Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate
31 ottobre 2019
Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.
I cianobatteri sono un importante phylum di microbi fotosintetici che sono sempre più riconosciuti come piattaforme utili per la biologia sintetica e le applicazioni biotecnologiche rinnovabili. Quindi è importante sviluppare tecniche robuste per semplificare la progettazione, la clonazione e l'introduzione del DNA eterologo in diverse specie cianobatteriche. Quindi questa tecnica dimostra un metodo ben consolidato chiamato coniugazione o accoppiamento triparentale per introdurre il DNA nelle specie cianobatteriche che non sono naturalmente trasformabili.
La coniugazione è stata eseguita con successo in una vasta gamma di ceppi cianobatterici da singole cellule a specie filamentose multicellulari. Se sta tentando questa tecnica per la prima volta, si prega di fare attenzione a gestire con cura sia i ceppi cianobatterici che i ceppi E.coli. Ad esempio, non centrifugare al di sopra dei valori indicati nel protocollo e non vortice.
Mescolare batteri e cianobatteri può sembrare strano agli utenti per la prima volta. Speriamo che, dimostrando il processo di coniugazione, contribuiremo a chiarire questo punto. Dopo la costruzione di assiemi di primo livello, scegliete un vettore accettore T di livello appropriato.
Scegliete un collegamento finale appropriato per legare le tre estremità principali dell'assieme di livello uno finale alla dorsale di livello T. Per assemblare uno o più assiemi di primo livello nel livello T, preparate una combinazione di reazioni con PBI1 e il vettore di collegamento finale richiesto. Impostare il programma di ciclore termico e procedere secondo il manoscritto.
Il primo giorno, coltiva la coltura cianobatterica impostando una nuova coltura di Synechocystis PCC 6803 o Synechococcus elongatus UTEX 2973. Con un anello sterile termico, raschiare le cellule dalla piastra agar BG-11 assenica e posizionare in un pallone conico da 100 millilitri riempito con 50 millilitri di mezzo BG-11 fresco per inoculare. Posizionare il pallone in un incubatore di scuotimento con illuminazione per far crescere le colture cellulari Synechocystis PCC 6803 a 30 gradi Celsius a 100 giri/min.
Per Synechococcus elongatus UTEX 2973, far crescere le colture cellulari a 40 gradi Celsius a 100 giri/min. Dopo uno o due giorni, disegnare un millilitro della coltura cellulare e misurare su uno spettrofotometro. L'assorbanza a OD 750 raggiunge da 0,5 a 1,5.
Il secondo giorno, inoculare un ceppo di supporto MC1061 E.coli contenente vettori PRK24 e PRL528 in cinque millilitri di mezzo LB con ampicillina ad una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro e cloramfenicolo ad una concentrazione di 25 microgrammi per millilitro. Crescere a 37 gradi Celsius durante la notte a 225 giri/min in un'incubatrice tremante. Quindi inoculare cinque millilitri di mezzo LB contenenti antibiotici appropriati con la coltura E.coli che trasporta il vettore di carico di livello T.
Fai crescere la cultura a 37 gradi Celsius durante la notte a 225 giri/min in un'incubatrice tremante. Il terzo giorno, centrifuga l'aiutante e il carico E.coli colture notturne a 3.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
Lavare i pellet aggiungendo cinque millilitri di mezzo LB fresco senza antibiotici. Rimescolare il pellet tubazionando delicatamente su e giù e centrifugando per rimuovere il supernatante. Ripetere questa fase di lavaggio tre volte per rimuovere gli antibiotici residui dalla coltura notturna.
Dopo l'ultimo lavaggio, resuspend il pellet cellulare a metà del volume di LB medio del volume di coltura iniziale. Quindi unire 450 microlitri della tensione di aiuto con 450 microlitri della tensione di carico in un tubo da due millilitri e lasciare a temperatura ambiente. Successivamente, preparare la coltura cianobatterica centrifugando un millilitro di coltura cianobatterica a 1.500 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi scartare attentamente il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Lavare il pellet quattro volte aggiungendo un mezzo BG-11 fresco dello stesso volume iniziale. Aggiungere 900 microlitri della coltura cianobatterica lavata a 900 microlitri dei ceppi combinati di E.coli in un tubo a due millilitri.
Mescolare le colture tubazionando delicatamente su e giù. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti per Synechocystis PCC 6803 o due ore per Synechococcus elongatus UTEX 2973. Centrifugare la miscela a 1.500 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere 1,6 millilitri del supernatante e rimescolare il pellet nel supernatante rimanente. Posizionare un filtro a membrana da 0,45 micron su una piastra di agar LB BG-11 senza antibiotici. Stendere con cura 200 microlitri della coltura E.coli/cianobatterica mescolare sulla membrana con uno spargitore sterile o una punta piegata sterile.
Sigillare la piastra con pellicola di paraffina e posizionare la piastra in un'incubatrice illuminata per 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire con cura la membrana utilizzando forcep sterilizzati a fiamma su una piastra di agar BG-11 fresca contenente antibiotici appropriati da selezionare per il vettore di carico. Sigillare il piatto con pellicola di paraffina e incubare nelle stesse condizioni di prima fino a quando non compaiono le colonie.
Le colonie appaiono tipicamente dopo 7-14 giorni per Synechocystis PCC 6803 e 3-7 giorni per Synechococcus elongatus UTEX 2973. Per selezionare i coniugati, utilizzando un'asta inoculatante sterile termica, selezionare almeno due singole colonie dalla membrana e striature su una nuova piastra di agar BG-11 contenente antibiotici appropriati. Quindi inoculare una striscia di coltura cianobatterica in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente cinque millilitri di mezzo LB e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte a 225 giri/min in un'incubatrice tremante.
La cultura chiara conferma l'assenza di contaminazione da E.coli. Dopo un periodo di crescita sufficiente di sette giorni, raccogliere singole colonie assessee per creare colture liquide per lo stoccaggio del crio a lungo termine o la successiva sperimentazione. In questo studio è stato dimostrato il flusso di lavoro di assemblaggio del Golden Gate.
In seguito alla trasformazione della reazione di assieme, sono stati identificati assembly di successo utilizzando lo screening bianco blu standard delle colonie E.coli. La cassetta di espressione eYFP nel vettore di primo livello e il collegamento finale un vettore sono stati quindi assemblati in un vettore accettore di livello T per dare il vettore cpcBA-eYFP. Il vettore cpcBA-eYFP assemblato è stato verificato per digestione delle restrizioni.
Il successo del trasferimento coniugale di cpcBA-eYFP o del vettore pPMQAK1-T ha portato alla crescita fino a diverse centinaia di colonie sulla membrana per Synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus UTEX 2973. Come previsto per il forte promotore Pcpc560, i valori per la fluorescenza eYFP normalizzata dal lettore di piastre e la fluorescenza eYFP per cella dal citometro di flusso erano elevati rispetto al controllo negativo. Sia con il lettore di lastre che con il citometro di flusso, i valori di fluorescenza erano più alti in Synechococcus elongatus UTEX 2973 che in Synechocystis PCC 6803.
Assicurarsi di incubare per il tempo minimo in base al ceppo che si sta coniugando.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per l'assemblaggio di un vettore autoriplicante mediante il kit modulare di clonaggio CyanoGate e la sua introduzione in ospiti cianobatterici attraverso coniugazione. Si sottolinea l'importanza di queste tecniche per semplificare la progettazione e il clonaggio di DNA eterologo nei cianobatteri, organismi preziosi per applicazioni di biologia sintetica.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia sintetica
- Biotecnologia
- Ingegneria genetica dei cianobatteri
Sfondo
- I cianobatteri sono microrganismi fotosintetici di grande importanza utilizzati nella biotecnologia rinnovabile.
- La coniugazione è un metodo per introdurre DNA in cianobatteri che non sono naturalmente trasformabili.
- Sono necessarie tecniche solide per il clonaggio del DNA in diverse specie di cianobatteri.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio di vettori autoriplicanti utilizzando il kit CyanoGate.
- Coniugazione per introdurre il DNA nei cianobatteri.
- Caratterizzazione mediante lettori di piastre e citometria a flusso.
Risultati principali
- Costruzione e verifica riuscita del vettore cpcBA-eYFP.
- Dimostrazione di una coniugazione riuscita in Synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus UTEX 2973.
- Messa a punto di tecniche per la selezione di cianobatteri transgenici.
Conclusioni
- Lo studio illustra un metodo affidabile per la manipolazione genetica dei cianobatteri.
- Evidenzia i progressi compiuti negli strumenti per la biologia sintetica e le applicazioni rinnovabili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Flussi di lavoro standardizzati per la clonazione modulare e la coniugazione, come quelli resi possibili dal kit CyanoGate, sono fondamentali per accelerare l'ingegneria genetica nei cianobatteri. Queste capacità semplificano la costruzione e il trasferimento di vettori di espressione, favorendo test rapidi delle ipotesi e la validazione funzionale all'interno di processi biotecnologici rinnovabili. Questo approccio migliora la prevedibilità e la scalabilità nella scoperta iniziale e nello sviluppo di ceppi piattaforma.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un assemblaggio e un test rapidi di costrutti genetici per l'analisi dei percorsi metabolici.
- Consente la validazione funzionale di promotori e parti genetiche in ospiti cianobatterici pertinenti.
- Supporta la riduzione del rischio biologico permettendo la misurazione diretta dei livelli di espressione.
- Migliora l'affidabilità predittiva nella selezione degli obiettivi nei sistemi microbici fotosintetici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara ceppi di cianobatteri geneticamente definiti per flussi di lavoro di screening successivi.
- Standardizza l'assemblaggio e il trasferimento del vettore, garantendo la riproducibilità tra esperimenti.
- Consente letture quantitative mediante marcatori fluorescenti utilizzando lettori di piastre e citometria a flusso.
- Supporta piattaforme saggistiche scalabili e riutilizzabili per applicazioni di biologia sintetica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i sistemi di cianobatteri ingegnerizzati ai processi industriali di sviluppo di ceppi.
- Garantisce continuità dalla validazione delle parti genetiche all'ottimizzazione dei ceppi preclinici.
- Riduce il rischio nel portare avanti ceppi ingegnerizzati verso applicazioni di bioproduzione.
- Permette il confronto di costrutti genetici in diverse specie di cianobatteri.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro modulare di clonazione e coniugazione CyanoGate integra la fase iniziale della scoperta e l'ingegnerizzazione di ceppi, consentendo un passaggio senza soluzione di continuità dalla progettazione del costrutto alla validazione funzionale nei cianobatteri.
- Biologia della scoperta: Supporta test basati su ipotesi per elementi genetici e sequenze regolatorie.
- Screening: Fornisce output quantitativi riproducibili di fluorescenza per analisi comparative.
- Analisi: Utilizza dati di lettori di piastre e citometria a flusso per valutare le prestazioni dei costrutti.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta allo sviluppo di ceppi preclinici per la bioproduzione rinnovabile.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e modulare, adattabile a diversi ospiti cianobatterici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità nella funzione delle parti genetiche.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità, la standardizzazione e la scalabilità dei flussi di lavoro ingegneristici.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e un'allocazione efficiente delle risorse nello sviluppo della piattaforma.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta in base al rischio dei ceppi ingegnerizzati per ulteriori sviluppi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel clonaggio molecolare, nella coltivazione di cianobatteri e nelle tecniche di coniugazione.
- È necessario avere accesso a termociclatori, spettrofotometri, lettori di piastre e citometri a flusso.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per un assemblaggio e un trasferimento di vettori riproducibili.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse specie di cianobatteri o contesti genetici.
- È essenziale un'accurata manipolazione per prevenire contaminazioni e garantire una coniugazione riuscita.
