia vitreoretinica umana11,12. SO è usato come tamponadio in interventi chirurgici alla retina a causa della sua alta tensione superficiale. Tuttavia, SO può fisicamente occludere la pupilla perché è più leggera dei fluidi acquosi e vitrei, che impedisce il flusso acquoso nella camera anteriore. L'ostruzione causa l'elevazione di IOP nella camera posteriore a causa dell'accumulo di umorismo acquoso. Questo ci ha motivati a sviluppare e caratterizzare un nuovo modello di topo di ipertensione oculare basato su iniezione intracamerale SO e blocco pupillare13, con caratteristiche chiave del glaucoma secondario: blocco pupillare efficace, significativa elevazione IOP che può tornare alla normalità dopo la rimozione di SO, e neurodegenerazione glaucomatous.
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'ipertensione oculare indotta da SO nell'occhio del topo, tra cui l'iniezione e la rimozione di SO e la misurazione IOP.

<table><tbody><tr><td>0,5% proparacaina cloridrato</td><td>Akorn, Somerset</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10mL siinge</td><td>BD</td><td></td><td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>18G ago</td><td>BD</td><td></td><td>con smusso regolare, Lunghezza ago: 25,4 mm</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanolo (Avertin)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS# 75-80-9</td><td>50g</td></tr><tr><td>32G nano</td><td>BD</td><td>320122</td><td>BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm</td></tr><tr><td>Ago per ofalmologia 33G</td><td>TSK/ VWR</td><td>TSK3313/ 10147-200</td><td></td></tr><tr><td>Siinge da 5 ml</td><td>BD</td><td></td><td>Luer-Lok</td></tr><tr><td>Tip AnaSed Injection (xilazina)</td><td>Butler Schein</td><td></td><td>100 mg/ml, 50 ml</td></tr><tr><td>lacrime artificiali</td><td>Alcon Laboratories</td><td>300651431414</td><td>Systane Ultra Lubricant Eye Drops</td></tr><tr><td>BSS PLUS Soluzione irrigua</td><td>Alcon Laboratories</td><td></td><td></td>65080050</tr><tr><td>Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio</td><td>NARISHIGE</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>EZ-7000 Sistema classico</td><td>Sistema EZ Sistema</td><td></td><td></td>EZ</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VetOne</td><td>502017</td><td>isoflurano, USP, 250 ml/flacone</td></tr><tr><td>IV Set di somministrazione</td><td>EXELint / Fisher</td><td>29081</td><td></td></tr><tr><td>KETAMINA CLORIDRATO INIEZIONE</td><td>VEDCO</td><td>50989-996-06</td><td>KETAVED 100mg/ml * 10ml</td></tr><tr><td>macchina per smussatura a micromacinazione</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td></td></tr><tr><td>Tubo EVA in miniatura</td><td>McMaster-Carr</td><td>1883T4</td><td>0,05" ID, 0,09" OD, 10 piedi di lunghezza</td></tr><tr><td>olio siliconico (SILIKON)</td><td>Alcon Laboratories</td><td>8065601185</td><td>1.000 mPa.s</td></tr><tr><td>Capillari in vetro standard</td><td>WPI/ Fisher</td><td>1B150-4</td><td>4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm</td></tr><tr><td>Tonometro TonoLab</td><td>Colonial Medical Supply, Finlandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>unguento antibiotico veterinario</td><td>Dechra Veterinary</td><td>1223RX</td><td>BNP unguento oftalmico, Vetropolycin</td></tr></tbody></table>

un modello di ipertensione oculare indotta da olio di silicone reversibile nei topi

A Reversible Silicon Oil-Induced Ocular Hypertension Model in Mice

L'elevata pressione intraoculare (IOP) è un fattore di rischio ben documentato per il glaucoma. Qui descriviamo un nuovo metodo efficace per indurre costantemente l'elevazione stabile dell'IOP nei topi che imita la complicazione post-operatoria dell'uso dell'olio di silicone (SO) come agente tamponamento nella chirurgia vitreoretinica umana. In questo protocollo, SO viene iniettato nella camera anteriore dell'occhio del mouse per bloccare la pupilla e prevenire l'afflusso di umorismo acquoso. La camera posteriore accumula umorismo acquoso e questo a sua volta aumenta l'IOP del segmento posteriore. Una singola iniezione di SO produce un'altitudine IOP affidabile, sufficiente e stabile, che induce una significativa neurodegenerazione glaucomatosa. Questo modello è una vera replica del glaucoma secondario nella clinica oculistica. Per imitare ulteriormente l'ambiente clinico, SO può essere rimosso dalla camera anteriore per riaprire il percorso di drenaggio e consentire l'afflusso di umorismo acquoso, che viene drenato attraverso la rete trabecolare (TM) all'angolo della camera anteriore. Poiché IOP torna rapidamente alla normalità, il modello può essere utilizzato per testare l'effetto dell'abbassamento di IOP sulle cellule gangliari della retina glaucomatous. Questo metodo è semplice, non richiede attrezzature speciali o procedure di ripetizione, simula da vicino situazioni cliniche e può essere applicabile a diverse specie animali. Tuttavia, potrebbero essere necessarie modifiche minori.

Subito dopo l'iniezione possiamo facilmente identificare i topi che non producono ipertensione oculare stabile a causa delle goccioline SO troppo piccole (1,5 mm)13. Questi animali sono esclusi dai successivi esperimenti. Dopo le procedure di iniezione, più dell'80% dei topi so iniettati finisce con goccioline più grandi di 1,6 mm. Abbiamo misurato l'IOP di questi occhi del topo una volta alla settimana per 8 settimane dopo una singola iniezione SO. L'IOP dell'occhio che riceve SO è rimasto alto, ...

Qui, presentiamo un protocollo per indurre ipertensione oculare e neurodegenerazione glaucomatosa negli occhi del topo mediante iniezione intracamerale di olio di silicone e la procedura per la rimozione dell'olio di silicone dalla camera anteriore per restituire una pressione intraoculare elevata a Normale.

Un modello di ipertensione oculare indotta da olio di silicone reversibile nei topi

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing ...

Il glaucoma è la principale causa di cecità irreversibile, caratterizzata dalla morte delle cellule gangliari retiniche e dall'opto-neurodegenerazione. L'elevazione della pressione intraoculare, chiamata anche ipertensione oculare, è il fattore di rischio più riconosciuto per il glaucoma. Un modello di ipertensione oculare semplice ma efficace negli animali da esperimento come i topi è importante per indagare i glaucometri nella neurodegenerazione e testare il trattamento per la neuroprotezione.Pertanto, con i risultati, sviluppiamo un modello di ipertensione oculare del topo che imita da vicino il glaucoma secondario osservato nei pazienti umani. Questo modello replica fedelmente il glaucoma secondario causato dall'olio di silicone indotto per il blocco pupillare. La procedura è semplice l'elevazione IOP è stabile, e se la neurodegenerazione associata all'ipertensione oculare è grave negli occhi del topo, ancora più importante, l'ipertensione oculare è reversibile perché l'olio di silicone può essere facilmente rimosso dagli occhi del topo.A dimostrare la procedura sarà il dottor Fang Fang, un tizio post-operatorio del mio laboratorio. Per iniziare, fare una micropipetta di vetro per l'iniezione intracamerale di olio di silicone tirando un capillare di vetro con un estrattore di pipetta. Tagliare un'apertura sulla punta della micropipetta e affilare la punta utilizzando una smussatura a micro-smerigliatrice per realizzare una smussatura da 35 a 40 gradi.Lucidare i bordi della smussatura e lavarla con acqua per rimuovere tutti i detriti. Autoclavare la micropipetta prima dell'uso. Per preparare l'ago di paracentesi per l'ingresso corneale, attaccare un ago calibro 32 a una siringa da cinque millilitri su una serratura di esca e fissarlo ulteriormente con del nastro adesivo.Piegare la punta smussata dell'ago, a faccia in su, a 30 gradi. Per preparare l'iniettore di olio di silicone, attaccare e fissare un ago contundente calibro 18 su una siringa da 10 millilitri. Quindi attaccare un tubo di plastica con l'ago calibro 18 su un'estremità e riempire con olio di silicone se necessario attraverso l'altra estremità.Dopo aver anestetizzante un topo 6J nero C57 di nove-10 settimane, controlla la mancanza di risposta al dito del piedino con la mancanza di movimento dei baffi o della coda. Posizionare il mouse in posizione laterale su una piattaforma chirurgica. Applicare una goccia di cloridrato di proparacaina al 5% sulla cornea prima dell'iniezione per ridurne la sensibilità durante la procedura.Utilizzare l'ago di paracentesi calibro 32 per fare un'incisione di ingresso al quadrante super temporale a circa 5 millimetri dal limbo. Tunnel attraverso gli strati della cornea per circa 3 millimetri prima di penetrare nella camera anteriore, facendo attenzione a non toccare l'obiettivo o l'iride. Ritirare lentamente l'ago per rilasciare circa uno o due microlitri di umorismo acquoso dalla camera anteriore attraverso il tunnel e attendere circa otto minuti per ridurre ulteriormente la pressione intraoculare.Misurare l'occhio di controllo contralaterale per determinare la pressione. Inserire la micropipetta di vetro precaricata con olio di silicone attraverso il tunnel corneale nella camera anteriore con la smussatura rivolta verso il basso nella superficie del diaframma. Spingere lentamente lo stantuffo della siringa per iniettare olio di silicone nella camera anteriore fino a quando la goccia d'olio copre la maggior parte della superficie dell'iride, di circa 2,3-2,4 millimetri di diametro.Lasciare la micropipetta nella camera anteriore per altri 10 secondi prima di ritirarla lentamente. Spingere delicatamente la palpebra superiore per chiudere l'incisione della cornea per ridurre al minimo la perdita di olio di silicone. E poi applicare un unguento antibiotico sulla superficie oculare.Tenere il mouse sulla pastiglia di riscaldamento fino a quando non viene completamente recuperato dall'anestesia. Per rimuovere l'olio di silicone dalla camera anteriore, anestetizzare il mouse e quindi verificare la mancanza di risposta al dito del piedino per determinare la forza anestetica e la mancanza di movimento dei baffi o della coda. Posizionare il mouse su una piattaforma chirurgica e fissarlo in posizione laterale con nastro adesivo.Applicare una goccia di cloridrato di proparacaina al 5% sulla cornea per ridurne la sensibilità. Utilizzando l'ago di paracentesi prefatti calibro 32, fare due incisioni nel quadrante temporale della cornea tra le due e le cinque circa sul bordo della goccia di olio di silicone. Inserire un ago di irrigazione calibro 33 collegato a una soluzione irrigua attraverso un'incisione corneale alla massima velocità.Inserire un altro ago di drenaggio calibro 33 attaccato alla siringa senza pistone attraverso l'altra incisione corneale per consentire alla goccia di olio di silicone di uscire dalla camera anteriore mentre si irriga con soluzione irrigata. Ritirare l'ago di drenaggio quindi l'ago di irrigazione. Utilizzare una micropipetta di vetro collegata a una siringa Hamilton per iniettare una bolla d'aria nella camera anteriore per mantenere la sua profondità normale e premere per chiudere l'incisione corneale.Applicare unguento antibiotico su entrambi gli occhi e tenere il mouse sul tampone di recupero del riscaldamento fino a quando non è completamente recuperato dall'anestesia. Posizionare il mouse in una camera di induzione. Anestetizzarlo come descritto nel manoscritto e mantenere la sua cornea umida applicando lacrime artificiali durante tutta la procedura.Attendere circa 15 minuti per consentire all'alunno di dilatarsi completamente. Misurare l'IOP di entrambi gli occhi utilizzando un tonometro in base alle istruzioni del prodotto. Portare il tonometro vicino all'occhio del mouse, mantenendo la distanza dalla punta della sonda alla cornea del topo a circa tre o quattro millimetri.Premere il pulsante di misurazione sei volte per generare una lettura e ottenere tre letture generate dalla macchina da ogni occhio per acquisire l'IOP medio. Eseguire l'immunoistochimica delle cellule gangli retiniche retiniche a montaggio intero contando sezioni semisottili del nervo ottico e quantificando gli assoni sopravvissuti sugli animali sacrificati otto settimane dopo l'iniezione di olio di silicone. La pressione intraoculare degli occhi del topo con goccioline di olio di silicone superiori a 1,6 millimetri è stata misurata una volta alla settimana per otto settimane, dopo una singola iniezione di olio di silicone.La pressione dell'occhio che riceve l'olio è rimasta alta, per lo più il doppio della pressione dell'occhio di controllo conlaterale che indica un efficace blocco della pupilla. In un altro gruppo di topi, l'olio di silicone è stato lavato dalla camera anteriore due settimane dopo l'iniezione. Dopo aver aspettato una settimana per consentire alla cornea di riprendersi, la pressione intraoculare è tornata alla normalità, la stessa dell'occhio di controllo.Per determinare gli effetti dell'ipotensione oculare indotta dall'olio di silicone sulle cellule gangliari retiniche, i somi sopravvissuti nelle regioni periferiche dei supporti integrali retinali sono stati quantificati dalla colorazione RBPMS che mostra una drammatica morte cellulare ganglionare retinica dopo l'iniezione di olio di silicone. Gli assoni sopravvissuti nelle sezioni trasversali semisottile del nervo ottico sono stati quantificati dalla colorazione PBD otto settimane dopo l'iniezione. C'è stata una grande degenerazione dell'assone nell'ipertensione oculare indotta da olio di silicone.Gli animali possono essere coniati con SLOOCT per determinare il cambiamento nella retina. Anche la funzione visiva degli animali può essere saggiata dal modello ERG e OKR. Questo modello di ipertensione oculare faciliterà lo studio della neurodegenerazione glaucometri indotta da IOP.Può anche essere usato per testare preclinicamente terapie neuroprotettive promettenti.

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Il glaucoma è una delle principali cause di cecità nel mondo. Pressione intraoculare elevata è un importante fattore di rischio. Fotocoagulazione laser ipertensione oculare indotta è uno dei modelli animali ben stabilita. Questo video mostra come indurre ipertensione oculare fotocoagulazione con Argon laser nel ratto.

Laser-Induced cronica ipertensione oculare su Ratti modello SD

In questo video, un ratto anestetizzato viene sottoposto a una procedura oculare in cui le perle magnetiche vengono iniettate nella camera anteriore sotto un campo magnetico per bloccare l'angolo iridocorneale. Questo blocco ostruisce la rete trabecolare, impedendo il drenaggio dell'umore acqueo e portando ad un aumento della pressione intraoculare, danneggiando le cellule gangliari retiniche e il nervo ottico. Questo sviluppa una condizione simile al glaucoma.

Induzione sperimentale del glaucoma tramite ostruzione dell'angolo iridocorneale in un modello murino

Fonte: Lani-Louzada, R., et al., Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori. J. Vis. Exp. (2022)Questo video dimostra l'induzione e il monitoraggio di un'elevata pressione intraoculare (IOP) in un modello di ratto. Il processo prevede la cauterizzazione dei vasi sanguigni limbari, con conseguente occlusione dei vasi e IOP elevata. Il ratto viene quindi lasciato riprendersi e la IOP viene regolarmente monitorata sia...

 Induzione di un'elevata pressione intraoculare in un modello di ratto

Ipertensione oculare cronica è indotta mediante fotocoagulazione laser del trabecolato negli occhi del mouse. La pressione intraoculare (IOP) è elevato per diversi mesi dopo il trattamento laser. La diminuzione di acuità visiva e la sensibilità al contrasto di animali da esperimento sono monitorati utilizzando il test optomotor.

Un modello di topo indotta da laser di cronica ipertensione oculare per caratterizzare difetti visivi

Presentiamo un metodo per indurre un'elevata pressione intraoculare (IOP), iniettando microsfere magnetiche nell'occhio del ratto, per modellare il glaucoma. Ciò porta a forti aumenti di pressione e a un'estesa morte neuronale. Questo protocollo è facile da eseguire, non richiede iniezioni ripetute e produce aumenti IOP stabili e duraturi.

Experimental Glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche

Qui, presentiamo un protocollo per indurre ipertensione oculare nell'occhio murino che provoca la perdita di cellule gangliari retiniche come osservato nel glaucoma. microsfere magnetiche vengono iniettati nella camera anteriore e attratti l'angolo iridocorneale utilizzando un magnete per bloccare il deflusso dell'umore acqueo.

Un magnetica microperla occlusione modello per indurre ipertensione oculare-Dependent Glaucoma nei topi

Questo articolo descrive una procedura per l'induzione della retina danno da ischemia-riperfusione da elevata pressione intraoculare nei topi. Retina danno da ischemia-riperfusione da elevata pressione intraoculare serve per modellare patologie umane caratterizzate da ossigeno compromessa e consegna dei nutrienti nella retina, consentendo ai ricercatori di esaminare i potenziali meccanismi cellulari e trattamenti per le malattie umane dell'unità neurovascolare della retina.

Un modello murino di retina ischemia-riperfusione lesioni a causa di aumento della pressione intraoculare

Ipertensione oculare cronica è indotta applicando una sutura circumlimbal in ratti e topi, che conduce al deterioramento strutturale e funzionale delle cellule ganglionari retiniche coerente con il glaucoma.

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

Qui, descriviamo l'uso della tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare strutture retiniche e oculari in vivo in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.

Valutazioni strutturali in vivo della malattia oculare in modelli di roditori mediante tomografia a coerenza ottica

L'obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare un nuovo modello di neurodegenerazione glaucomatosa basato sulla cauterizzazione termica a 360° del plesso vascolare limbare, inducendo ipertensione oculare subacuta.

Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Qui, presentiamo un metodo per stabilire un modello murino di occhio secco con carenza acquosa asportando le ghiandole lacrimali extraorbitali e infraorbitali e valutare i cambiamenti nella superficie oculare nell'occhio secco con deficit acquoso.

Istituzione di un modello murino di carenza acquosa di occhio secco

Scopri un modello di ipertensione oculare reversibile nei topi mediante iniezione intracamerale di olio di silicone. Questo metodo permette di studiare la neurodegenerazione glaucomatosa e testare terapie neuroprotettive in vivo.

Un modello di ipertensione oculare indotta da olio di silicone reversibile nei topi

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