Name: Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Impara a isolare e coltivare neuroni motori oculomotori, trocleare e spinali da embrioni di topo Isl1mn:GFP. Questo protocollo consente studi comparativi sulla vulnerabilità selettiva nelle malattie dei motoneuroni come la SLA.

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Ringraziamo Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) per l'istruzione nelle tecniche di dissezione SMN; il Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, il Centro di Citometry di flusso della divisione immunologia della Harvard Medical School, il Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core e il Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility per l'isolamento FACS dei motovini primari; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, membri del laboratorio Engle aggiuntivi e membri del consorzio Project ALS per assistenza tecnica e discussione ponderata. Questo studio è stato sostenuto dal Progetto SLA. Inoltre, R.F. è stato finanziato dalla Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad e dalla NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. è stato supportato dal programma di formazione NIH/NEI nelle basi molecolari delle malattie oculari (5T32EY007145-16) attraverso lo Schepens Eye Research Institute e lo Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) attraverso il Boston Children's Hospital; M.C.W è stato supportato da NEI (5K08EY027850) e Children's Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); e E.C.E. è un investigatore dell'Howard Hughes Medical Institute.

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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Storicamente, gli studi in vitro dei motoneuroni CN3 e/o CN4 si sono affidati a culture eterogenee come dissociate17,18,19,20,21, espiantare17,22,23,24,25,26e tagl...

La coltura dei motoneuroni primari è un potente strumento che consente lo studio dello sviluppo neuronale, funzione, e suscettibilità a fattori di stress esogeni. Le colture di motoneuroni sono particolarmente utili per lo studio di malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)1,2, i cui meccanismi di malattia sono incompleti. È interessante notare che, nonostante la significativa morte cellulare dei motoneuroni spinali (SMN) sia nei pazienti affetti da SLA che nei topi modello di SLA, la morte cellulare nei neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) sono relativamente scarsi1,3,4,5,6,7,8,9. Pertanto, analisi comparative delle colture pure di CN3/CN4 e SM potrebbero fornire importanti indizi sui meccanismi alla base della vulnerabilità relativa. Sfortunatamente, un ostacolo importante a tali analisi è stata l'incapacità di coltivare colture purificate di questi motoneuroni.
Molti protocolli sono stati descritti per la purificazione delle sinistenzioni da modelli animali. La maggior parte di questi protocolli utilizza tecniche di panning di smistamento delle cellule basate su media di densità10,11,12 e/o p75NTR-anticorpi -anticorpi- base alle tecniche di panning13,14,15,16. La centrifugazione del gradiente di densità sfrutta le dimensioni maggiori delle snn rispetto ad altre cellule spinali, mentre p75NTR è una proteina extracellulare espressa esclusivamente dalle sren nel midollo spinale. Quasi 100% culture SMN pure sono state generate da uno o entrambi questi protocolli11,12,14. Tuttavia, questi protocolli non sono riusciti a generare impostazioni cultura CN3/CN4 perché i CN3/CN4 non esprimono p75NTRe non sono stati identificati altri marcatori CN3/CN4 specifici. Sono anche più piccole delle smin e, pertanto, più difficili da isolare in base alle dimensioni. Invece, studi in vitro di CN3 o CN4 si sono affidati a dissociati17,18 ,19,20,21, espianto17,22,23,24,25,26, e fetta27,28 culture, che sono composti da tipi di cellule eterogenee, e nessun protocollo sono esistiti per il isolamento e cultura dei CN3 primari o CN4.
In questo caso, viene descritto un protocollo per la visualizzazione, l'isolamento, la purificazione e la coltivazione di CN3, CN4 e SMN dello stesso giorno embrionale 11.5 (E11.5) IslMN:GFP topi transgenici29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etichetta specificamente i motoneuroni con un GFP farnesillato che si localizza nella membrana cellulare. Questo protocollo consente il confronto di diversi tipi di motoneuroni per chiarire i meccanismi patologici nella malattia dei motoneuroni.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488-capra coniugata anti-topo IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-coniugato F(ab')2 capra anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11072</td><td>1:400</td></tr><tr><td>B27 Integratore (50x), senza siero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>- </td><td>Questo ha 4 sistemi laser dotati di laser da 405, 488, 594 e 640 nm.</td></tr><tr><td>BD Falcon 70&mu; m Filtri cellulari in nylon</td><td>CORNING</td><td>352350</td><td>Per filtrare le cellule dissocianti prima del FACS.</td></tr><tr><td>Provette a fondo tondo BD Falcon con tappo a scatto</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-207</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra per colture cellulari, 96 pozzetti, PS, fondo F (pozzetto camino)</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>655090</td><td>Abbiamo provato più piastre da 96 pozzetti e questa è stata la migliore per la coltura e le analisi dopo ICC</td></tr><tr><td>Occhiali di copertura circolari per microscopia</td><td>Karl Hecht & Assistent</td><td>1001/14</td><td>Abbiamo utilizzato questo vetrino coprioggetti poiché l'area era ampia (diametro: 14 mm).</td></tr><tr><td>CNTF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-272</td><td></td></tr><tr><td>Acido ciclopiazonico da Penicillium cyclopium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1530</td><td>CPA. Uno dei fattori di stress del pronto soccorso.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenilinodele (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze Inox Dimensioni della punta 0,05 mm x 0,01 mm Punte Biologie</td><td>Strumento chirurgico Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25205</td><td></td></tr><tr><td>GDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-305</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX integratore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Ibernazione E</td><td>BrainBits</td><td>HE</td><td></td></tr><tr><td>Ibernazione E a bassa fluorescenza</td><td>BrainBits</td><td>HELF</td><td>La fluorescenza che ostacola l'osservazione dell'espressione GFP dell'embrione deve essere bassa.</td></tr><tr><td>Siero di cavallo, inattivato a caldo, origine neozelandese</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Tocris Cookson</td><td>2845</td><td>Isobutilmetilxantina</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L15 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro dissezione</td><td>Strumento chirurgico Roboz</td><td>RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Micro coltello 4,75" lama da 1,7 mm x 27 mm</td><td>Strumento chirurgico Roboz</td><td>RS-6272</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini cucchiaio perforato</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo contro la classe neuronale III &beta;-tubulina (TUBB3)</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>1:500, TUJ1</td></tr><tr><td>Nikon Perfect Focus Eclipse Ti microscopio a fluorescenza per cellule vive e software Elements</td> Le <td></td><td>immagini di contrasto per interferenza differenziale Nikon e le immagini immunocitochimiche delle colture cellulari sono state catturate con queste apparecchiature</td><td></td></tr> <tr><td>Acido nitrico 90%, Fuming (ACS certificato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A202-212</td><td>Per il risciacquo dei vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td>Queste sono le provette che abbiamo descritto come "provette per microcentrifuga da 1.7 mL" nel contesto.</td></tr><tr>Da questo kit vengono preparati il <td>sistema di dissociazione della papaina</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LK003150</td><td>la soluzione di papaina e la soluzione di inibitore dell'alubumina-ovomucoide.</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly D-lysin (PDL)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di coniglio contro Islet1</td><td>Abcam</td><td>ab109517</td><td>1:200</td></tr><tr><td>SMZ18 e SMZ1500 stereomicroscopi zoom con DS-Ri1 è stata eseguita la dissezione con telecamera</td><td>Nikon</td><td></td> <td>e le immagini di embrioni e tessuti sezionati vengono catturate con questi microscopi a fluorescenza.</td></tr><tr><td>Sylgard 170 Incapsulante in silicone nero - Kit A+B da 0,9 kg</td><td>Dow Corning</td><td>1696157</td><td>Produciamo piatti di dissezione utilizzando questo kit.</td></tr><tr><td>Piastre trattate TC, 100 mm x 20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td>Realizziamo piastre di dissezione utilizzando questa piastra.</td></tr><tr><td>Pinze per medicazione Thum 4,5" seghettate Larghezza punta 2,2 mm</td><td>Strumento chirurgico Roboz</td> Trasduttore <td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>per LOGOQ e VET</td><td>GE Healthcare</td><td>L8-18i-RS</td><td>Per ultrasuoni su topi femmina</td></tr><tr><td>Ecografo veterinario</td><td>GE Healthcare</td><td>LOGOQ e VET</td><td>Per ultrasuoni su topi femmina</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser Zeiss serie LSM 700 e Zen Software</td><td>Carl Zeiss</td><td>-</td><td>L'immagine confocale dell'embrione è stata catturata con queste apparecchiature</td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura di oculomotor, trochlear, e motoneuroni spinali da prenatal islmn:gfp topi transgenici

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

I neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) mostrano una notevole resistenza alle malattie dei motoneuroni degenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) rispetto ai motoneuroni spinali (SMN). La capacità di isolare e coltura mouse primario CN3s, CN4s, e SMN fornirebbe un approccio allo studio dei meccanismi alla base di questa vulnerabilità selettiva. Ad oggi, la maggior parte dei protocolli utilizza colture cellulari eterogenee, che possono confondere l'interpretazione dei risultati sperimentali. Per ridurre al minimo i problemi associati alle popolazioni di cellule miste, le colture pure sono indispensabili. Qui, il primo protocollo descrive in dettaglio come purificare e coltivare in modo efficiente i CN3/CN4 insieme alle controparti SMN dagli stessi embrionali usando embrioni del giorno 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embrionali di topo transgenici. Il protocollo fornisce dettagli sulla dissezione e dissociazione dei tessuti, l'isolamento cellulare basato su FACS e la coltivazione in vitro di cellule dai nuclei CN3/CN4 e SMN. Questo protocollo aggiunge un nuovo sistema di coltura in vitro CN3/CN4 ai protocolli esistenti e fornisce contemporaneamente una cultura SMN pura e abbinata all'età per il confronto. Le analisi incentrate sulle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni sono realizzabili in questo sistema di coltura. Questo protocollo consentirà la ricerca sui meccanismi che definiscono lo sviluppo del motoneurone, la vulnerabilità selettiva e la malattia.

L'obiettivo di questo protocollo era quello di purificare e coltura sia i CN3/CN4 primari a lungo termine che le SMN a lungo termine per consentire analisi comparative dei meccanismi alla base dei disturbi del motoneurone (vedere Figura 1 e Figura 2 per una panoramica).
Una volta che i neuroni sono stati isolati con successo e cresciuti in coltura, quasi puro primario C...

Questo lavoro presenta un protocollo per produrre colture cellulari omogenee dei motoneuroni primari oculomotori, trocleari e spinali. Queste colture possono essere utilizzate per analisi comparative delle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni oculari e spinali.

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Questo è il primo protocollo per purificare e coltura simultaneamente ed efficientemente i motoneuroni oculari e spinali primari dai topi embrionali. Consente lo studio dei meccanismi alla base della malattia dei motoneuroni. Questo protocollo aggiunge un nuovo componente di coltura oculomotoria in vitro ai sistemi esistenti e fornisce colture di motoneuroni spinali pure e di età abbinate all'età per il confronto.Nella sclerosi laterale amiotrofica, i motoneuroni spinali degenerano mentre i neuroni oculomotori sono relativamente risparmiati. Il confronto di queste culture potrebbe fornire informazioni sul meccanismo e sulla terapia delle malattie. Questo metodo faciliterà gli studi sui meccanismi alla base dello sviluppo dei motoneuroni, delle malattie e della vulnerabilità selettiva.Il nostro sistema di coltura consente la caratterizzazione della morfologia dei motoneuroni, della biologia molecolare e dell'elettrofisiologia. Per coloro che sono nuovi a questa tecnica, consigliamo molta pratica. La dissezione può essere tecnicamente impegnativa e possono essere necessari più dissettori per ottenere neuroni sufficienti per la coltura primaria.Inizia raccogliendo embrioni positivi isolotto1 FEG da un topo incinta circa 11,5 giorni dopo la fecondazione. Spruzzare accuratamente l'addome con etanolo e rimuovere l'utero con forbici sterili a microdisezione e forcette per medicazione del pollice. Lavare brevemente l'utero in PBS sterile.Quindi trasferirlo nella piastra di dissezione riempita con PBS sterile pre-refrigerato. Sotto la luce intensa del microscopio, rimuovere con cura gli embrioni dall'utero usando forbici a microdissezione, pinze per medicazione del pollice e pinzette Dumont 5. Quindi utilizzare un mini cucchiaio forato Moria sterile per trasferire ogni embrione in un pozzo separato di una piastra da 24 po 'piena di mezzo di ibernazione pre-refrigerato E a bassa fluorescenza integrato con 1X V27.Mantenendo la piastra sul ghiaccio, trasferire un embrione su una piastra di dissezione sterile e coprirlo completamente con la soluzione salina bilanciata o l'HBSS sterile di Hank. Utilizzare una pinzetta per rimuovere la faccia dell'embrione e la coda senza danneggiare il cervello medio. Quindi posizionare l'embrione incline con gli arti a cavallo e la coda rivolta verso la parte anteriore del microscopio.Utilizzare le pinzette per aprire il tetto del quarto ventricolo per generare una piccola apertura. Utilizzare questa apertura per agganciare le pinzette nello spazio creato tra il quarto ventricolo e il suo tetto. Sezionare lungo la superficie dorsale dell'embrione rostrale fino alla corteccia e laterale alla piastra del pavimento e alla colonna motoria.Quindi aprire il tessuto sezionato in modo aperto per rivelare i nuclei positivi GFP CN3 e CN4. Separare accuratamente il midbrain ventrale dall'embrione e rimuovere il tessuto meningeo con una pinzetta e un coltello a microdisezione. Sezionare i nuclei bilaterali GFP positivi CN3 e CN4 lontano dalla piastra del pavimento e da altri tessuti circostanti positivi alla GFP, facendo attenzione a evitare di toccare o danneggiare i neuroni.Se si raccolgono nuclei CN3 e CN4 separati, tagliare lungo il midbrain di questi due nuclei e utilizzare una pipetta P1000 per raccogliere il tessuto ventrale del cervello sezionato con HBSS minimo. Posizionarlo in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri etichettato riempito con mezzo di dissezione e conservare il tubo sul ghiaccio fino alla dissociazione. Continuare a estrarre le midbraine ventrali da embrioni aggiuntivi nello stesso tubo fino a quando il numero totale non soddisfa i requisiti sperimentali.Per sezionare il midollo spinale ventrale, mantenere l'embrione incline con la testa rivolta verso la parte anteriore del microscopio. Tienilo con un paio di pinzette e inserisci la punta dell'altra coppia nella parte caudale non aperta del quarto ventricolo. Aprire dorsalmente il resto del cervello posteriore e del midollo spinale su tutta l'estensione rostrocaudale dell'embrione.Tagliare il tessuto dorsale partendo dal quarto ventricolo e lavorando verso il canale centrale del midollo spinale caudale usando le forcep come forbici. Quindi tenere l'embrione con una serie di pinzette e pizzicare il lembo del tessuto dorsale su ciascun lato con l'altra coppia. Rimuovere il midollo spinale ventrale utilizzando il coltello a microdisezione per perforare direttamente sotto la SMN positiva della GFP sollevando il midollo spinale ventrale con movimenti simili a seghe su entrambi i lati.Tagliare il midollo spinale trasversalmente al limite superiore dell'arto inferiore e rimuovere la porzione lombare cervicale. Tagliare trasversalmente direttamente sopra C1 dove si proietta il primo corno anteriore positivo GFP. Posizionare il lato dorsale del midollo spinale ventrale verso l'alto e tenerlo premendo il tessuto negativo GFP tra le colonne SMN positive del GFP con un paio di pinzette.Rimuovere il mesenchima, i DRG e il midollo spinale dorsale rimanenti tagliando entrambi i lati della colonna SMN positiva GFP con il coltello a microdisezione. Utilizzare una pipetta P1000 per raccogliere il tessuto del midollo spinale ventrale sezionato con HBSS minimo e posizionarlo in un tubo di microcentrifugo a 1,7 millilitri etichettato riempito con mezzo di dissezione. Conservalo sul ghiaccio fino alla dissociazione e continua a estrarre midollo spinale ventrale da embrioni aggiuntivi nello stesso tubo.Aggiungere il volume appropriato di soluzione di papaina a ciascuno dei tubi di microcentrifugo con i campioni di tessuto sezionati. Incubare i tubi a 37 gradi Celsius per 30 minuti agitando i tubi ogni 10 minuti con il tocco delle dita. Dopo l'incubazione, triturare delicatamente ogni sospensione otto volte con una pipetta P200 e centrifugarla a 300 volte g per cinque minuti.Rimescolare il pellet cellulare con il volume appropriato di soluzione inibitore ovomucoide di albumina pipettando delicatamente su e giù. Ripetere la centrifugazione. Quindi rimuovere con cura il supernatante con una pipetta P1000.Rimospendare le cellule nel volume appropriato del mezzo di dissezione. Filtrare le sospensioni attraverso un filtro a celle da 70 micrometri. Utilizzare quindi l'ordinamento FACS per isolare le celle positive GFP sezionate da CN3/CN4 e SMN.Diluire le sospensioni cellulari isolate con il mezzo di coltura del motoneurone pre-riscaldato a 37 gradi Celsius alle densità appropriate e aggiungere 200 microlitri della sospensione a un pozzo di una piastra a 96 pozzetti rivestita con laminina PDL. Cultura i neuroni in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% assicurandosi di rinfrescare il mezzo di coltura dei motoneuroni ogni cinque giorni. Quando i neuroni isolati con successo sono stati coltivati in coltura, le colture primarie quasi pure CN3/CN4 e SMN sono state ottenute e mantenute per 14 giorni in vitro.Le purità delle colture a due giorni in vitro sono state del 93,5% per CN3/CN4 e dell'86,7% per smn se valutate mediante immunocitochimica con il marcatore del motoneurone Islet1 e il marcatore neuronale TUJ1. Le purità si basavano fortemente sull'età degli embrioni e sulla fissazione delle soglie appropriate per i cancelli della GFP durante la FACS. La purezza dei neuroni isolati dagli embrioni E10.5 era paragonabile a quella degli embrioni E11.5.Tuttavia, la purezza è diminuita significativamente quando sono stati utilizzati embrioni E13.5. Per determinare se il CN3/CN4 primario e le SN hanno mostrato risposte differenziali agli stressanti del reticolo endoplasmatico, le cellule sono state trattate con concentrazioni variabili di acido ciclopiazonico o CPA a due giorni in vitro e fissate tre giorni dopo per l'immunocitochimica per valutare i rapporti di sopravvivenza. Il numero di neuroni vitali in ogni campione è stato conteggiato e sono stati calcolati i rapporti di sopravvivenza.Le monocolture CN3/CN4 erano significativamente più resistenti al trattamento CPA rispetto alle monocolture SMN. Seguendo questa procedura, molti metodi aggiuntivi possono essere eseguiti per esaminare i motoneuroni. Alcuni esempi includono studi di elettrofisiologia, biologia cellulare, trascrizione o accessibilità alla cromatina.

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Neuroscience

Neuroscienze

Descriviamo una piccola molecola a base di protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questo protocollo genera Olig2 + NG2 + OPC ad alta efficienza da 30 giorni di differenziazione. Abbiamo anche descrivere un metodo per generare "chiodare" OPC che può sparare potenziali d'azione.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Un modo alternativo di isolare motoneuroni embrionali di topo dal midollo spinale è descritto. Il metodo tiene conto del fatto che lectine possono legarsi a bassa affinità dei recettori nervosi p75NTR fattore di crescita. Questo lectina-based preplating permette una purificazione simile a quella con un anticorpo specifico contro il p75NTR.

Lectina a base di isolamento e la coltura del mouse motoneuroni embrionali

Il video dimostra l'isolamento di motoneuroni oculomotori, trocleari e spinali da un embrione di topo transgenico. L'embrione esprime motoneuroni marcati con una proteina fluorescente verde (GFP) per una facile visualizzazione e identificazione. I motoneuroni vengono isolati chirurgicamente al microscopio a fluorescenza e mantenuti in un terreno di coltura.

Isolamento e coltura di motoneuroni oculomotori, trocleari e spinali da un embrione di topo

Questo video dimostra la coltura ex vivo e l'imaging di fette oculomotorie da embrioni di topo transgenico. Gli embrioni vengono isolati e immersi nell'agarosio. Utilizzando un vibratomo si ottengono fette contenenti i nuclei oculomotori e gli occhi. Le fette vengono mantenute in coltura e visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Coltura ex vivo e imaging di fette oculomotorie da embrioni di topo transgenico

Il video dimostra il processo di isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici dal mesencefalo di embrioni di topo. I pavimenti ventrali isolati del mesencefalo vengono dissociati utilizzando enzimi. I neuroni dopaminergici risultanti vengono raccolti e trasferiti in micro-isole all'interno di piastre multi-pozzetto. Le cellule vengono incubate con un mezzo neuronale dopaminergico per mantenere le cellule ad alta densità all'interno delle micro-isole.

Isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici del mesencefalo embrionale primario di topo

Le cause della degenerazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo durante il morbo di Parkinson non sono completamente comprese. I sistemi di coltura cellulare forniscono uno strumento essenziale per lo studio delle proprietà neurofisiologiche di questi neuroni. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato, che può essere utilizzato per la modellazione in vitro della neurodegenerazione.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

L'obiettivo di questa tecnica è quello di preparare una cultura altamente arricchita dei motoneuroni primari (MNs) da murino del midollo spinale. Per valutare le conseguenze delle mutazioni che causano malattie MN, descriviamo qui l'isolamento di questi isolati MNs e loro transfezione di magnetofection.

Malattia di Charcot-Marie-Tooth In Vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del Mouse

Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Un test etta ex vivo permette di immaginare l'escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 IslMN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

I gangli ciliari (CG) fanno parte del sistema nervoso parasimpatico. Le colture neuronali dei neuroni CG del pulcino hanno dimostrato di essere modelli cellulari efficaci nello studio delle interazioni nervose del nervo. Descriviamo un protocollo dettagliato per la dissezione, la dissociazione e la cultura in vitro dei neuroni CG da embrioni di pulcino.

Isolamento e cultura dei neuroni del Ganglione Ciliario

Impara a isolare e coltivare neuroni motori oculomotori, trocleare e spinali da embrioni di topo Isl1mn:GFP. Questo protocollo consente studi comparativi sulla vulnerabilità selettiva nelle malattie dei motoneuroni come la SLA.

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Isl^mn:GFP Topi Transgenici

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