Aumentare la durabilità delle colture di cellule neurali dissociate utilizzando la matrice corallina biologicamente attiva

Il significato di questo protocollo è che fornisce un nuovo modo per aumentare la durata e la crescita di neuroni, glia e cellule staminali in vitro. È applicabile anche ad altre celle. Il vantaggio principale della tecnica è l'utilizzo di una matrice fatta di scheletro di corallo.

Questa matrice nutre e protegge le cellule neuronali e favorisce la ricrescita. Essendo di supporto per le cellule neurali in vitro, lo scheletro di corallo può funzionare in modo simile come impianto rigenerativo nei siti di lesione cerebrale. Per iniziare, usa un martello per rompere lo scheletro di corallo e dividilo in frammenti da 0,5 a due centimetri.

Per sciogliere i residui organici e non, immergere i frammenti di scheletro di corallo in una soluzione di ipoclorito di sodio al 10% per 10 minuti. Quindi lavare una volta con acqua distillata doppia. Per rimuovere i residui organici rimanenti, immergere i frammenti in una soluzione di idrossido di sodio a un molare per cinque minuti, quindi lavare una volta con acqua distillata doppia.

Proseguire con la rimozione dei depositi organici immergendo i frammenti in una soluzione di perossido di idrogeno al 30% per 10 minuti, e lavare i frammenti tre volte con doppia distillazione. Rimuovere quanta più acqua distillata in eccesso possibile e lasciare asciugare i frammenti di corallo nella cappa. Quindi pulire i vetrini di copertura immergendoli in 10 millilitri di etanolo al 95% in una capsula di Petri di vetro da 100 millimetri.

Dopo 15 minuti, rimuovere l'etanolo e lavare con acqua distillata doppia tre volte, aspettando 10 minuti tra un lavaggio e l'altro. Togliere l'acqua distillata doppia e posizionare il piatto su una piastra riscaldante preriscaldata a 80 gradi Celsius. Quindi mescolare delicatamente i vetrini coprioggetto fino a quando l'acqua distillata due volte evapora.

Autoclavare i vetrini coprioggetto. Macina i frammenti di scheletro di corallo usando un mortaio e un pestello fino a completa rottura. Si ottiene una miscela di grani con dimensioni variabili da 20 a 200 micrometri.

In alternativa, macinare i frammenti di scheletro di corallo utilizzando una rettificatrice elettrica con una lunghezza della lama di sei centimetri e una larghezza da 0,5 a un centimetro, a una velocità di 1000 giri/min per 30 secondi. Per purificare i chicchi, trasferire i chicchi su un filtro elettrico a rete da 40 micron. Regolare le impostazioni del filtro elettrico su tremore a 600 ampiezze al minuto e rimbalzo a sei volte al secondo.

Quindi sterilizzare in autoclave i chicchi. In condizioni sterili, aggiungere i grani di scheletro di corallo in un PDL da 20 microgrammi per millilitro, disciolto nella soluzione di Hank per ottenere la concentrazione di cinque milligrammi o 10 milligrammi di grani per un millilitro di soluzione PDL. Versare la soluzione in fiasche e piatti alla concentrazione di circa due millilitri per 25 centimetri quadrati e incubare per una notte a quattro gradi Celsius.

I chicchi affondano e si attaccano al fondo. Il giorno successivo, lavare una volta i palloni e le stoviglie con acqua sterile a doppia distillazione. Lasciare asciugare le borracce e le stoviglie nella cappa.

Per rivestire il vetrino coprivetro, aggiungere prima i grani di scheletro di corallo all'acqua distillata due volte a una concentrazione di cinque o 10 milligrammi per millilitro. Posizionare i vetrini coprioggetto su una piastra riscaldante preriscaldata a 80 gradi Celsius. Quindi gocciolare 40 microlitri della soluzione di cereali al centro del vetrino coprioggetti e attendere 15 minuti per la completa evaporazione.

In questo modo i chicchi aderiscono al vetrino coprioggetto. Autoclavare i vetrini coprioggetto rivestiti e conservarli in condizioni sterili. Quindi, posizionare i vetrini coprioggetti sul coperchio di una piastra sterile a 24 pozzetti, aggiungere 100 microlitri di soluzione PDL da 20 microgrammi per millilitro a ciascun vetrino coprioggetti.

Utilizzare la punta per assicurarsi che il liquido copra l'intera regione della grana e il resto della superficie del vetrino coprioggetti. Copri il coperchio con il fondo del piatto e avvolgi i lati del posto con una pellicola di paraffina. Incubare per una notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, lavare una volta i vetrini coprioggetto con acqua distillata doppia e asciugarli nella cappa. Dopo aver preparato le teste dei cuccioli di ratto, tienile dalla bocca con una pinzetta grande. Taglia la pelle che copre il cranio con una piccola forbice.

Con le forbici pulite, entra sotto il cranio sul lato del cervelletto e taglia il cranio a destra e a sinistra per consentirne la rimozione. Usando piccole pinzette, stacca il cranio dal cervello. Separare il cervello dalla testa e metterlo in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente due millilitri di MEM freddo.

Sotto uno stereomicroscopio, usa due piccole pinzette per sezionare l'ippocampo. Trasferite l'ippocampo nel piatto preparato da 35 millimetri contenente MEM. Tagliate gli ippocampi a fette di circa un millimetro usando il bisturi.

Aggiungere 200 microlitri di soluzione di tripsina. Mescolare delicatamente e incubare a 37 gradi Celsius e dal 5 al 10% di anidride carbonica per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di MEM freddo alla piastra per disattivare la tripsina.

Quindi utilizzare una pipetta di vetro Pasteur con il diametro maggiore per trasferire il tessuto tripsinizzato in una provetta da 15 millilitri contenente un millilitro di terreno del primo giorno, preriscaldato a 37 gradi Celsius. Triturare il tessuto facendolo passare attraverso la pipetta di vetro di diametro maggiore da 10 a 15 volte. Quindi ripetere questo processo utilizzando la pipetta di vetro con diametro medio.

Continuare la triturazione con la pipetta di diametro più piccolo. Evitare il gorgogliamento per ridurre la morte cellulare. Lascia che i pezzi di tessuto dissociati affondino per due o cinque minuti.

Quindi trasferire il surnatante in un'altra provetta da 15 millilitri. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Per ottenere la densità cellulare preferibile tra 200.000 e 400.000 cellule per millilitro.

Utilizzare il terreno del primo giorno per diluire. Quindi, semina 100 microlitri di cellule su ogni vetrino coprivetro. Assicurati di coprire l'intero vetrino coprioggetto con le celle.

Incubare a 37 gradi Celsius e dal 5 al 10% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura neuronale ai pozzetti. Usando una pinzetta, rimuovere il terreno del primo giorno inclinando il vetrino coprioggetti e trasferendo delicatamente ogni vetrino coprioggetti nel pozzetto appropriato.

Aspirare il supporto rimanente dal coperchio. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e dal 5 al 10% di anidride carbonica. Mantenere l'incubatrice umidificata al massimo utilizzando una vaschetta d'acqua sul fondo dell'incubatrice.

Non sostituire il supporto. Le colture possono essere mantenute in queste condizioni fino a un mese. In questo studio, le rettificatrici manuali e le rettificatrici elettriche hanno entrambe prodotto risultati simili, con una miscela di grani di dimensioni comprese tra 20 e 200 micrometri.

I filtri manuali o elettrici producevano due tipi di miscele di cereali. Uno con grani di dimensioni comprese tra 40 e 200 micrometri e il secondo con dimensioni di 40 micrometri o meno. Le micrografie a contrasto di fase mostrano che la coltivazione di cellule ippocampali su vetrini coprioggetti rivestiti con grani di scheletro di corallo ha formato reti neuronali complesse in assenza e presenza della matrice.

La colorazione dei nuclei cellulari ha indicato che 14 giorni dopo la semina, la densità cellulare era più alta sulla matrice che sui vetrini coprioggetti non rivestiti. La colorazione con la proteina associata ai microtubuli due ha mostrato che sulla matrice si è formata una complessa rete neuronale e dendritica rispetto al controllo. Inoltre, le cellule gliali cresciute sulla matrice dello scheletro di corallo visualizzate utilizzando la proteina acida fibrillare gliale hanno subito significativi cambiamenti morfologici.

Hanno acquisito un aspetto più appuntito, con processi più lunghi, rispetto alle cellule gliali cresciute sul substrato di controllo, dove apparivano più rotonde e piatte. Durante l'isolamento delle cellule, è importante ricordarsi di lavorare velocemente, mantenere il pH aggiungendo CO2 se necessario e lavorare il più delicatamente possibile per evitare il distacco dei grani di corallo.