Metodi culturali per determinare il limite di rilevamento e sopravvivenza nei mezzi di trasporto di Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

La difficoltà della cultura di Campylobacter ha inibito studi fondamentali come il minor numero di batteri necessari per produrre malattie. Questi campioni analitici e artificiosi combinati utilizzati qui possono risolvere questo problema. Questa tecnica consente di correlare i sintomi clinici rilevanti del paziente con un risultato positivo della coltura fecale e, per la prima volta, un numero effettivo di batteri.

Imparare quanti batteri sono correlati con la malattia fornirà la diagnostica, un obiettivo importante per il rilevamento e un metodo solido per confrontare la virulenza tra ceppi o specie di Campylobacter. La cultura di Campylobacter è semplice, ma richiede una preparazione rapida e organizzata per mantenere la vitalità quantitativa. È inoltre necessario un giudizio considerevole per identificare le colonie di Campylobacter tra la flora fecale concorrente su un piatto.

Prima di iniziare una cultura C.jejuni o C.coli, indossare guanti, un camice da laboratorio e occhiali di sicurezza e posizionare un foglio protettivo monouso all'interno di una cappa di sicurezza a flusso laminare disinfettato. Utilizzando una striscia tecnica sterile ogni stock batterico idratato o scongelato su una piastra di agar specifica campylobacter e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 48 ore in un barattolo anaerobico contenente una bustina di gas atmosfera microaerobica che genera una bustina. 24 ore dopo, coprire liberamente un pallone di brodo BHI e posizionare il pallone in un nuovo barattolo anaerobico con una bustina che produrrà un ambiente microaerobico per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius.

La mattina seguente utilizzare tre millilitri del brodo pre-ridotto e un anello inoculato per raschiare la piastra iniziale della coltura di Campylobacter. Trasferire il liquame in un tubo sterile e inoculare i restanti 97 millilitri del brodo pre-ridotto con i tre millilitri di liquami raschiati. Posizionare il brodo nel barattolo con la bustina di gas e incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 115 giri al minuto su un incubatore di scuotimento per 48-72 ore, fino a quando la coltura raggiunge una densità ottica a 600 nanometri non superiore a 4.

Per stabilire il numero di batteri in questa coltura di stock puro eseguire otto serie di diluizione 10 volte di 100 microlitri di brodo in 900 microlitri di diluizione. Utilizzando perline di placcatura sterili, stendere 100 microlitri di uno per 10 al quinto negativo al 10 alla settima diluizione negativa su piastre specifiche Campylobacter pre-ridotte e targhe etichette con la concentrazione di diluizione prima di posizionare le piastre in un secondo barattolo anaerobico con una bustina generatrice di gas per 48-72 ore a 37 gradi Celsius. Alla fine del periodo di crescita selezionare le piastre con tra le 30 e le 300 colonie per il conteggio.

Dopo il conteggio utilizzare i conteggi per determinare le unità di formazione della colonia per millilitro della coltura di brodo di brodo secondo la formula. È fondamentale che il conteggio delle colonie analitiche sia accurato in quanto ciò è alla base di tutti i passaggi utilizzando la piscina fecale a spillo. Subito dopo la placcatura per il conteggio come dimostrato, mescolare volumi uguali di brodo e pool fecale negativo Campylobacter e fare nove successive diluizioni due volte in piscina fecale negativa, aggiungendo una piastra di controllo con brodo senza Campylobacter alla piscina fecale per aiutare a identificare le colonie non Campylobacter.

Streak 10 microlitri di ogni diluizione delle feci Campylobacter su piastre agar specifiche Campylobacter pre-ridotte duplicate e incubare le piastre in barattolo anaerobico con una bustina generatrice di gas a 37 gradi Celsius per circa 48 ore. Alla fine dell'incubazione esaminare visivamente le placche striate per colonie simili a quelle delle colture pure di Campylobacter. Per confermare che le colonie sono in realtà Campylobacter selezionare più Campylobacter come colonie per la colorazione del grammo e visualizzare un'area sottilmente striata mediante microscopia leggera usando una lente ad immersione dell'olio per identificare piccoli batteri curvi, a spirale o a forma di sigaro gram-negativi.

Una piastra di controllo negativa senza Campylobacter aggiunto è importante per aiutare a identificare altre flora fecali. Si consideri l'ultima diluizione che contiene una colonia gram-negativa simile a Campylobacter visiva il limite del rilevamento della coltura. E usa la formula per calcolare le unità di formazione della colonia per millilitro della diluizione positiva in campione fecale clinico escogitato.

Per determinare la vitalità del Campylobacter immagazzinato nel mezzo di trasporto mescolare un millilitro della coltura di brodo campylobacter con un millilitro di piscina fecale negativa e preparare 10 diluizioni seriali duplicate due volte in piscina fecale negativa. Diluire ulteriormente ogni diluizione con un ulteriore rapporto uno-quattro nel mezzo Cary-Blair e conservare i 20 tubi di diluizione e un controllo negativo nel mezzo Cary-Blair in tubi a cappuccio a due o otto gradi Celsius per 96 ore. A partire dal tempo zero e ogni 24 ore successive strisciare 10 aliquote microliter di ogni diluizione su piastre di agar selettive Campylobacter e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 48 ore.

Poiché non esiste un metodo indipendente per stabilire numeri batterici accurati da campioni di pazienti, è possibile effettuare due misurazioni simultanee con un campione batterico puro. Un test viene utilizzato per il rilevamento visivo delle colonie di Campylobacter da diluizioni seriali dei batteri stock in una matrice fecale, simulando campioni clinici. L'altro test viene utilizzato analiticamente, quantificare le unità di formazione della colonia per millilitro presenti nella stessa coltura di batteri utilizzata per lo spiking.

Un parametro chiave per il successo è identificare le colonie di dimensioni millimetriche tra la flora fecale concorrente, come illustrato da questo piatto rappresentativo di cultura delle feci chiodate. Qui si possono osservare dati tipici di sette esperimenti indipendenti. La semplice identificazione di colonie che assomigliano a Campylobacter all'interno delle culture fecali non è sufficiente.

Tutte le colonie dovrebbero essere confermate con colorazione grammo o metodi più avanzati. Usiamo un immunoanalisi enzimatico che è più accurato della coltura per rilevare specie non comuni come C.upsaliensis o C.lari, che crescono male su antibiotici standard contenenti agar. Questa tecnica pone le basi necessarie per studiare cose come il trasporto non sintomatico di Campylobacter e se alti carichi batterici mettono un paziente a più alto rischio per gravi conseguenze dell'infezione da Campylobacter.

Indossare sempre DPI quando si lavora con batteri, che sono spesso infettivi e possono essere pericolosi, e con la piscina fecale negativa che può contenere agenti patogeni sconosciuti anche se raccolti da donatori sani.