Name: Analisi del Gruppo IV Viral SSHHPS utilizzando i metodi In Vitro e In Silico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri l'analisi delle sequenze SSHHPS nei virus del gruppo IV utilizzando metodi in vitro e in silico. Questo protocollo identifica siti di scissione proteasica per studiare l'evasione delle risposte immunitarie.

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Questo lavoro è stato supportato dai numeri di progetto della Defense Threat Reduction Agency (DTRA) CB-SEED-SEED09-2-0061 e CBCall4-CBM-05-2-0019, e in parte dal programma di ricerca Intramurale/Extramural dei fondi di base NCATS, NIH (XH) e Naval Research Laboratory.

Le opinioni qui espresse sono quelle degli autori e non rappresentano quelle della U.S. Navy, Dell'Esercito degli Stati Uniti, del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti o del governo degli Stati Uniti.

La distruzione specifica della sequenza di una proteina o di un acido nucleico guidato da una sequenza estranea si vede solo in pochi casi in biologia. I meccanismi illustrati nella Figura 1 sono meccanismi difensivi che proteggono un host da un virus o un virus da un host.
Utilizzando metodi bioinformatici possiamo identificare gli obiettivi che vengono distrutti da questi sistemi. Nelle nostre analisi delle sequenze SSHHP, abbiamo scoperto che molte di esse potrebbero essere trovate nelle proteine necessarie per generare risposte immunitarie innate. Alcuni avevano ruoli ovvi come MAVS e TRIF (TIR-domain-che induce l'interferone-z), mentre altri erano legati all'immunità anche se meccanismi più complessi (ad esempio, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Le informazioni di destinazione memorizzate nella sequenza SSHHP hanno il potenziale per identificare le vie che hanno effetti antivirali contro questi virus. Le risposte antivirali in vivo sono spesso specifiche per i virus26,43. Ad esempio, sottoinsiemi di proteine TRIM hanno effetti antivirali su diversi virus43,44,45, alcuni sono fattori di restrizione virale (ad esempio, HIV e TRIM5). La specificità delle proteine TRIM (70 dollari sono stati identificati) è ancora in fase di esame44,45. Le informazioni all'interno di SSHHPS possono contribuire alla nostra comprensione di come questi virus eludano le risposte immunitarie innate. Altri modelli e correlazioni possono essere scoperti con l'esame di un maggior numero di SSHHPS.
Differenze specifiche per specie erano evidenti nelle nostre analisi (Figura 2, Figura 10). Questi virus sono noti per colpire alcune specie più di altri. Le informazioni sulla gamma host, la suscettibilità degli host e le difese dell'host possono essere presenti all'interno di SSHHPS. Per esempio, l'equina, la specie più suscettibile ai virus dell'encefalite equina, mancava della regione dell'TRIM14 umano che veniva tagliata transitoriamente dalla proteasi VEEV nsP2. Gli esseri umani raramente muoiono per infezioni da VEEV, ma possono essere infettati24. La proteina umana TRIM14 trasportava una sequenza di scissione della proteasi nsP26. La presenza del sito di scissione suggerisce che gli esseri umani hanno un meccanismo di difesa contro questi virus. Gli uccelli sono stati pensati per essere potenziali serbatoi di questi virus46. La corrispondente sequenza SSHHP nella proteina TRIM14 dei polli differiva dalle sequenze presenti negli esseri umani e in altre specie. Sottili differenze come queste possono rendere una proteina ospite bersaglio sciaforma o più facilmente sciolsa. Aguirre et al.16 ha mostrato che una proteina STRING mutata da zio-avabile ha indotto livelli superiori di IFN dopo l'infezione da virus Dengue e che i topi portano naturalmente una versione di STING che non viene tagliata dalla proteasi Dengue ns2B3. La proteina murine STING non è stata tagliata dalla proteasi47. Nella nostra analisi SSHHPS, abbiamo anche osservato differenze nelle sequenze del sito di scissione della proteasi di IKV quando abbiamo confrontato le proteine umane con quelle dei roditori6 (Figura 10D). La riproduzione delle scissioni proteolitiche specifiche delle proteine ospiti può essere importante nei modelli animali utilizzati per i virus del Gruppo IV. L'inibizione della scissione delle proteine ospiti ha anche implicazioni per quanto riguarda lo sviluppo di inibitori della proteasi di gruppo IV. Nella nostra pubblicazione precedente, abbiamo dimostrato che potevamo inibire la scissione TRIM14 con la proteasi VEEV nsP2 utilizzando CA074 ester dimetile 6. Questo risultato suggerisce che piccoli inibitori molecolari di queste proteasi possono essere in grado di modulare le risposte immunitarie innate che sono in grado di sopprimere l'infezione6,31.
La variazione genetica all'interno di una specie ha anche il potenziale per produrre differenze nella scissione proteolitica. Sottili differenze nell'uso del codone potrebbero influenzare la pausa ribosomiana48. Poiché alcune proteasi virali di Gruppo IV sono incorporate nella membrana ER, le differenze in queste pause potrebbero influenzare la scissione di un bersaglio se la scissione si verifica in modo co-traduzione. Alcuni dei siti di scissione che abbiamo identificato erano in sequenze di peptidi di segnale previste (ad esempio, SFRP1) mentre altri erano interni.
L'analisi SSHHPS può produrre informazioni che differiscono da altri metodi di analisi delle proteine ospiti. L'analisi SSHHPS è stata poco costosa e facile da impiegare. L'uso di un sistema di espressione batterica ha permesso di testare i segmenti corti (25 aminoacidi) delle sequenze di mammiferi senza l'uso della coltura cellulare dei mammiferi. Abbiamo scoperto che i substrati CFP-YFP erano in grado di tollerare tutte le sequenze proteiche umane testate; tuttavia, le rese variavano. In analisi simili, substrati contenenti sequenze proteiche umane fino a quando 63 aminoacidi sono stati espressi con successo, purificati e utilizzati per analisi cinetiche e screening degli inibitori49,50,51. Poiché solo piccole quantità di substrato sono necessarie per il saggio discontinuo, è possibile esplorare un gran numero di obiettivi. Un vantaggio del sistema è che i substrati CFP/YFP possono essere utilizzati per le analisi SDS-PAGE e per analisi cinetiche più elaborate (cioè IC50, Ki, Km, Vmax). Per la scoperta di farmaci, i composti inibitori possono produrre artefatti nei saggi fluorescenti. Così, il saggio discontinuo in combinazione con un saggio continuo permette di confermare la scissione o l'inibizione della scissione. I campioni per il saggio SDS-PAGE discontinuo possono essere prelevati direttamente dalle piastre da 96 pozze. I substrati CFP/YFP sono stati utilizzati per lo screening della libreria composta52. Tuttavia, sono necessarie ulteriori analisi per determinare se un substrato è adatto per lo screening ad alta produttività, come il calcolo di un fattore z53.
Una sfida nella progettazione di un substrato è identificare la regione intorno al legame di scissile che è legato e riconosciuto dalla proteasi. Negli esempi mostrati qui, abbiamo iniziato con 12 sequenze di residui che sono state centrate intorno al legame scissile. Dopo aver analizzato gli allineamenti di sequenza dei siti di scissione ai residui, è stato trovato Il terminale N del legame con la scientifica VEEV, mentre per l'omologia protease di .IKV a molti dei residui del terminale C è stato trovato. Un modello in silico del substrato ancorato può essere utilizzato per progettare esperimenti di mutagenesi diretti al sito che sondano i siti di legame del substrato. Poiché le sequenze di substrato ed enzima sono su plasmidi, sia può essere mutato per testare i modelli in silico o tolleranze subsite. Questo può essere vantaggioso se non è disponibile una struttura cristallina del substrato(s) rilegato.
L'analisi SSHHPS può anche fornire nuove informazioni sui meccanismi mediante i quali i fenotipi indotti da virus sono prodotti da enzimi virali. Uno degli obiettivi di , SFRP1, fa parte del percorso di segnalazione Wnt e ha ruoli nello sviluppo sia del cervello che dell'occhio e nelle risposte immunitarie36,37,54,55,56,57. Abbiamo scoperto che le altre sequenze proteiche che potrebbero essere tagliate dalla proteasi di n2B/ns3 erano anche in proteine coinvolte nello sviluppo di cervello e occhi; anomalie in entrambi sono stati osservati nella sindrome congenita di zika e si pensa che faccia parte del fenotipo indotto dal virus58.
La prevedibilità delle interazioni ospite-patogeno potrebbe essere sfruttata per una varietà di applicazioni: terapie virali oncolitiche specifiche del bersaglio; de-risking di vaccini contro il virus vivo; perfezionamento, previsione o selezione di modelli animali; previsione dell'intervallo o della suscettibilità dell'ospite; previsione di eventi zoonotici; e la previsione delle difese dell'ospite. Poiché i metodi descritti sono basati sulla sequenza, possono essere di valore da incorporare nel software in futuro.

Le prove di trasferimento genico orizzontale dal virus all'ospite, o host a virus, possono essere trovate in una varietà di genomi1,2,3,4. Esempi di endogenizzazione virale sono le sequenze distanziali CRISPR trovate nei genomi batterici ospiti4. Recentemente, abbiamo trovato prove di sequenze proteiche ospiti incorporate nelle poliproteine non strutturali dei virus del Gruppo IV di ssRNA. Queste sequenze all'interno delle regioni di codifica del genoma virale possono essere propagate generazionalmente. I brevi tratti di sequenze proteiche omologhe ospiti-patogeni (SSHHPS) si trovano nel virus e nell'host5,6. SSHHPS sono le sequenze di motivo sito di scissione conservate riconosciute dalle proteasi virali che hanno l'omologia di specifiche proteine ospiti. Queste sequenze dirigono la distruzione di specifiche proteine ospiti.
Nella nostra precedente pubblicazione6,abbiamo compilato un elenco di tutte le proteine ospiti che sono state prese di mira da proteasi virali e abbiamo scoperto che l'elenco degli obiettivi non era casuale (Tabella 1). Due tendenze erano evidenti. In primo luogo, la maggior parte delle proteasi virali che tagliavano le proteine ospiti apparteneva ai virus del Gruppo IV (24 dei 25 casi coinvolti proteasi virali di gruppo IV), e una proteasi apparteneva ai retrovirus del gruppo VI (HIV, virus dell'immunodeficienza umana)7. In secondo luogo, gli obiettivi proteici ospiti tagliati dalle proteasi virali sono stati generalmente coinvolti nella generazione di risposte immunitarie innate suggerendo che le scissioni erano destinate ad antagonizzare le risposte immunitarie dell'ospite. La metà delle proteine ospiti prese di mira dalle proteasi virali erano componenti noti di cascate di segnalazione che generano interferone (IFN) e citochine infiammatorie (Tabella 1). Altri sono stati coinvolti nella trascrizione delle cellule ospiti8,9,10 o traduzione11. È interessante notare che Shmakov et al.4 hanno dimostrato che molte sequenze di protostring rCRISP corrispondono ai geni coinvolti nella coniugazione o replicazione plasmida4.
Il Gruppo IV comprende, tra gli altri, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae e Togaviridae. Diversi patogeni nuovi ed emergenti appartengono al Gruppo IV, come il virus del virus zika , il Nilo occidentale (WNV), il Chikungunya (CHIKV), il virus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS) e il virus della sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS). Il genoma dello ssRNA è essenzialmente un pezzo di mRNA. Per produrre gli enzimi necessari per la replicazione del genoma, il genoma dello ssRNA deve prima essere tradotto. Negli alfavirus e in altri virus di Gruppo IV, gli enzimi necessari per la replicazione sono prodotti in un unico polibio (ad esempio, nsP1234 per VEEV). La poliproteina non strutturale (nsP) viene elaborata proteolicamente (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) dalla proteasi nsP2 per produrre enzimi attivi12 (Figura 1). La cleavage della poliproteina da parte della proteasi nsP2 è essenziale per la replicazione virale; questo è stato dimostrato dalla cancellazione e dalla mutagenesi diretta al sito del sito attivo cisteina della proteasi nsP213,14. In particolare, la traduzione delle proteine virali precede gli eventi di replicazione del genoma. Ad esempio, nsP4 contiene la polimerasi dell'RNA dipendente dall'RNA necessaria per replicare il genoma dello ssRNA. La replicazione del genoma può produrre intermedi dsRNA; questi intermedi possono innescare le risposte immunitarie innate dell'ospite. Così, questi virus possono fendere ospite proteine di risposta immunitaria innata precoce in infezione al fine di sopprimere i loro effetti15,16,17.
Il silenziamento può verificarsi a livello di DNA, RNA e proteine. Ciò che è comune a ciascuno dei meccanismi di silenziamento illustrati nella Figura 1 è che brevi sequenze di DNA, RNA o proteine estranee vengono utilizzate per guidare la distruzione di obiettivi specifici per antagonizzare la loro funzione. I meccanismi di silenziamento sono analoghi ai programmi di "ricerca ed eliminazione" scritti in tre lingue diverse. La sequenza del sito di scissione breve è analoga a una "parola chiave". Ogni programma ha un enzima che riconosce la corrispondenza tra la sequenza breve (la "parola chiave") e una parola nel "file" che deve essere eliminato. Una volta trovata una corrispondenza, l'enzima taglia ("elimina") la sequenza bersaglio più grande. I tre meccanismi illustrati nella Figura 1 vengono utilizzati per difendere l'ospite dai virus o per difendere un virus dal sistema immunitario di un ospite.
Le proteasi virali riconoscono brevi sequenze di motivi del sito di scissione tra gli amminoacidi da 2 a 11 dollari; nei nucleotidi, questo corrisponderebbe a 6-33 basi. Per fare un confronto, le sequenze distanziali CRISPR sono i nucleotidi da 26 a 72 dollari e gli RNAi sono due-22 nucleotidi18,19. Sebbene queste sequenze siano relativamente brevi, possono essere riconosciute in modo specifico. Data la maggiore diversità di aminoacidi, la probabilità di un evento di scissione casuale è relativamente bassa per una proteasi virale che riconosce sequenze proteiche di 6-8 aminoacidi o più a lungo. La previsione di SSHHPS nelle proteine ospiti dipenderà in gran parte dalla specificità della proteasi virale esaminata. Se la proteasi ha requisiti di specificità di sequenza rigorosi, la possibilità di trovare una sequenza di sito di scissione è 1/206 - 1 in 64 milioni o 1/208 - 1 in 25,6 miliardi; tuttavia, la maggior parte delle proteasi hanno tolleranze di siti secondari variabili (ad esempio, R o K possono essere tollerate sul sito S1). Di conseguenza, non vi è alcun requisito per l'identità della sequenza tra le sequenze trovate nell'host rispetto al virus. Per le proteasi virali che hanno requisiti di sequenza più sciolti (come quelli appartenenti a Picornaviridae) la probabilità di trovare un sito di scissione in una proteina ospite può essere maggiore. Molte delle voci della Tabella 1 provengono dalla famiglia Picornaviridae.
La notazione Schechter & Berger20 è comunemente usata per descrivere i residui in un substrato proteasi e i siti secondari a cui si legano, utilizziamo questa notazione in tutto. I residui nel substrato che sono N-terminale del legame di scissile sono indicati come P3-P2-P1, mentre quelli che sono C-terminalsono sono indicati come P1'-P2'-P3'. I corrispondenti sottositi della proteasi che legano questi residui di amminoacidi sono rispettivamente S3-S2-S1 e S1'-S2'-S3'.
Per determinare quali proteine ospiti sono presi di mira, possiamo identificare SSHHPS nei siti di scissione della poliproteina virale e cercare le proteine ospiti che le contengono. Qui, illustreremo le procedure per identificare SSHHPS utilizzando sequenze note di scissione proteasi virale. I metodi bioinformatici, i saggi proteasi e nei metodi in silico descritti sono destinati ad essere utilizzati in combinazione con saggi basati sulle cellule.
Gli allineamenti delle sequenze delle proteine ospiti bersaglio delle proteasi virali hanno rivelato differenze specifiche delle specie all'interno di queste brevi sequenze di scissione. Ad esempio, la proteasi del virus dell'encefalite equina venezuelana (VEEV) nsP2 è stata trovata per tagliare l'TRIM14 umano, una proteina tripartita (TRIM)6. Alcune proteine TRIM sono fattori di restrizione virale (ad esempio, TRIM5- 21), la maggior parte sono pensati per essere ligas ubiquitina E3. TRIM14 manca di un dominio RING (davvero interessante nuovo gene) e non è pensato per essere un E3 ligase22. TRIM14 è stato proposto come un adattatore nel signaloso antivirale mitocondriale (MAVS)22, ma può avere altre funzioni antivirali23. L'allineamento delle sequenze di TRIM14 da varie specie mostra che gli equini non hanno il sito di scissione e ospitano una versione troncata di TRIM14 che manca del dominio PRY/SPRY del terminale C. Questo dominio contiene un sito di poliubiquitination (Figura 2). Nell'equino, questi virus sono altamente letali (mortalità del 20-80%), mentre nell'uomo umano solo l'1% muore a seguito di infezioni da VEEV24. La cleavage del dominio PRY/SPRY può cortocircuito transitoriamente cortocircuito della cascata di segnalazione MAVS. Questa cascata può essere innescata da dsRNA e porta alla produzione di interferone e citochine pro-infiammatorie. Pertanto, la presenza del SSHHPS può essere utile per prevedere quali specie hanno sistemi di difesa contro specifici virus di Gruppo IV.
Nei virus di Gruppo IV, i meccanismi di antagonismo IFN sono ritenuti moltiplicare ridondanti25. La scissione delle proteine ospiti può essere transitoria durante l'infezione e le concentrazioni possono recuperare nel tempo. Abbiamo scoperto nelle cellule che i prodotti di scissione TRIM14 potrebbero essere rilevati molto presto dopo la trasfezione (6 h) con un plasmide che codifica la proteasi (promotore di citomegalovirus). Tuttavia, a periodi più lunghi, i prodotti di scissione non sono stati rilevati. Nelle cellule infettate da virus, la cinetica era diversa e i prodotti di scissione potevano essere rilevati tra 6-48 h6. Altri hanno segnalato la comparsa di prodotti di scissione proteica ospite già 3-6 h dopo l'infezione9,11.
L'attività proteolitica nelle cellule è spesso difficile da catturare; i prodotti di scissione possono variare nella loro solubilità, concentrazione, stabilità e durata. Nei saggi basati sulle cellule, non si può presumere che i prodotti di scissione si accumulino in una cellula o che le intensità della banda delle proteine tagliate e non tagliate mostrino aumenti e diminuzioni compensative in quanto la proteina tagliata può essere degradata molto rapidamente e potrebbe non essere rilevabile in una macchia occidentale a un peso molecolare previsto (MW) (ad esempio, la regione contenente l'epipopo potrebbe essere screpolata da altri protiasi ospiti o potrebbe essere ubichezzata). Se il substrato della proteasi virale è una proteina di risposta immunitaria innata, la sua concentrazione può variare durante l'infezione. Ad esempio, alcune proteine di risposta immunitaria innata sono presenti prima dell'infezione virale e sono indotte ulteriormente dall'interferone26. La concentrazione della proteina bersaglio può quindi variare durante l'infezione e il confronto tra listi cellulari non infetti e listi cellulari infetti può essere difficile da interpretare. Inoltre, tutte le cellule potrebbero non essere trascate o infettate in modo uniforme. I saggi proteasi in vitro che utilizzano proteine purificate di E. coli, d'altra parte, hanno meno variabili per cui controllare e tali saggi possono essere fatti utilizzando SDS-PAGE piuttosto che immunoblot. Le proteasi contaminanti possono essere inibite nei primi passaggi della purificazione delle proteine del substrato CFP/YFP e le proteasi virali mutate possono essere purificate e testate come controlli per determinare se la scissione è dovuta alla proteasi virale o a una proteasi batterica contaminante.
Una limitazione dei saggi proteasi in vitro è che mancano della complessità di una cellula dei mammiferi. Affinché un enzima tagli il suo substrato, i due devono essere co-localizzati. Le proteasi virali del Gruppo IV differiscono nella struttura e nella localizzazione. Ad esempio, la proteasi di Simlasmi è incorporata nella membrana del reticolo endoplasmico (ER) e si affaccia sul citosol, mentre la proteasi VEEV nsP2 è una proteina solubile nel citoplasma e nel nucleo27. Alcune delle sequenze del sito di scissione trovate nell'analisi SSHHPS di IKV erano in peptidi di segnalazione suggerendo che la scissione potrebbe avvenire co-traduzione per alcuni obiettivi. Pertanto, anche la posizione della proteasi e del substrato nella cellula deve essere considerata in queste analisi.
I saggi basati sulle cellule possono essere utili per stabilire un ruolo per le proteine ospiti identificate nell'infezione. I metodi che mirano a fermare la scissione proteasi virale delle proteine ospiti come l'aggiunta di un inibitore della proteasi6 o una mutazione nel bersaglio ospite16 possono essere utilizzati per esaminarne gli effetti sulla replicazione virale. La sovraespressione della proteina mirata può anche influenzare la replicazione virale28. I saggi di placca o altri metodi possono essere utilizzati per quantificare la replicazione virale.

<table><tbody><tr><td>250 mL Erlenmeyer Pallone</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Acros Organics (Fisher)</td><td>125472500</td><td>Pericolo: Acutamente tossico. Aprire il flacone nel cofano per evitare di inalare i fumi.</td></tr><tr><td>Pallone graduato Erlenmeyer a bocca larga in Pyrex da 4 L con tappo a vite</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS49954L-1EA</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Prime Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0729-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTA XK 16/20 Colonna</td><td>GE Healthcare</td><td>28988937</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-0.5 Unità filtrante</td> centrifuga <td></td><td></td> Millipore Sigma UFC501096 <td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Unità di filtro centrifugo</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Pericolo: Reazioni allergiche (cutanee o respiratorie).</td></tr><tr><td>Sefarosio chelante a flusso rapido</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0575-02</td><td>Una volta che la resina è stata bilanciata con solfato di nichel 0,2 M, nel testo si fa riferimento a una colonna di nichel. La colonna avrà un colore verde dopo il lavaggio con acqua. La colonna avrà un colore blu dopo l'equilibratura con il buffer.</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>RPI</td><td>C61000</td><td>Pericolo: Può causare il cancro.</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga Corning da 50 mL Suggerimento</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>: le provette in polipropilene hanno meno probabilità di rompersi durante la sonicazione rispetto alle provette in polietilene</td></tr><tr><td>Corning 96 Well-Well Half-Area Microplate , superficie non vincolante</td><td>Corning</td><td>3993</td><td></td></tr><tr><td>Clip per tubi per dialisi</td> Fisher <td>Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>colonna di desalinizzazione monouso PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Ditiotreitolo)</td><td>RPI</td><td>D11000-50.0</td><td>Avvertenza: tossicità orale acuta; irritazione della pelle e degli occhi</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Piastre di Petri con coperchio trasparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics (Fisher)</td><td>15892-0010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4034-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Acros Organics</td><td></td><td>301870010 Pericolo: Tossico, irritante</td></tr><tr><td>IPTG (isopropil &beta;-D-tiogalattopiranoside)</td><td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td><td>420291</td><td>Non respirare la polvere. Evitare il contatto con gli occhi e la pelle.</td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>BIO-RAD</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Agar</td><td>Fluka (Millipore Sigma)</td><td>L3027-1KG</td><td>Suggerimento: Autoclave con agitatore magnetico nel liquido e agitare durante il raffreddamento. Attendi di aggiungere l'antibiotico fino a quando non riesci a tenere le mani sulla bottiglia senza dolore per 30 secondi.</td></tr><tr><td>Luria Bertani Media</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L4919-5g</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td><td>Nalgene (Thermo Scientific)</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore shaker New Brunswick Innova 42R</td><td>Eppendorf</td><td>M1335</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di nichel esaidrato (cristallino/certificato ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>N73-500</td><td>Pericolo: Nocivo se ingerito o inalato, irritazione della pelle e degli occhi</td></tr> One <tr><td>Shot BL21(DE3) Chimicamente competente E. coli</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C600003</td><td>Può essere dannoso se inalato o ingerito. Può causare irritazione della pelle e degli occhi in presenza di persone sensibili.</td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chimicamente competente E. coli</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C606003</td><td>Può essere dannoso se inalato o ingerito. Può causare irritazione della pelle e degli occhi in presenza di persone sensibili.</td></tr><tr><td>pet15b plasmide DNA</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69661</td><td>GenScript Inc. è stato utilizzato per la sintesi commerciale del DNA. Il plasmide pet15b è stato utilizzato per i substrati CFP/YFP.</td></tr><tr><td>pet32b</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69016-3</td><td>Il plasmide pet32b è stato utilizzato per il costrutto della proteasi della cisteina.</td></tr><tr><td>Mini compresse di inibitore della proteasi Pierce, senza EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32955</td><td>Avvertenza: corrosione/irriazione della pelle; danni agli occhi</td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Modello M5</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per l'estrazione delle proteine</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>70584-4</td><td>BugBuster o Bper (Catalogo # 78248, ThermoFisher)</td></tr><tr><td>Q-Sepharose Fast Flow</td><td>G.E. Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>Resina a scambio anionico</td></tr><tr><td>RunBlue (12%) Gel PAGE a 17 pozzetti</td><td>Expedeon</td><td>BCG01227</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi gel di poliacrilammide prefuso al 12%</td></tr><tr><td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td><td>Expedeon</td><td>NXB50500</td><td>Diluire 50 mL con 950 mL di acqua deionizzata per ottenere 1x</td></tr><tr><td>RunBlue Instant Blue Gel Macchia</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Non diluire, utilizzare come indicato</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td><td>Branson Ultrasonics (VWR)</td><td>Modello n. 101-063-346R</td><td>Il sonicatore è stato utilizzato sul livello 5</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td><td>Spectrum Labs</td><td>132645T</td><td>Tubo per dialisi</td></tr><tr><td>SP-Sepharose Fast Flow</td><td>G.E. Sanità</td><td>17-0729-01</td><td>Resina a scambio cationico</td></tr><tr><td>Trombina da plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>T6634-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Attenzione: irritante per occhi/pelle</td></tr></tbody></table>

analisi del gruppo iv viral sshhps utilizzando i metodi in vitro e in silico

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Gli enzimi alfavirali sono sintetizzati in un singolo polipeptide. La poliproteina non strutturale (NSP) viene elaborata con la proteasi cisteina di nsP2 per produrre enzimi attivi essenziali per la replicazione virale. Le proteasi virali sono molto specifiche e riconoscono le sequenze di motivi di scissione conservate (6-8 aminoacidi). In diversi virus di Gruppo IV, le sequenze di motivi di scissione della proteasi nsP possono essere trovate in specifiche proteine ospiti coinvolte nella generazione delle risposte immunitarie innate e, in alcuni casi, le proteine mirate sembrano essere collegate al fenotipo indotto dal virus. Questi virus utilizzano brevi distese di sequenze omologhe di proteine omologhe ospiti-patogeni (SSHHPS) per la distruzione mirata delle proteine ospiti. Per identificare Gli SSHHPS, le sequenze di motivi del sito della proteasi virale possono essere inserite in BLAST e i genomi ospiti possono essere cercati. Cleavage inizialmente può essere testato utilizzando la proteasi virale nsP purificata e il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) substrati realizzati in E. coli. I substrati FRET contengono proteine fluorescenti ciano e gialle e la sequenza del sito di scissione (CFP-sequence-YFP). Questo saggio proteasi può essere utilizzato continuamente in un lettore di lastre o discontinuo in gel SDS-PAGE. I modelli dei substrati peptidi legati possono essere generati in silico per guidare la selezione del substrato e gli studi di mutagenesi. Anche i substrati CFP/YFP sono stati utilizzati per identificare gli inibitori della proteasi. Questi metodi in vitro e in silico possono essere utilizzati in combinazione con saggi basati sulle cellule per determinare se la proteina ospite mirata influisce sulla replicazione virale.

L'analisi SSHHPS della proteasi di iKV ns2B/3 ha identificato 4 bersagli proteici ospiti: FOXG1, SFRP1, una sottounità alfa Gda una libreria cDNA retinica e il mitocondriale NT5M 5',3'nucleotidase (Figura 10)6. In particolare, nessun altro metodo ha previsto queste proteine come potenziali bersagli della proteasi di IKV. Le mutazioni nel gene FOXG1 sono state collegate a una sindrome congenita caratterizzata da uno sviluppo alterato e da anomalie strutturali del cervello come la microcefalia. SFRP1 è una proteina brizzolata secreta (SFRP); questi recettori solubili possono legare in modo competitivo i ligandi Wnt per antagonizzare e inibire la segnalazione Wnt. Il percorso di segnalazione Wnt è coinvolto nella regolazione della risposta IFN durante l'infezione Flavivirus36. La scissione di SFRP1 dovrebbe migliorare la replicazione del flavivirus. SFRP1 è anche coinvolto nella differenziazione delle cellule Th1737. I allineamenti delle sequenze della SSHHPS hanno mostrato differenze specifiche delle specie nelle sequenze del sito di scissione (Figura 10D). La sequenza del sito di scissione in SFRP1 era identica negli esseri umani e nei polli; La IKV può indurre la mortalità e la microcefalia negli embrioni di pollo38 . Nei roditori, il residuo di P1 altamente conservato (K/R)R-G viene sostituito da una glicina (RGG). I ceppi immunocompetenti di topi sono generalmente resistenti alle infezioni e alla malattia diIKV 39.
I parametri nettici di stato stabile e le costanti di inibizione possono essere misurati per le sequenze di poliproteine virali e per le sequenze proteiche ospiti utilizzando l'analisi continua in un lettore di lamiere31,40,41 ( Figura11A). Per informazioni qualitative sulla scissione, come la scissione di una particolare sequenza o l'inibizione della proteasi da parte di vari composti, è possibile utilizzare il saggio discontinuo (Figura 11B).
Potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione del numero di residui tra CFP e YFP. Un modello associato a substrato può essere realizzato utilizzando i metodi in silico. Un modello agganciato rappresentativo del nodo nsP1/nsP2 è illustrato nella figura 9. Per la proteasi VEEV nsP2, era stata segnalata una sequenza di 12 amminoacidi Semliki Forest Virus (SFV) (Km - 0,58 mM). L'allungamento della sequenza di substrati a 19, 22 e 25 residui e la riduzione della forza ionica del buffer ha portato a una significativa riduzione in Km. L'esame della struttura cristallina VEEV nsP2 e dell'imballaggio dei cristalli ha anche mostrato che una parte di una delle giunzioni era imballata contro il dominio della proteasi ed era elicoidale. Pertanto, i substrati VEEV più lunghi possono legarsi meglio a causa del riconoscimento di un motivo strutturale secondario.
Per TRIM14, abbiamo ottenuto un Km - 21 , M6,33. Il Km per il substrato che trasporta la sequenza proteica ospite era paragonabile ai valori Km dei substrati contenenti le sequenze del sito di clevaggio poliproteico virale (Km(V12) - 12 M e Km(V34) - 21 M). Le sequenze del sito di scissione nelle giunzioni nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 e nsP3/nsP4 sono state tagliate con diverse efficienze. Nella cellula, questo è pensato per consentire la scissione sequenziale della poliproteina42.
Prestare attenzione nell'interpretare i risultati negativi. Se non si verifica alcuna scissione, il sito di scissione può essere troppo breve o la proteasi purificata può essere inattiva. Per i substrati tagliati, sono necessari ulteriori esperimenti per confermare la scissione della proteina o della scissione a tutta lunghezza nelle cellule infettate da virus. Dovrebbero essere scelti adeguati esperimenti successivi. Gli effetti della sovraespressione o del silenziamento della proteina bersaglio sulla replicazione virale possono anche essere testati.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Figura 1: Tre meccanismi di silenziamento. Il silenziamento può verificarsi a livello di DNA, RNA o proteina. Questi algoritmi di "ricerca ed eliminazione" utilizzano ciascuno una "parola chiave" per indirizzare la scissione di un file contenente la parola. Questa cifra è stata modificata da Morazzani et al.32 e i riferimenti in quella volta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Figura 2: Differenze specifiche delle specie nelle sequenze del sito di scissione. I domini PRY/SPRY del terminalE C degli omologhi TRIM14 sono mostrati nell'allineamento. Il dominio PRY/SPRY può essere identificato dai motivi conservati evidenziati in grigio. L'uomo TRIM14 viene tagliato a QEAGA-G dalla proteasi cisteina di VEEV nsP2. La sequenza SSHHP viene visualizzata a colori. Il residuo in verde è il residuo P1'; in blu è il residuo P4, e in rosso sono altri residui conservati all'interno della sequenza di motivo sito scissione. Equine porto una versione troncata di TRIM14 privo del dominio PRY/SPRY. La lisina evidenziata nel ciano è poli-ubiquitinated ed è importante per l'assemblaggio del signaloso MAVS. Il dominio PRY/SPRY del terminale C può essere tagliato transitoriamente dalla proteasi nsP2 per compromettere la risposta antivirale dell'ospite intracellulare durante un'infezione virale acuta. In equino, questo dominio è sempre assente. Ciò suggerisce che il dominio PRY/SPRY di TRIM14 può avere una funzione protettiva contro le infezioni da VEEV. Questa figura è stata riprodotta da Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Figura 3: identificazione SSHHPS tramite BLAST. La sequenza di motivo sito di scissione nella giunzione VEEV nsP1/nsP2 è allineata con la sequenza SSHHP nella proteina ospite TRIM14. Il residuo colorato in verde è il residuo P1'; in blu è il residuo P4 e in rosso sono altri residui conservati della sequenza di motivi sito scissione. La maggior parte degli allineamenti conteneva omologia a regioni al di fuori del motivo del sito di scissione conservato o non includeva i residui di legame scissile P1/P1'. TRIM14 ha mostrato una corrispondenza a 6 residui in ordine sequenziale che includeva P1 e P1'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Figura 4: Sequenze proteiche e di DNA del substrato CFP-V12-YFP per la proteasi cisteina VEEV nsP2. I siti di restrizione NdeI (CATATG) e XhoI (CTCGAG) sono visualizzati in lettere maiuscole. In rosso è la sequenza del sito di scissione dalla poliproteina virale che si trova tra nsP1 e nsP2. Il residuo in verde è il residuo P1' e in blu è il residuo P4 del sito di scissione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Figura 5: Sequenza proteica del costrutto della proteasi di cisteina Trx-VEEV-nsP2. Thioredoxin (Trx) è mostrato in giallo. Il sito di scissione della trombina e His-tag sono mostrati in ciano. I Cys-His dyad sono etichettati in rosso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Figura 6: Strutture di peptide in MOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Figura 7: aggancio del peptide del substrato utilizzando PyRx/AutoDock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Figura 8: Lavori in esecuzione sul cluster Biowulf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Figura 9: Modello del substrato VEEV P12 contenente la sequenza del sito di scissione nella giunzione nsP1/nsP2. Il diala catalitico Cys-477/His-546 è mostrato in blu. La figura è stata effettuata utilizzando Pymol (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Figura 10: Analisi SSHHPS della proteasi del virus ns2B/ns3. (A) Previsti bersagli proteici ospiti della proteasi di n2B/ns3. I residui in rosso corrispondono a una singola sequenza di siti di scissione. I residui in verde sono tollerati nel sito secondario e corrispondono ai residui in altri siti di scissione. SFRP1 aveva il maggior numero di residui identici in ordine consecutivo. (B) le proteine CFP-substrato-YFP (50-60 kDa) sono state espresse e purificate contenente la sequenza SSHHP prevista da ogni proteina ospite (umana). La proteasi di SimLaKV ha tagliato foxG1, SFRP1, NT5M e una sottounità alfa Gsisolata da una libreria cDNA retinica. I prodotti di scissione sono circa 28-30 kDa. Le sequenze di substrato sono disponibili in Morazzani et al.6 (C) Mentre la proteasi ns2B/ns3 taglia SFRP1, non ha tagliato i suoi omologhi (SFRP2 e SFRP4). (D) L'allineamento dei siti di scissione di diverse specie animali può essere utile per selezionare un modello animale per un virus di gruppo IV. Si noti che la sequenza di r-G conservata differisce tra gli esseri umani e i roditori in SFRP1. Figura riprodotta da Morazzani et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Figura 11: Analisi cinetica di stato costante utilizzando i saggi continui e discontinui. (A) I dati cinetici mostrati nella tabella 5 sono stati tracciati in GraFit. L'insetto mostra il grafico Lineweaver-Burk. (B) Gel SDS-PAGE che mostra i prodotti di scissione del substrato CFP-V12-YFP. Nella corsia 1 è il substrato "UNCUT" (48 kDa). Nella corsia 2 è il substrato "CUT" (31 kDa e 27 kDa). Nelle corsie 3-9 diversi composti sono stati inclusi per testare la loro attività inibitoria. La corsia 4 contiene l'inibitore covalente E64d. Queste reazioni sono state eseguite durante la notte per 17 h a temperatura ambiente. L'ebollizione dei campioni è stata necessaria per ottenere il modello di fasciatura affilata. La proteasi nsP2 è visibile (56 kDa) nelle reazioni contenenti enzima, ma non nella corsia 1. La corsia 1 è il controllo "nessun enzima". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Vi presentiamo un protocollo generale per l'identificazione di brevi distese di sequenze proteiche omologhe ospiti-patogenenze (SSHHPS) incorporate nella poliproteina virale. Gli SSHHPS sono riconosciuti dalle proteasi virali e dirigono la distruzione mirata di specifiche proteine ospiti da parte di diversi virus del Gruppo IV.

Analisi del Gruppo IV Viral SSHHPS utilizzando i metodi In Vitro e In Silico

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Abbiamo dimostrato che i genomi virali del gruppo IV codificano brevi tratti di sequenze proteiche ospiti. Queste sequenze possono essere trovate all'interno dei siti di scissione proteasi virale. Vengono utilizzati per la distruzione mirata delle proteine ospiti, tipicamente proteine coinvolte nella generazione delle risposte immunitarie.Un grande vantaggio dell'uso di saggi proteasi è che rimuove la complessità di una cellula e mostra se una proteasi virale può o meno scindere una particolare sequenza. Così, quando abbiamo analizzato le sequenze di Zika SSHHPS, abbiamo scoperto che la proteasi poteva tagliare sequenze di proteine coinvolte nella generazione di risposte immunitarie e che alcune di queste proteine avevano anche ruoli nello sviluppo cerebrale e oculare. Quando si esegue questa tecnica per la prima volta, si dovrebbe ricordare che se la scissione non viene osservata, che può essere dovuta a una varietà di fattori come l'attività della proteasi.A dimostrare la procedura sarà Jaimee Compton, un tecnico del mio laboratorio. Inizia aprendo Protein BLAST e metti i 20 amminoacidi che circondano il legame scissile e la poliproteina virale e seleziona sequenze proteiche non ridondanti, quindi digita il genoma ospite da cercare. Se necessario, selezionate PHI-BLAST e digitate una sequenza di serie in cui le parentesi quadre indicano che entrambi gli amminoacidi all'interno delle staffe possono essere nella posizione sostitutiva, quindi premere BLAST.Ordine di classificazione dei colpi BLAST in base al numero di residui consecutivi identici o tollerati che corrispondono a una sequenza di sito di scissione. Dall'elenco, selezionare le proteine contenenti sei o più residui identici o simili per l'analisi nei saggi di proteasi. Costruisci un plasmide che codifica per la proteina fluorescente ciano, fino a 25 aminoacidi della sequenza di scissione e la proteina fluorescente gialla.Successivamente, preparare i substrati CFP e YFP inoculando quattro matracci da quattro litri con 25 millilitri di una coltura notturna. Agitare le colture a 37 gradi Celsius e monitorare la crescita ogni ora mediante spettroscopia UV-Vis a 600 nanometri. Quando i batteri raggiungono un'assorbanza di circa uno, indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,5 millilitri di un IPTG molare a ciascun pallone, quindi abbassare la temperatura dell'incubatore di scuotimento a 17 gradi Celsius e consentire all'espressione di continuare durante la notte per 17-20 ore.Il giorno successivo, pellet i batteri per centrifugazione a 7000 volte g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere e scartare il supporto liquido, quindi conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius o procedere con la lisi cellulare. Per lenire le cellule, preparare 100 millilitri di tampone di lysis secondo le indicazioni manoscritte, rimescolare il pellet nel tampone e trasferire da 25 a 25 millilitri della sospensione a tubi conici monouso da 50 millilitri.Posizionare i tubi in un becher di plastica con acqua ghiacciata, quindi inserire la punta del sonicatore nel tubo in modo che la punta sia a circa un centimetro dal fondo del tubo e sonicare il lisato da 10 a 20 volte fino a quando non diventa fluido e liqueficato. Dopo la sonicazione, trasferire il lysate in tubi di centrifuga ad alta velocità e centrifugarlo a 20, 500 x g per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire il supernatante in una bottiglia pulita e scartare il pellet.Caricare il lisato sulla colonna di nichel, quindi lavare la colonna con due volumi di colonna di tampone A seguiti da cinque volumi di colonna del 20% tampone B.L'assorbanza a 280 nanometri aumenterà durante il lavaggio poiché i contaminanti eluiranno dalla colonna. Continuare il lavaggio fino a quando A280 non torna ai valori di base. Quindi elutare la proteina con due o tre volumi di colonna del 100% tampone B e raccogliere 10 frazioni di millilitro, assicurandosi di misurare l'A280 di ogni frazione.Preparare otto miscele di reazioni in base alle direzioni del manoscritto e pipetta 45 microlitri di ogni miscela nei primi tre pozzi di ogni fila di una piastra nera a mezza area da 96 pozzetti. Impostare il lettore di lastre per il rilevamento simultaneo della florescence a due lunghezze d'onda con un'impostazione fissa del tubo fotomoltiplicatore. Programma il tempo di lettura a 20-30 minuti con una lettura al minuto e seleziona i pozzi da leggere.Inserire la piastra nella macchina e avviare la lettura, monitorando i rapporti di emissione nel tempo. Eseguire una lettura endpoint della piastra contenente il substrato non tagliato. Rimuovere la piastra e pipettare cinque microlitri di enzima in ogni pozzo.È possibile salvare la prima colonna come controllo non tagliato. Quindi leggere di nuovo la piastra per 20-30 minuti, assicurandosi di impostare il lettore di piastre sui valori assoluti di uscita. Una volta completata la lettura, sigillare la piastra con pellicola per evitare l'evaporazione e lasciarla durante la notte a temperatura ambiente per consentire all'enzima di tagliare completamente il substrato.Dopo 24 ore, rimuovere il film ed eseguire una lettura finale della piastra. Mediare i rapporti di emissione e registrarli come tagliati. Confermare la scollatura del substrato utilizzando SDS-PAGE.Caricare un marcatore di peso molecolare nella prima o nell'ultima corsia e caricare cinque microlitri di ogni miscela di reazione in una corsia del gel, a partire dalla reazione non tagliata. Collegare gli elettrodi del serbatoio del gel all'alimentatore ed eseguire i prodotti a 110 volt per 60 minuti. Rimuovere il gel dalla cassetta utilizzando uno strumento di cracking e immergerlo in cinque-10 millilitri di soluzione di colorazione.Dopo una o 24 ore, rimuovere la macchia in eccesso e immergere il gel in acqua. Quindi scatta una foto del gel usando un gel imager. Per preparare la struttura proteica, caricare il file PDB proteico in MOE.Fare clic su Seleziona e solvente, quindi eliminare il solvente. Aprite il pannello Struttura pPreparazione (Structure pPreparation) dalla barra dei menu Superiore calcolo (Compute top menu bar) e correggete automaticamente tutte le voci strutturali facendo clic su Correggi (Correct). Protonare la struttura facendo clic su Protonate 3D.Aggiungere cariche parziali alla proteina aprendo il pannello Cariche parziali e selezionando AMBER 99 e Regola idrogeno e coppie solitarie come richiesto. Quindi salvare il file di struttura. Per costruire la struttura per i peptidi del substrato e TRIM14, aprite il pannello Generatore proteine, immettete la sequenza del substrato e selezionate Riconfeziona automaticamente.Quindi, impostate Geometria come estesa (Geometry as Extended) e fate clic su Genera (Build). Infine ridurre a icona la struttura e salvarla come file PDB. Agganciare i peptidi del substrato a VEEV-nsP2 utilizzando il software PyRx AudoDock 4.2.Caricare la proteina, fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome e scegliere Crea macromolecola per preparare il file di ancoraggio PDBQT. Quindi caricare la molecola del substrato e selezionare Crea Ligando per preparare il file di aggancio del ligando. Avviare la procedura guidata AutoDock sul pannello ancoraggio nella parte inferiore e selezionare i file di ligando e proteine preparati.Definire la tasca di legame proteico regolando manualmente la dimensione della griglia, quindi eseguire AuotGrid. Eseguire quindi AutoDock e selezionare il metodo dell'algoritmo genetico Lamarckian. Fare clic su Parametri ancoraggio e impostare il numero di esecuzioni GA su 50, quindi fare clic su Avanti per avviare l'ancoraggio.Al termine dell'autodock, aprite il pannello Analizza risultati e ispezionate tutte le pose di associazione previste. Selezionare il modello migliore con la più bassa energia di legame prevista e interazioni di legame ragionevoli tra il cis-477 e il substrato sul sito di scissione, quindi salvarlo come file PDB per ulteriori simulazioni MD. Dopo aver letto le pose di associazione con AutoDock, è importante eseguire analisi post-docking per identificare il modello di binding plausibile per il perfezionamento con simulazioni MD.Questo protocollo è stato utilizzato per trovare brevi tratti di sequenze omologhe di proteine patogene ospiti o SSHHPS nel virus Zika ns2B/3 proteasi. Sono stati identificati quattro obiettivi proteici ospiti. FOXGS, SFRP1, una subunità di Gsalpha da una libreria cDNA retinica, e la mitocondriale NT5M 5'3'nucleotidasi.Gli allineamenti di sequenza dello SSHHPS hanno permesso differenze specifiche delle specie nelle sequenze del sito di scissione. La sequenza SFRP1 era identica negli esseri umani e nei polli, il che è degno di nota perché il virus Zika può indurre mortalità e microcefalia negli embrioni di pollo. Il saggio continuo è stato utilizzato per misurare parametri cinetici a stato stazionario e costanti di inibizione per le sequenze di poliproteina virale e il saggio discontinuo è stato utilizzato per ottenere informazioni qualitative sulla scissione, come la scissione di una particolare sequenza o l'inibizione della proteasi da parte di vari composti.Un modello dell'encefalite equina venezuelana nsP1-nsP2 è stato realizzato utilizzando metodi silico. Per la proteasi nsP2, allungare la sequenza del substrato e ridurre la forza ionica del tampone ha portato ad una significativa riduzione della costante di Michaelis di scissione di una sequenza di virus della foresta di Semliki. Quando si tenta questa procedura, è importante eseguire i controlli.I substrati contenenti le sequenze del sito di scissione proteasi virale devono essere testati prima di procedere con l'analisi della sequenza SSHHPS. Se si osserva la scissione di una proteina ospite, devono essere effettuati esperimenti di follow-up per confermare che tale proteina ospite influisce sulla replicazione virale. Questo può essere fatto sovraesprimendo o silenziando la proteina, e quindi esaminando gli effetti sulla replicazione virale.Il gruppo IV contiene un gran numero di agenti patogeni nuovi ed emergenti. Le sequenze SSHHPS collegano proteine e percorsi ospiti specifici con le proteasi virali in modo molto prevedibile.

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