Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

Questa tecnica consente di chiarire la fisiopatologia delle malattie cardiache attraverso lo studio della correlazione tra parametri in vitro e in vivo in modelli animali e nell'uomo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio della funzione profonda dei miofilamenti utilizzando biopsie molto piccole o campioni che sono stati conservati congelati. Questa tecnica consente di valutare in vitro l'impatto degli interventi terapeutici sui miofilamenti.

Prima di tentare un esperimento, è consigliabile esercitarsi nell'estrazione dei cardiomiociti alcune volte per imparare a selezionare, incollare e attivare i cardiomiociti con buone dimensioni, striature e forma. Prima di iniziare la procedura, regolare la temperatura dell'apparecchiatura di prova nella camera a 15 gradi Celsius e accendere il trasduttore di forza e il motore. Scongelare da tre a cinque microgrammi di campione miocardico in una capsula di Petri contenente 2,5 millilitri di soluzione ISO rilassante e utilizzare un bisturi per tagliare con precisione il tessuto in piccoli pezzi senza causare danni cellulari non necessari.

Quando tutto il tessuto è stato tagliato, utilizzare una punta di pipetta tagliata per trasferire l'intero volume di soluzione e frammenti di tessuto in un bicchiere Potter-Elvehjem e utilizzare un macinatore per disgregare meccanicamente il tessuto a 30-40 rotazioni al minuto. Quando è stata ottenuta una buona sospensione cellulare, aggiungere 250 microlitri di Triton a una provetta da 15 millilitri contenente 2,25 millilitri di relax ISO e aggiungere la sospensione cellulare alla soluzione risultante. Capovolgere delicatamente la provetta tre volte per mescolarla e lasciarla riposare a temperatura ambiente per un minuto, seguita da un'incubazione di quattro minuti su ghiaccio.

Al termine dell'incubazione con ghiaccio, portare il volume finale della provetta fino a 15 millilitri con ISO rilassante aggiuntivo e mescolare le provette tre volte per inversione come dimostrato, quindi centrifugare le cellule, quindi rimuovere con cura quasi tutto il liquido tranne gli ultimi tre millilitri del surnatante. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante fino a un volume compreso tra cinque e 10 millilitri di sospensione cellulare. Per la selezione dei cardiomiociti cutamati, aggiungere una goccia di sospensione cellulare su un vetrino coprioggetti posizionato sopra un vetrino in un supporto per vetrini da microscopio invertito e utilizzare l'obiettivo 20X per selezionare un singolo cardiomiocita a forma di bastoncino con un buon modello di striatura e dimensioni.

Utilizzare due mani per ruotare il vetrino coprioggetti fino a quando il cardiomiocita selezionato non è posizionato orizzontalmente con le estremità allineate con l'ago del trasduttore di forza e il motore e utilizzare la punta di una pipetta per posizionare una sottile linea di colla lungo il lato del vetrino coprioggetti. Per incollare la cellula in posizione, immergere le punte dell'ago del trasduttore di forza e del motore nella linea di colla per creare un alone di colla attorno a entrambe le punte e spostare rapidamente la punta dell'ago del trasduttore di forza verso il basso in modo che si incolli a un bordo del cardiomiocita. Ripetere questa procedura con la punta del motore e l'altra estremità della cella.

Dopo cinque-otto minuti, muovere entrambi i micromanipolatori contemporaneamente per sollevare gli aghi di circa 15 micrometri per evitare di incollare la cella al vetrino coprioggetti. Per misurare le forze attive e passive e la sensibilità al calcio, riempire il primo pozzetto sperimentale con 55-100 microlitri di soluzione rilassante e riempire il secondo pozzetto sperimentale con 55-100 microlitri di soluzione attivante. Utilizzando il software della fotocamera, impostare la regione di interesse su un'area del cardiomiocita con un chiaro schema di striatura e impostare la lunghezza del sarcomero a 2,2 micrometri.

Misurare la distanza tra i due estremi del cardiomiocita e registrare il valore come lunghezza del miocita all'interno del software. Quindi, spostare gli aghi leggermente più in alto e spostare delicatamente il tavolino del microscopio in modo che la cellula si sposti dal vetrino coprioggetti al pozzetto contenente la soluzione rilassante sul retro del tavolino. Selezionare il protocollo che contiene l'accorciamento di due cellule che si verifica quando la cellula viene emersa in sequenza nelle soluzioni di calcio e rilassante.

Per provocare una contrazione isometrica, spostare il tavolino del microscopio in modo che il cardiomiocita si sposti dalla soluzione rilassante a quella attivante. Una volta raggiunto il plateau di forza, iniziare a registrare i dati di forza. Dopo 10 secondi, passare la cella alla soluzione rilassante e registrare i dati fino all'arresto del test.

Per determinare la sensibilità al calcio, sostituire la soluzione attivante con 55-100 microlitri di ciascuna soluzione di calcio e registrare i dati come appena dimostrato. Al termine della misurazione, allungare le punte del trasduttore di forza e del motore per rimuovere gli aghi dalla cella e utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di acetone per rimuovere con cura l'alone di colla dalle punte degli aghi. Sebbene ci si aspetti un certo grado di deterioramento e diminuzione della forza dopo esperimenti prolungati, i valori di tensione attiva all'interno dei cardiomiociti permeabilizzati funzionali dovrebbero essere relativamente stabili.

Qui, vengono mostrate le tracce di forza rappresentative di tre delle otto registrazioni di forza necessarie per eseguire un protocollo di sensibilità al calcio del miofilamento. Trasferendo la cellula in un pozzetto contenente la soluzione attivante, i cardiomiociti iniziano a sviluppare forza fino a raggiungere un plateau. Dopo un rapido test di allentamento, è possibile ottenere i valori di base di forza zero.

La pendenza dell'ultima parte di questa curva può essere utilizzata per determinare il valore del tasso di sviluppo della forza, che è una misura del tasso apparente di attacco e distacco del ponte trasversale. Dopo aver trasferito la cellula in un pozzo contenente la soluzione rilassante, la cellula si rilassa e la sua forza diminuisce. Oltre alla sensibilità al calcio del miofilamento e alle misure di attivazione dipendenti dalla lunghezza, è possibile calcolare le dipendenze dalla lunghezza del sarcomero della tensione passiva e le dipendenze dalla lunghezza del sarcomero della forza attivata dal calcio per area della sezione trasversale e la tensione indipendente dal calcio.

Infine, è importante notare che il modo in cui i cardiomiociti vengono isolati influisce in modo significativo sui risultati. L'utilizzo di cardiomiociti cutanei per valutare la funzione cardiaca in vitro è una tecnica importante per chiarire i cambiamenti che si verificano a livello cellulare e per studiare i meccanismi dei miofilamenti in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Questo metodo ha il vantaggio di richiedere una quantità minima di campione miocardico e di consentire l'utilizzo di cardiomiociti provenienti da un'ampia gamma di specie, sedi cardiache e patologie.