Name: Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e dai tessuti ovarici di controllo per lanalisi quantitativa proteomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Scopri come isolare e purificare i mitocondri da tessuti di cancro ovarico e controlli mediante centrifugazione differenziale e a gradiente di densità. Questo metodo consente analisi proteomiche quantitative di alta qualità per identificare biomarcatori e bersagli terapeutici nel cancro ovarico.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Hunan Provincial Hundred Talent Plan (a X.Z.), Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (a X ) ), la National Natural Science Foundation of China (Grant no. (Grant n. 2014AA020610-1 a X ) e la Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant n. 14JJ7008 a X . X.Z. ha concepito il concetto per il presente manoscritto, ha ottenuto i dati proteomici quantitativi iTRAQ dei campioni di mitocondri, ha scritto e rivisto il manoscritto, ha coordinato l'opera pertinente ed è stato responsabile del sostegno finanziario e dei corrispondenti Lavoro. H.L. ha preparato campioni di mitocondri. S.Q. ha partecipato a lavori parziali. Alla scrittura e alla modifica della lingua inglese, X.H. ha partecipato alla scrittura e alla modifica della lingua inglese. N.L. ha analizzato i dati proteomici iTRAQ. Tutti gli autori hanno approvato il manoscritto finale.

Per questo protocollo sono stati utilizzati campioni di tessuto ovarico, compresi i tessuti del cancro ovarico (n . 7) e i tessuti ovarici di controllo normale (n . 11). L'attuale protocollo3,4,5 è approvato dal Comitato Di Etica Medica Ospedale Xiangya della Università Centro-Sud, Cina.
1. Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico umano
<ol><li>Preparare 250 mL del buffer di isolamento mitocondriale mescolando 210 mm mannitol, 70 mM di saccarosio, 100 mM di cloruro di potassio (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diacido nocitico acido tetraceo (EDTA), 0,1 mM etilene glicole bis(2-aminoethyl ether)acido tetraacetico (EGTA), 1 mM fenilmetathanesulfonyl fluoruro (PMSF) inibitore della proteasi, 2 MM di ortovanada (V) e 0,2% albumina di siero bovino (BSA), pH 7,4.</li>
	<li>Mettere 1,5 g di tessuti tumorali ovarici in un piatto di vetro pulito.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL del cuscinetto di isolamento mitocondriale pre-raffreddato per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto 3x.</li>
	<li>Utilizzare forbici oftalmiche pulite per tritare completamente il tessuto in circa 1 mm3 pezzi e trasferire i tessuti tritati in un tubo centrifuga di 50 mL.</li>
	<li>Aggiungere 13,5 mL di buffer di isolamento mitocondriale contenente 0,2 mg/mL di nagarse, quindi utilizzare un omogeneizzatore elettrico per omogeneizzare (usare la scala 2, 10 s 6x, l'intervallo 10 s) i tessuti macinati (2 min, 4 gradi centigradi).</li>
	<li>Aggiungere altri 3 mL di buffer di isolamento mitocondriale negli omogenei tissutali e mescolarli bene pipettando.</li>
	<li>Centrifugare l'omogenea del tessuto preparato (1.300 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Rimuovere la frazione nucleare grezza (cioè il pellet) e mantenere il supernatante.</li>
	<li>Riconstate il supernatante (10.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Rimuovere i microsomi (cioè il supernatante) e mantenere il pellet.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento mitocondriale e risospendere bene il pellet con tubi leggeri.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione del pellet (7.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Scartare il supernatante e mantenere i mitocondri grezzi (cioè il pellet).</li>
	<li>Aggiungere 12 mL di mezzo gradiente di densità del 25% (cioè Nycodenz) per rispendere i mitocondri grezzi estratti.</li>
	<li>Creare un gradiente di densità discontinuo riempiendo un tubo dal basso verso l'alto con 5 mL del 34%, 8 mL del 30%, 12 mL del 25% (contenente i mitocondri grezzi dal passo 1.11), 8 mL del 23% e 3 mL di mezzo di pendenza 20% e centrifugarlo (52.000 x g, 90 min, 4 C).</li>
	<li>Utilizzare una siringa lunga e smussata per raccogliere i mitocondri purificati all'interfaccia tra il mezzo di pendenza a densità 25% e 30% in un tubo pulito.</li>
	<li>Aggiungere buffer di isolamento mitocondriale nei mitocondri raccolti per diluirlo in un volume triplo. Centrifuga (15.000 x g, 20 min, 4 gradi centigradi) e scartare il supernatante.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento mitocondriale per risospendere il pellet e centrifugare (15.000 x g, 20 min, 4 gradi centigradi). Scartare il supernatante e tenere il pellet.</li>
	<li>Raccogliere il pellet finale (cioè i mitocondri purificati) e conservarlo a -20 gradi centigradi. NOTA: Combinare tutti i mitocondri purificati dal tessuto del cancro ovarico come campione di mitocondri per l'analisi proteomica quantitativa.</li>
</ol>2. Preparazione dei mitocondri dai tessuti ovarici del controllo umano
<ol><li>Preparare 250 mL del buffer di isolamento mitocondriale come descritto nel passaggio 1.1.</li>
	<li>Mettere 1,5 g di tessuti ovarici di controllo normale in una teglia di vetro pulito.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di cuscinetto di isolamento mitocondriale pre-raffreddato per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto 3x.</li>
	<li>Utilizzare forbici oftalmiche pulite per tritare completamente il tessuto in circa 1 mm3 pezzi e trasferire i tessuti tritati in un tubo centrifuga di 50 mL.</li>
	<li>Aggiungere 8 mL di 0,05% trypsin/20 mM EDTA in salina con buffer fosfati (PBS) ai tessuti di controllo macinati e digerire (30 min, temperatura ambiente), che aiuta a lizzare i tessuti e le cellule e rilasciare mitocondri. Quindi centrifuga (200 x g, 5 min). Scartare il super-atuante e mantenere i tessuti e le cellule.</li>
	<li>Aggiungere 13,5 mL di buffer di isolamento mitocondriale contenente 0,2 mg/mL di nagarse, quindi utilizzare un omogeneizzatore elettrico per omogeneizzare (usare la scala 2, 10 s 6x, l'intervallo 10 s) i tessuti macinati (2 min, 4 gradi centigradi).</li>
	<li>Aggiungere altri 3 mL di buffer di isolamento mitocondriale negli omogenei tissutali e mescolarli bene pipettando.</li>
	<li>Centrifugare l'omogenea del tessuto preparato (1.300 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Rimuovere la frazione nucleare grezza (cioè il pellet) e mantenere il supernatante.</li>
	<li>Riconstateil supernatante (10.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Rimuovere i microsomi (cioè il supernatante) e mantenere il pellet.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento mitocondriale per risospendere bene il pellet con il pipettaggio leggero.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione del pellet (7.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Scartare il supernatante e mantenere i mitocondri grezzi (cioè il pellet).</li>
	<li>Aggiungere 12 mL di mezzo sfumato a densità 25% per rispendere i mitocondri grezzi estratti.</li>
	<li>Creare una pendenza di densità discontinua riempiendo un tubo dal basso verso l'alto con 8 mL del 38%, 5 mL del 34%, 8 mL del 30%, 12 mL del 25% (contenente i mitocondri grezzi dal passo 2.12), 8 mL del 23%, e 3 mL del mezzo di pendenza 20% di densità, e centrificarlo (52.000 x g, 90 min, 4 gradi).</li>
	<li>Utilizzare una siringa lunga e smussata per raccogliere i mitocondri purificati nell'intervallo dall'interfaccia tra il 25% e il 30% all'interfaccia tra il 34% e il 38% in un tubo pulito.</li>
	<li>Aggiungere buffer di isolamento mitocondriale nei mitocondri raccolti per diluirlo in un volume triplo. Centrifuga (15.000 x g, 20 min, 4 gradi centigradi) e scartare il supernatante.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento mitocondriale per risospendere il pellet e centrificarlo (15.000 x g, 20 min, 4 . Scartare il supernatante e tenere il pellet.</li>
	<li>Raccogliere il pellet finale (cioè i mitocondri purificati) e conservarlo a -20 gradi centigradi. NOTA: Combinare tutti i mitocondri purificati dal tessuto ovarico di controllo come campioni mitocondriali per l'analisi proteomica quantitativa.</li>
</ol>3. Verifica della qualità dei campioni mitocondriali dei tessuti purificati
<ol><li>Prendete un tubo di campioni mitocondriali purificati (cioè i pellet dei tessuti del cancro ovarico dal passo 1.16 e i tessuti ovarici di controllo dal passo 2.17) per la verifica con microscopia elettronica (EM). NOTA: il protocollo dettagliato è stato descritto in precedenza15,16.</li>
	<li>Preparare il buffer di estrazione delle proteine mitocondriali mescolando 8 M di urea, 2 M di thiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM dithiothreitol (DTT) e 4% (w:v) 3-(3-cholamidopropyl) dimetuope)-1-propanefonazione (CHAPS). Regolare il pH a 8,52.</li>
	<li>Prendere un tubo di campioni mitocondriali purificati (cioè i pellet dai tessuti del cancro ovarico al passo 1.16 e i tessuti ovarici di controllo nel passaggio 2.17) e aggiungere il buffer di estrazione delle proteine mitocondriali (campioni mitocondriali al buffer di estrazione delle proteine, 1:5) a risospendere il pellet. Congelare i campioni in azoto liquido 3x e conservarli a temperatura ambiente per 2 ore.</li>
	<li>Centrifuga a 12.000 x g, 30 min, 4 gradi centigradi, raccolgono il supernatante (cioè il campione di proteine mitocondriali estratto) e misurano il contenuto proteico con un kit di appagamento proteico dell'acido bicinchoninico (BCA).</li>
	<li>Preparare 50 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8) mescolando 9,08 g di Tris e 40 mL di ddH2O, regolando il pH a 8,8 utilizzando HCl e aggiungendo ddH2O ad un volume finale di 50 mL. Conservare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare 50 mL di 1 M Tris-HCl (pH 6.8) mescolando 6,06 g di Tris e 40 mL di ddH2O, regolando il pH a 6,8 utilizzando HCl e aggiungendo ddH2O ad un volume finale di 50 mL. Conservare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare 100 mL di soluzione acrilamide-bis del 30% mescolando 29 g di acrilammide, 1 g di bis acrilammide e 80 mL di ddH2O e aggiungendo ddH2O a un volume finale di 100 mL. Conservarlo in una bottiglia marrone a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare 1.000 mL di 10x cuscinetto di elettroforesi tris-glicina mescolando 29 g di glicina, 58 g di Tris, 3,7 g di solfato di sodio dodecyl (SDS) e 800 mL di ddH2O, e quindi aggiungendo ddH2O ad un volume finale di 1.000 mL.</li>
	<li>Preparare 10 mL di buffer di carico mescolando 2 mL di glicerina, 0,02 g di blu bromofenolo, 0,4 g di SDS, 2 mL di Tris-HCl pH 6.8 e 7 mL di ddH2O, e quindi aggiungendo ddH2O a un volume finale di 10 mL.</li>
	<li>Preparare 10 mL di 10% di sodio solfato-polyacrilimide gel elettroforesi (SDS-PAGE) gel di risoluzione mescolando 4 mL di ddH2O, 3,3 mL di soluzione acrilamide-Bis del 30%, 2,5 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 mL di 10% SDS, 0,1 mL del 10% di persoletta di ammonio e 0,004 mL di tetrametilililethydidia (TEMEDMED). Versare la soluzione gel di risoluzione SDS-PAGE nella piastra tra le lastre di vetro al livello del fondo del pettine. Aggiungere 2 mL di alcool isopropile sulla parte superiore. Lasciare agire per 30 min.</li>
	<li>Rimuovere l'alcool isopropile e lavare la parte superiore con ddH2O 3x. Versare la soluzione di gel di concentrazione del 5% contenente 4,1 mL di ddH2O, 1,0 mL di soluzione acylamide-bis del 30%, 0,75 mL di 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 mL di 10% SDS, 0,06 mL di 10% di ammoniaca persulfat e 0,006 mL di TEMED. Inserire immediatamente il pettine nella soluzione di gel di concentrazione, lasciare per 30 min, e poi estrarre il pettine.</li>
	<li>Preparare il buffer 1x di elettroforesi Tris-glicina didiluindo 100 mL di 10x buffer di elettroforesi Tris-glicina con 900 mL di ddH2O e versare nel serbatoio elettroforetico.</li>
	<li>Mescolare i 30 g delle proteine mitocondriali del cancro ovarico e controllare i tessuti ovarici dal passo 3.4 con il buffer di carico per raggiungere un volume finale di 20 gradi. Quando il blu del bromphenol raggiunge il fondo, fermare l'elettroforesi.</li>
	<li>Preparare 1,5 L di buffer di trasferimento elettroforetico mescolando 150 mL di 10x buffer di elettroforesi Tris-glicina, 1.050 mL di ddH2O e 300 mL di metanolo.</li>
	<li>Immergere la membrana PVDF in metanolo 100% per 10 min e nel buffer di trasferimento elettroforetico per almeno 5 min.</li>
	<li>Estrarre il gel SDS-PAGE contenente le proteine e immergerlo nel buffer di trasferimento elettroforetico per 10 min.</li>
	<li>Fare una cassetta di trasferimento posizionando una spugna bagnata sulla piastra bianca, tre fogli di carta da filtro bagnato, la membrana PVDF, il gel SDS-PAGE con le proteine, due fogli di carta da filtro bagnato e la spugna bagnata dal basso verso l'alto. Evitare le bolle.</li>
	<li>Posizionare la cassetta di trasferimento nel serbatoio elettroforetico, versare nel buffer di trasferimento elettroforetico, quindi trasferire per 2 h sotto una corrente costante di 200 mA.</li>
	<li>Preparare la soluzione di riserva 10x Tris-buffered (TBS) mescolando 12.114 g di Tris, 29.22 g di NaCl, e l'aggiunta di ddH2O ad un volume finale di 500 mL. Preparare 2 L di 1x TBST mescolando 200 mL di 10x TBS, 2 mL di Tween-20 e 1.798 mL di ddH2O. Preparare 100 mL di soluzione di blocco mescolando 100 mL di TBST e 5 g di BSA.</li>
	<li>Dopo il trasferimento, estrarre la membrana PVDF, lavare leggermente in TBST per 5 min, quindi bloccarla in soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare la membrana PVDF (4 gradi durante la notte) con diversi anticorpi primari specifici di diverse orgine subcellulari, tra cui lamina B (nucleo cellulare; anticorpo anti-umano di capra 1: 1.000 soluzione di blocco), flotillin-1 (citomembrana; coniglio anti-umano anticorpo 1:500 soluzione di blocco), COX4I1 (mitocondrione; coniglio anti-umano 1:1.000 soluzione di blocco), GM130 (Golgi apparatus; topo anti-umano anticorpo 1:1,000 soluzione di blocco), catalasi (perossiama; anticorpo anti-umano del coniglio 1:1,000 blocco e cathepsina B (lysososome; coniglio anti-umano anticorpo 1:1.000 soluzione di blocco). Lavare leggermente in TBST per 5 min 3x.</li>
	<li>Incubare la membrana PVDF per 1 h a temperatura ambiente con gli anticorpi secondari corrispondenti (anti-capra del coniglio, capra anti-coniglio o capre anti-topo). Lavare leggermente in TBST per 5 min 3x. Visualizzarlo con elettrochemiluminescenza (ECL).</li>
</ol>4. analisi iTRAQ-SCX-LC-MS/MS
NOTA: le procedure dettagliate per la sezione 4 si riferiscono alle istruzioni iTRAQ (Tabella dei materiali).
<ol><li>Aggiungere il buffer SDT (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 e 100 mM DTT) ai campioni mitocondriali purificati (cioè i pellet dei tessuti del cancro ovarico dal punto 1.16 e i tessuti ovarici di controllo dal passo 2.17). Vorticare il campione fino a quando non vi è alcun precipitato visibile. NOTA: il campione mitocondriale al rapporto buffer SDT deve essere 1:5.</li>
	<li>Far bollire il campione trattato con SDT per 5 min, raffreddare il campione sul ghiaccio, quindi centrifugare (2.000 x g, 2 min).</li>
	<li>Raccogli il supernatante come campione di proteine mitocondriali estratto e misura il contenuto proteico con un kit di test proteici BCA.</li>
	<li>Prendiamo le proteine mitocondriali estratte da SDT (200 g per ogni campione) per la riduzione, l'alchilazione, la digestione con la trypsina, la desalinizzazione e la liofilizzazione3,4. Eseguire tre repliche per ogni campione.</li>
	<li>Trattare i peptidi tripici (100 g di ogni campione) dal punto 4.4 con 100 mM di soluzione di bromuro di ammonio tetraeli (pH 8.5) ed etichettare i peptidi tripitici con uno dei reagenti iTRAQ a 6 plex secondo le sue istruzioni3,4. Etichettare ogni campione 3x.</li>
	<li>Mescolare ugualmente 6 campioni di peptidi tripptici etichettati (tre dai tessuti del cancro ovarico e tre dai tessuti ovarici di controllo), e asciugare con un concentratore di vuoto.</li>
	<li>Frazionare i peptidi misti con etichetta iTraQ con cromatografia SCX in 60 frazioni (una frazione per 1 min), quindi combinare ogni due frazioni come un campione frazionato SCX (n - 30).</li>
	<li>Sottoporre ogni campione frazionato SCX all'analisi LC-MS/MS su uno spettrometro di massa3,4 accoppiato con un sistema Nano LC all'interno di un gradiente di separazione LC di 60 minuti per ottenere dati MS/MS.</li>
	<li>Cercare i dati MS/MS per identificare le proteine con il motore di ricerca (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Utilizzare le intensità degli ioni di reporter iTRAQ per quantificare ogni proteina e determinare le proteine mitocondriali espresse in modo differenziale (mtDEP) con una modifica di >1.5 o <-1.5 piega e p < 0,05.</li>
</ol>

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<li>Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome-mitochondria+interplay+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Peroxisome-mitochondria interplay and disease.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).</li>
<li>Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+structure+and+dynamics+by+the+cytoskeleton+and+mechanical+factors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812(2017).</li>
<li>Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+characterization+of+mitochondrial+proteome+from+human+T+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).</li>
<li>Zhan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).</li>
<li>Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revival+of+2DE-LC%2FMS+in+proteomics+and+its+potential+for+large-scale+study+of+human+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Med+One%22%5BJournal%5D)">Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms.</a> Med One. 3, e180008(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le alterazioni mitocondriali sono un segno distintivo del cancro ovarico. La preparazione di campioni mitocondriali di alta qualità dal cancro ovarico umano e dai tessuti di controllo per la proteomica quantitativa su larga scala beneficia la comprensione approfondita della funzione mitocondriale nella patogenesi del cancro ovarico e nei cambiamenti della rete molecolare mitocondriale e aiuta a chiarire il suo meccanismo molecolare per la successiva scoperta della terapia bersaglio e biomarcatori efficaci basati sui mito...

Il cancro ovarico è un cancro ginecologico comune con elevata mortalità ma meccanismo molecolare poco chiaro1,2. La maggior parte dei tumori ovarici sono diagnosticati in fase avanzata, che ostacola seriamente la terapia. I cambiamenti mitocondriali sono un segno distintivo dei tumori ovarici umani e i mitocondri sono i centri del metabolismo energetico, della segnalazione cellulare e dello stress ossidativo3,4,5,6,7. Approfondimenti sui cambiamenti del proteoma mitocondriale nei tumori ovarici rispetto al controllo del tessuto ovarico beneficeranno una comprensione approfondita dei meccanismi molecolari del cancro ovarico e la scoperta di biomarcatori e bersagli terapeutici efficaci e affidabili. Il metabolismo mitocondriale è stato proposto e riconosciuto come un obiettivo per la terapia del cancro, e la terapia antimitocondriale potrebbe in ultima analisi essere molto utile per prevenire la ricorrenza e la metastasi del cancro8. La profilazione metabolica individuale è già praticata come strumento utile per la stratificazione del cancro e le strategie predittive9,10.
L'obiettivo a lungo termine di questa ricerca è quello di sviluppare e utilizzare un metodo proteomico mitocondriale quantitativo per studiare il cancro ovarico per chiarire le alterazioni del proteoma mitocondriale tra il cancro ovarico e controllare i tessuti ovarici, e le loro alterazioni della rete molecolare da un angolo multio-omico sistematico11,12, che si tradurrà nella scoperta di biomarcatori molecolari mirati ai mitocondri13 per chiarire i meccanismi molecolari del cancro ovarico, previsione e trattamento personalizzato dei pazienti affetti da cancro ovarico. I tag isobarici per la quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ) che etichettano3,4 sono un metodo efficace per quantificare i cambiamenti delle proteine mitocondriali. La preparazione di campioni mitocondriali di alta qualità dal cancro ovarico umano e dai tessuti ovarici di controllo sono il prerequisito per l'analisi quantitativa iTRAQ dei proteomi mitocondriali3. La preparazione mitocondriale abbinata alla proteomica quantitativa iTRAQ è stata utilizzata con successo in programmi di ricerca a lungo termine sul proteoma mitocondriale del cancro ovarico umano, tra cui l'istituzione di mappe di riferimento proteoma mitocondriali3, l'analisi dei profili mitocondriali espressi in modo differenziale4,14 e modifiche post-traduzionali, compresa la fosforolanazione, che ha già portato alla scoperta di importanti percorsi di segnalazione cambiamenti di rete nei tumori ovarici umani5, comprese le alterazioni del metabolismo energetico4, metabolismo dei lipidi e mitofagia dei sistemi di percorsi3.
Studi precedenti hanno scoperto che la centrifugazione differenziale-velocità in combinazione con la centrifugazione del gradiente di densità è un metodo efficace per isolare e purificare i mitocondri dal cancro ovarico umano e controllare i tessuti ovarici3,4,5,14. L'etichettatura iTRAQ abbinata a un forte scambio di cation (SCX)-liquid qromatotry (LC)-tandem mass spectromate (MS/MS) è la tecnica chiave per rilevare, identificare e quantificare le proteine dai campioni mitocondriali preparati.
Qui vengono descritti protocolli dettagliati per la preparazione mitocondriale abbinati a proteomica quantitativa iTRAQ. Questi sono stati utilizzati con successo nell'analisi dei proteomi mitocondriali del tessuto ovarico umano. I protocolli includono la preparazione di campioni, la centrifugazione a velocità differenziale, la centrifugazione del gradiente di densità, la valutazione della qualità dei campioni mitocondriali, la digestione delle proteine con trippsina, l'etichettatura iTRAQ, la frazione SCX, l'LC, la MS/MS, la ricerca nel database e l'analisi quantitativa delle proteine mitocondriali. Inoltre, questo protocollo si traduce facilmente per analizzare altri proteomi mitocondriali del tessuto umano.

<table><tbody><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td> Il kit per il dosaggio delle proteine BCA <td>Vazyme</td><td>E112</td><td>è una versione speciale a 3 componenti dei nostri popolari reagenti BCA, ottimizzata per misurare (A562nm) la concentrazione proteica totale di soluzioni proteiche diluite (da 0,5 a 20 microgrammi/ml).</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Solarbio</td><td>A8020-5G</td><td>Frazione da shock termico, origine australiana, senza proteasi, basso contenuto di acidi grassi, basso IgG, pH 7, &ge; 98%</td></tr> <tr><td>Centrifuga</td><td>XiangYi</td><td>TDZ4--WS</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C9426-5G</td><td>BioReagent, adatto per elettroforesi, &ge; 98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Acido tetraacetico diammina (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>798681-100G</td><td>Anidro, a flusso libero, Redi-Dri, &ge; 98%</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>1,4-Ditiotreitolo</td></tr><tr><td>Easy nLC</td><td>Proxeon Biosystems (ora Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico bis(2-amminoetiletere)acido tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-10G</td><td>BioXtra, &ge; 97 .0%</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td>SilentShake</td><td>HYQ-3110</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti iTRAQ</td><td>Applied Biosystems Applied Biosystems</td><td></td><td>Reagenti iTRAQ&ndash; Guida di riferimento per la chimica, P/N 4351918A</td></tr><tr><td>Centrifugatore a bassa velocità</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Macklin</td><td>M813424-100G</td><td>Il mannitolo è un poliolo (alcol poliidrico) prodotto dall'idrogenazione del fruttosio che funziona come dolcificante, umettante e agente di carica. Ha una bassa igroscopicità e una scarsa solvibilità dell'olio.</td></tr><tr><td>Motore di ricerca MASCOT</td><td>Matrix Science, Londra, Regno Unito; versione 2.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nagarse</td><td>Solarbio</td><td>P9090</td><td></td></tr><tr><td>N-idrossisuccinimide (SDT)</td><td>Sigma</td><td>56480-25G</td><td>Purum, &ge; 97,0% (T)</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Alere/Axis-Shield</td><td>1002424-1</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi del fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Solarbio</td><td>P0100-1ML</td><td>PMSF è un inibitore della proteasi che reagisce con i residui di serina per inibire la tripsina, la chimotripsina, la trombina e la papaina.</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Macklin</td><td>P816354-25G</td><td>Il cloruro di potassio, KCI, noto anche come muriato di potassio e silvite, è un solido cristallino incolore con un sapore salato che si scioglie a 776 gradi C (1420 DI). È solubile in acqua, ma insolubile in alcool. Il cloruro di potassio è usato nei fertilizzanti, nei prodotti farmaceutici, nella fotografia e come sostituto del sale.</td></tr><tr><td>Proteome Discover 1.4</td><td>Matrix Science, Londra, Regno Unito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>05317</td><td>Si tratta di 1 rotolo, 26,5 cm x 1,875 m, 0,45 &; m dimensione dei pori, membrana di trasferimento PVDF idrofobica con bassa fluorescenza di fondo per western blotting. È compatibile con sonde fluorescenti nel visibile e nell'infrarosso.</td></tr><tr><td>Q Spettrometro di massa esattivo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCX colonna</td><td>Sigma</td><td>58997</td><td>È 5-&mu; m granulometria, lunghezza 5cm e tempi; diametro interno 4,6 mm (Supelco).</td></tr><tr><td>Ortovanadato di sodio (V)</td><td>Macklin</td><td>S817660-25G</td><td>L'ortovanadato di sodio (Vanadato) è un inibitore competitivo generale delle proteine fosfotiroil fosfatasi. L'inibizione da parte dell'ortovanadato di sodio è reversibile con l'aggiunta di EDTA o per diluizione.</td></tr><tr><td>Grado</td> di reagente <td>Macklin</td><td>S824459-500G</td><td>Vetec, reagente ACS 99%</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma</td><td>62-56-6</td><td>, &ge; 99,0%</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td>TRIS base è utile nell'intervallo di pH 7,0-9,0. Ha un pKa di 8,1 a 25°C.</td></tr><tr><td>Tripsina (uso in colture cellulari)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Questa formulazione liquida di tripsina contiene EDTA e rosso fenolo. Gibco Trypsin-EDTA è costituito da polvere di tripsina, una miscela irradiata di proteasi derivate dal pancreas suino. Grazie alla sua forza digestiva, la tripsina è ampiamente utilizzata per la dissociazione cellulare, il passaggio di routine della coltura cellulare e la dissociazione dei tessuti primari.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378-100G</td><td>polvere, BioReagente, per biologia molecolare, adatto per colture cellulari</td></tr></tbody></table>

preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e dai tessuti ovarici di controllo per l'analisi quantitativa proteomica

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Il cancro ovarico è un cancro ginecologico comune con elevata mortalità ma meccanismo molecolare poco chiaro. La maggior parte dei tumori ovarici sono diagnosticati in fase avanzata, che ostacola seriamente la terapia. I cambiamenti mitocondriali sono un segno distintivo dei tumori ovarici umani e i mitocondri sono i centri del metabolismo energetico, della segnalazione cellulare e dello stress ossidativo. Approfondimenti sui cambiamenti del proteoma mitocondriale nei tumori ovarici rispetto al controllo del tessuto ovarico beneficeranno una comprensione approfondita dei meccanismi molecolari del cancro ovarico e la scoperta di biomarcatori e bersagli terapeutici efficaci e affidabili. Un metodo di preparazione mitocondriale efficace accoppiato con un tag isobarico per la quantificazione quantitativa relativa e assoluta (ITRAQ) proteomica quantitativa sono presentati qui per analizzare il cancro ovarico umano e controllare i proteomi mitocondriali, compresa la centrifugazione a velocità differenziale, la centrifugazione del gradiente di densità, la valutazione della qualità dei campioni mitocondriali, la digestione delle proteine con la trippsina, l'etichettatura iTRAQ, la forte frazionazione di scambio di cation (SCX), la cromatografia liquida (LC), la spettrometria di massa tandem (MS/ MS), analisi del database e analisi quantitativa delle proteine mitocondriali. Molte proteine sono state identificate con successo per massimizzare la copertura del proteoma mitocondriale del cancro ovarico umano e per ottenere il profilo proteico mitocondriale espresso in modo differenziale nei tumori ovarici umani.

C'era una differenza nella preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e controllare i tessuti ovarici. Questo studio ha trovato che era molto più facile preparare i mitocondri dai tessuti del cancro ovarico che dal controllo dei tessuti ovarici3,4. Alcuni miglioramenti dovevano essere apportati al protocollo per la preparazione dei mitocondri dai tessuti ovarici di controllo. In primo luogo, prima dell'omogeneizzaz...

Questo articolo presenta un protocollo di centrifugazione a velocità differenziale in combinazione con la centrifugazione del gradiente di densità per separare i mitocondri dai tessuti del cancro ovarico umano e controllare i tessuti ovarici per l'analisi proteomica quantitativa, risulta in un campione mitocondriale di alta qualità e un'analisi proteomica quantitativa ad alta capacità di riproduzione e ad alta riproducibilità di un proteoma mitocondriale del cancro ovaricoterrestre umano.

Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e dai tessuti ovarici di controllo per l'analisi quantitativa proteomica

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

I cambiamenti mitocondriali svolgono un ruolo importante nei tumori ovarico umani. Questo protocollo stabilisce una piattaforma efficace per isolare e purificare i mitocondri dal cancro ovarico umano e dai tessuti di controllo per l'analisi della proteomica su larga scala. I mitocondri, come centri di metabolismo energetico, segnalazione cellulare e stress ossidativo, la comprensione dei cambiamenti del proteoma mitocondriale nei tumori ovarico beneficiano della nostra comprensione del meccanismo molecolare, ed è una scoperta di biomarcatori efficaci e degli obiettivi terapeutici.Questa tecnica utilizza la centrifugazione a velocità differenziale in combinazione con la centrifugazione del gradiente di densità per separare i mitocondri dal cancro ovarico umano nei tessuti di controllo, il che si traduce in campioni di mitocondri di alta qualità per l'analisi quantitativa della proteomica. La preparazione dei mitocondri, insieme alla proteomica quantitativa iTRAQ, è stata utilizzata con successo nell'analisi del tessuto tumorale ovarico umano, che si traduce facilmente per analizzare altri tessuti, la proteomica dei mitocondri. Coloro che non hanno mai eseguito questo metodo possono scoprire che può essere difficile isolare i mitocondri dal controllo ovarico rispetto ai tessuti tumorali.È necessario aggiungere una tripina per migliorare l'omogeneizzazione dei tessuti di controllo e aggiungere uno strato aggiuntivo di mezzo gradiente di densità per migliorare la separazione dei mitocondri. Per iniziare questa procedura, preparare 250 millilitri del buffer di isolamento mitocondriale come delineato nel protocollo di testo. Mettere circa 1,5 grammi di tessuti tumorali ovariani in un piatto di vetro pulito.Aggiungere due millilitri di tampone di isolamento mitocondriale pre-refrigerato per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto. Ripetere questo lavaggio tre volte. Quindi, utilizzare forbici oftalmiche pulite per tritare completamente il tessuto in pezzi che sono di circa un millimetro cubico e trasferire i tessuti tritati in un tubo di centrifuga da 50 millilitri.Aggiungere 13,5 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale contenente nagarse ad una concentrazione di 0,2 milligrammi per millilitro. Utilizzare un omogeneizzatore elettronico per omogeneizzare i tessuti tritati per due minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere altri tre millilitri di tampone di isolamento mitocondriale agli omogeneati tissutali e mescolarli bene pipettando.Centrifugare il tessuto preparato omogeneizzato a 1.300 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il pellet e mantenere il supernatante. Quindi, centrifuga il supernatante a 10.000 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Rimuovere il supernatante contenente microsomi e mantenere il pellet. Aggiungere 2 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale e sospendere accuratamente il pellet mediante pipettazione leggera. Centrifuga questa sospensione a pellet a 7.000 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Scartare il supernatante e mantenere il pellet, che contiene i mitocondri grezzi. Aggiungere 12 millilitri di mezzo gradiente di densità del 25% per sospendere di nuovo i mitocondri grezzi estratti. Creare un gradiente di densità discontinuo contenente i mitocondri grezzi ri-sospesi come delineato nel protocollo di testo e centrifugarlo a 52.000 xg e a quattro gradi Celsius per 90 minuti.Utilizzare una siringa lunga e smussata per raccogliere i mitocondri purificati all'interfaccia tra i mezzi gradienti del 25% e del 30% e trasferirli in un tubo pulito. Aggiungere il tampone di isolamento mitocondriale ai mitocondri raccolti per diluirlo a un volume triplo. Centrifuga a 15.000 xg e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Scartare il supernatante e tenere il pellet. Raccogliere il pellet finale che contiene i mitocondri purificati e conservarlo a 20 gradi Celsius. In primo luogo, preparare 250 millilitri del buffer di isolamento mitocondriale come delineato nel protocollo di testo.Aggiungere circa 1,5 grammi dei normali tessuti ovarico di controllo a un piatto di vetro pulito. Aggiungere due millilitri di tampone di isolamento mitocondriale pre-refrigerato per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto. Ripetere questo lavaggio tre volte.Utilizzando forbici oftalmiche pulite, tritare completamente il tessuto in pezzi che sono di circa 1 millimetro cubo e trasferire i tessuti tritati in un tubo pulito da 50 millilitri. Aggiungere otto millilitri di una soluzione contenente lo 0,05% di tripside e 20 millimolare EDTA e PBS ai tessuti di controllo tritati e digerire a temperatura ambiente per 30 minuti per aiutare a lisciviare le cellule e rilasciare i mitocondri. Centrifuga a 200 xg per cinque minuti.Scartare il supernatante e tenere i tessuti e le cellule. Aggiungere 13,5 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale contenente nagarse a una concentrazione di 0,2 milligrammi per millilitro e utilizzare un omogeneizzatore elettrico per omogeneizzare i tessuti tritati a quattro gradi Celsius per due minuti. Aggiungere altri tre millilitri di tampone di isolamento mitocondriale agli omogeneati tissutali e mescolare accuratamente mediante pipettazione.Centrifugare il tessuto preparato omogeneizzato a 1,300 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il pellet e mantenere il supernatante. Centrifuga il supernatante a 10.000 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Rimuovere il supernatante, che contiene i microsomi, e mantenere il pellet. Quindi, aggiungere 2 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale e sospendere completamente il pellet mediante pipettazione leggera. Centrifuga questa sospensione a pellet a 7.000 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Scartare il supernatante e conservare il pellet che contiene i mitocondri grezzi. Aggiungere 12 millilitri di mezzo gradiente di densità del 25% per sospendere di nuovo i mitocondri grezzi estratti. Creare un gradiente di densità discontinuo contenente i mitocondri grezzi come delineato nel protocollo di testo e centrifugarlo a 52.000 xg e a quattro gradi Celsius per 90 minuti.Utilizzare una siringa lunga e smussata per raccogliere i mitocondri purificati nell'intervallo dall'interfaccia tra i mezzi gradienti 25 e 30% all'interfaccia tra i mezzi gradienti 34 e 38%.. Trasferire i mitocondri purificati in un tubo pulito. Aggiungere il tampone di isolamento mitocondriale ai mitocondri raccolti per diluirlo a un volume triplo.Centrifugare a 15.000 xg e a quattro gradi Celsius per 20 minuti, e scartare il supernatante. Aggiungere 2 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale per sospendere di nuovo il pellet e la centrifuga a 15.000 xg e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Scartare il supernatante e conservare il pellet.Raccogliere il pellet finale e conservarlo a 20 gradi Celsius. In questo studio, campioni mitocondriali di alta qualità sono preparati da cancro ovarico umano e tessuti di controllo per la proteomica quantitativa su larga scala. Ci sono alcune differenze nella preparazione dei mitocondri dai tessuti tumorali ovariani e controllare i tessuti ovarico, incluso l'uso di un diverso gradiente di densità discontinua.Dopo la centrifugazione, i mitocondri purificati dai tessuti tumorali ovariani si trovano nell'interfaccia tra il 25% e il 30%, mentre quelli dei tessuti ovarico di controllo si trovano nell'intervallo dall'interfaccia tra il 25% e il 30% all'interfaccia tra il 34% e il 38%La qualità dei mitocondri preparati viene quindi valutata con centrifugazione della velocità differenziale e centrifugazione del gradiente di densità tramite microscopia elettronica. Le immagini al microscopio elettronico dimostrano che sia nei tumori ovarico che nei tessuti ovaiali di controllo, i principali organelli isolati sono i mitocondri, ad eccezione di una piccola quantità di perossisomi. Tuttavia, la morfologia dei mitocondri è vista cambiare più nei tumori ovai che nel controllo del tessuto ovarico.La qualità dei mitocondri preparati viene valutata anche tramite macchia occidentale. Le immagini western blot dimostrano anche che il componente principale nei campioni mitocondriali preparati da tumori ovai e ovaie di controllo sono i mitocondri, ad eccezione di una piccola quantità di perossisomi, che è coerente con l'analisi della microscopia elettronica. È ragionevole che i perossisomi siano contenuti nei mitocondri preparati, perché i mitocondri interagiscono ampiamente con i perossisomi, che a loro volta riflettono la completezza funzionale dei mitocondri.Questi risultati dimostrano l'alta qualità dei campioni mitocondriali preparati. Quando sto eseguendo questa procedura, è molto importante che si tritano completamente i tessuti prima dell'omogeneizzazione, e si aggiungo la tripina ai tessuti di controllo tritati. È anche importante creare e o preparare gradiente di densità discontinua per i campioni di cancro e i controlli.Seguendo questa procedura, la proteomica quantitativa iTRAQ o TMT o la fosfoproteomica possono essere eseguite per chiarire il profilo del proteoma dei mitocondri del cancro ovarico e il profilo del fosfoproteoma può essere stabilito per chiarire i ruoli dei mitocondri nel cancro ovarico in grandi profondità. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per studiare sistematicamente il proteoma dei mitocondri e il fosfoproteoma nel cancro alle ovaie, costruire il sistema di rete di vie di segnalazione e scoprire i biomarcatori affidabili e gli obiettivi terapeutici.

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Questo video descrive la procedura per isolare i mitocondri dai tessuti del cancro ovarico umano utilizzando la centrifugazione a velocità differenziale in combinazione con la centrifugazione a gradiente di densità. I mitocondri isolati possono essere utilizzati per l'analisi proteomica del proteoma mitocondriale del cancro ovarico umano.

Isolamento mitocondriale: una tecnica per isolare i mitocondri da un campione di tessuto di cancro ovarico umano

Questo protocollo descrive una tecnica per la preparazione del campione mediante la co-coltura di espianti ovarici con le cellule tumorali delle tube di Falloppio. Questi campioni vengono visualizzati utilizzando la spettroscopia di massa per immagini, o IMS, per rilevare lo scambio di piccole molecole tra le cellule e i tessuti che porta allo sviluppo del tumore.

Modellazione della comunicazione del cancro ovarico per l'analisi della spettrometria di massa per immagini: un metodo per identificare i comunicatori chimici di piccole molecole nello sviluppo di tumori ovarici metastatici

Questo studio descrive un metodo dettagliato per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule tumorali ovariche primarie da campioni clinici solidi. Cancro ovarico campioni clinici sono sottoposti a digestione enzimatica per ottenere praticabile, privo di fibroblasti cancro ovarico epiteliale (EOC), le cellule particolarmente adatto per applicazioni a valle.

Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

La colorazione immunoistochimica e il sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S (gene rRNA 16S) sono stati eseguiti al fine di scoprire e distinguere i batteri nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi in situ. Le differenze compositiva e funzionale dei batteri sono state previste utilizzando BugBase e Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

Caratterizzazione e predizione funzionale dei batteri nei tessuti ovarici

Abbiamo sviluppato un protocollo pratico e un approccio analitico per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la capacità di trasferimento di elettroni negli omogeneizzati tumorali freschi. Questo protocollo può essere facilmente adattato per esaminare varie funzioni mitocondriali che contribuiscono all'inizio, alla progressione e alla risposta al trattamento del cancro.

Determinazione analitica della funzione mitocondriale degli omogeneizzati tumorali solidi asportati

Presentiamo un protocollo in due fasi per l'isolamento dei mitocondri di alta qualità che è compatibile con la scoperta e la quantificazione delle proteine su scala proteoma. Il nostro protocollo non richiede ingegneria genetica ed è quindi adatto per studiare i mitocondri da qualsiasi cellula e tessuto primario.

Isolamento dei mitocondri senza tag in due fasi per migliorare la scoperta e la quantificazione delle proteine

Questo protocollo descrive la creazione di un modello tridimensionale (3D) ex vivo dell'interazione cellula tumorale-omento. Il modello fornisce una piattaforma per chiarire i meccanismi pro-tumorali all'interno della nicchia adiposa e per testare nuove terapie.

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Questo protocollo descrive una tecnica per l'analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.

Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari 

Questo protocollo ha preparato con successo tessuto neovascolare di alta qualità sufficiente da campioni di glioma utilizzando microdissezione a cattura laser per l'analisi proteomica quantitativa dell'angiogenesi tumorale, superando i limiti degli studi che tradizionalmente si concentrano principalmente sui fattori angiogeni e fornendo un profilo proteomico su larga scala dell'angiogenesi del glioma.

Preparazione di tessuti neovascolari da tessuti gliomatici umani per l'analisi proteomica quantitativa dell'angiogenesi tumorale

Scopri come isolare e purificare i mitocondri da tessuti di cancro ovarico e controlli mediante centrifugazione differenziale e a gradiente di densità. Questo metodo consente analisi proteomiche quantitative di alta qualità per identificare biomarcatori e bersagli terapeutici nel cancro ovarico.

Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e dai tessuti ovarici di controllo per lanalisi quantitativa proteomica (Video) | JoVE Journal

Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e dai tessuti ovarici di controllo per l'analisi quantitativa proteomica

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