Una spettroscopia Raman integrata e una piattaforma di spettrometria di massa per studiare l'assorbimento di farmaci a singola cellula, il metabolismo e gli effetti

Questo protocollo presenta una piattaforma integrata di spettroscopia-massa spectromo (MS) in grado di raggiungere la risoluzione a cella singola. La spettroscopia raman può essere utilizzata per studiare la risposta cellulare ai farmaci, mentre la SM può essere utilizzata per l'analisi mirata e quantitativa dell'assorbimento e del metabolismo dei farmaci.

Abbiamo sviluppato un metodo innovativo per la metabolomica. Abbiamo combinato l'imaging spettrale belfry delle cellule viventi con la spettrometria di massa a una cellula. La nostra tecnica può monitorare e prevedere i cambiamenti metabolici delle singole cellule contro i farmaci.

E questo apre un sacco di applicazioni per la ricerca di base e l'industria. Il nostro metodo aggiunge una risoluzione a una singola cellula alle attuali tecniche di valutazione dei farmaci, il che aii aiierà notevolmente i futuri sforzi di scoperta di farmaci. La nostra tecnica può anche aiutarci a comprendere il ruolo svolto dall'eterogeneità cellulare nella resistenza al cancro.

Il campionamento a cella singola e l'analisi dei dati sono gli aspetti più impegnativi di questo esperimento. Attualmente stiamo lavorando per automatizzare questi due passaggi, in particolare la parte di campionamento. Si consiglia di praticare il campionamento a cella singola ben prima dell'esperimento, poiché ogni configurazione del micromanipolatore è leggermente diversa e si dovrebbe prendere il tempo necessario per familiarizzare con i controlli.

Dopo aver incubato le cellule per raggiungere il 70% di confluenza, le cellule di coltura di interesse in un apposito supporto di coltura, aggiungere Penicillina-Streptomicina per evitare la contaminazione. Dopo aver misurato la densità cellulare su un emocitometro, le cellule di sottocoltura in un piatto di griglia inferiore di vetro da 35 millimetri o scivoli al quarzo, utilizzando lo stesso mezzo a una densità di semina di 0,7 per 10 al sesto. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno successivo, le cellule raggiungono una confluenza dal 50 al 60%Lavare le celle due volte con tampone PBS pre-riscaldato a 37 gradi celsius. Dividere le cellule in sottogruppi trattati con farmaci e non trattati in piatti di coltura da 35 millimetri. Mescolare tamoxifene sciolto in solfossido di dimetile con i mezzi di coltura per ottenere un volume finale di due millilitri e concentrazione di Tamoxifene di 10 micromolare.

Questo è il gruppo trattato con farmaci. Mescolare un volume corrispondente di DMSO nel mezzo come gruppo di controllo per studiare gli effetti del DMSO. Incubare entrambi i gruppi in due millilitri del supporto chiodato per 24 ore per raggiungere una confluenza dal 70 all'80%Prima delle misurazioni spettrali, verificare la corrispondenza del foro stenopeica e della posizione laser utilizzando un bersaglio.

Per calibrare lo spettrofotometro prima di ogni esperimento, posizionare l'etanolo in un piatto inferiore di vetro, misurare lo spettro a una data intensità laser per un secondo e associare il picco alle lunghezze d'onda note. Quindi impostare la microcamera al 5% di anidride carbonica e 37 gradi celsius. Una volta che il sistema di microscopio è pronto, rimuovere le cellule dall'incubatrice e risciacquare immediatamente le cellule due volte con tampone PBS riscaldato a 37 gradi celsius.

Quindi aggiungere due millilitri di PBS riscaldato o FluoroBrite DMEM. Aggiungere 10 microlitri d'acqua sulla lente obiettivo di immersione dell'acqua. E posizionare delicatamente il piatto della cella inferiore in vetro sul palco del microscopio.

Fissare il sistema di campionamento cellulare al microscopio Raman. Collegare il micromanipolatore 3D al supporto capillare in vetro collegato a una siringa vuota per l'aspirare il campione. Impostare il microscopio su un campo di ingrandimento elevato di 40 volte per osservare la punta del capillare di vetro e assicurarsi che non sia rotto.

Controllare la posizione del capillare di vetro utilizzando il micromanipolatore. Assicurarsi che la punta capillare sia centrata nel campo visivo. Quindi spostare il capillare verso l'alto sull'asse Z per dare spazio per il piatto di coltura in un secondo momento.

Posizionare il piatto campione sullo stage del microscopio, regolare l'ingrandimento e lo stato attivo, selezionare la cella di destinazione sulla piastra della griglia e spostarla al centro della vista. Misurare ogni cella concentrando la linea laser. Un tempo di esposizione di 15 secondi per cella è sufficiente per ottenere una sezione trasversale di una cella con un segnale Raman chiaro.

Uno specchio galvanico consente la scansione di una cella o di un gruppo di celle entro diverse decine di minuti. Quindi abbassare con cura il capillare di vetro utilizzando il micromanipolatore fino a quando la punta non entra a fuoco. Sotto osservazione microscopica, toccare la singola cellula bersaglio con la punta capillare.

Quindi iniziare ad applicare pressione negativa usando la siringa per intrappolare la cellula all'interno della punta capillare. Registra questa procedura scattando un video per controllare con precisione i tempi e la posizione risucchiata della cella. Spostare il capillare verso l'alto sull'asse Z.

Quindi staccare il capillare dal supporto capillare utilizzando le forcelle in preparazione per l'analisi della spettrometria di massa. Dopo aver istituito lo strumento di spettrometria di massa e aver analizzato il supporto, aggiungere due microlitri del solvente di ionizzazione al capillare contenente la cellula. Fissare il capillare a un adattatore nano-elettrospray collegato a un adeguato spettrometro di massa e avviare il metodo di acquisizione automatica.

Qui viene mostrata un'analisi comparativa dello spettro medio di ciascuna condizione, con e senza trattamento farmacologico. Lo spettro medio delle due condizioni differisce chiaramente a vari picchi. In particolare, i picchi a 1.000 per centimetro, che è un segno di composti aromatici come fenilalanina e tirosina, mostrano forti differenze.

Sulla base della proiezione sul modello di struttura latente, sono stati calcolati i punteggi VIP che rappresentano l'importanza delle lunghezze d'onda nel discriminare le condizioni sperimentali. È importante sottolineare che le vette più alte dei profili VIP corrispondevano ai picchi di Raman per i quali sono state osservate forti differenze tra i due trattamenti. Ciò ha confermato le specifiche differenze molecolari tra cellule trattate e non trattate.

Dopo un'identificazione positiva, l'abbondanza relativa del farmaco e dei suoi metaboliti è stata misurata in ogni cellula e confrontata con i picchi di fondo nelle cellule non trattate. Forti variazioni sono state osservate nell'abbondanza di Tamoxifene. E questo fenomeno era ancora più pronunciato nel caso del suo metabolita 4-idrossi-tamoxifene.

I ricercatori possono essere interessati ad esplorare il legame tra le immagini spettrali e i profili metabolici delle cellule. La nostra ricerca ha anche applicazioni industriali perché consente lo screening locale delle cellule per la produzione farmaceutica. Prestare attenzione durante la preparazione del solvente di ionizzazione per le misurazioni dello spettrometro di massa.

Dovrebbe essere preparato sotto una cappa aspirante. Inoltre, fare attenzione a non toccare la sorgente ioniche dello strumento spettrometro di massa per evitare di essere folgorato. Infine, i capillari di campionamento utilizzati durante la misurazione sono molto affilati, quindi maneggiarli con cura per evitare lesioni.